Search

Puu, ruohokasvit ja näistä tehdyt tuotteet kuten mekaanisesta massasta valmistettu sanomalehtipaperi sisältävät ligniiniä, joka hajoaa yleensä hyvin hitaasti luonnossa. Valkolahosienet hajottavat ligniiniä tehokkaimmin, ja koska niiden tuottamat entsyymit hajottavat myös muita vaikeasti hajoavia yhdisteitä, voidaan valkolahosienten avulla mahdollisesti puhdistaa saastuneita maita. Tässä työssä haluttiin selvittää, säilyttävätkö valkolahosienet (Abortiporus biennis, Bjerkandera adusta, Dichomitus squalens, Phanerochaete chrysosporium, Phanerochaete sordida, Phlebia radiata, Pleurotus ostreatus, Trametes hirsuta ja Trametes versicolor) aktiivisuutensa ja kasvavatko ne maassa. Aktiivisuutta mitattiin seuraamalla sienten synteettisen ligniinin (14C-DHP) hajotuskykyä. T. versicolor (silkkivyökääpä) osoittautui tehokkaimmaksi ligniinin hajottajaksi ja sen pentakloorifenolin (PCP) hajotuskykyä tutkittiin erillisessä kokeessa. Entiset tai pitkään käytössä olleet saha-alueet ovat yhä saastuneet puun käsittelyaineista peräisin olevilla kloorifenoleilla. Biohajoavien muovien kehitystyö sekä kompostoinnin yleistyminen jätteiden käsittelymenetelmänä ovat luoneet tarpeen materiaalien biohajoavuuden määrittämiseen. Euroopan standardisoimisjärjestön (CEN) kontrolloidussa kompostitestissä biohajoavuus määritetään materiaalin hajoamisen aikana muodostuvan hiilidioksidin perusteella. Hiilidioksidin tuotto mitataan sekä näytettä sisältävästä kompostista että kompostista ilman näytettä, ja tällöin oletetaan, että kompostin orgaaninen aines molemmissa komposteissa (tausta) tuottaa yhtä paljon hiilidioksidia. Testin puutteeksi saattaa osoittautua kompostissa tai maassa esiintyvä "priming effect". Tällä tarkoitetaan materiaalin lisäämisen jälkeen esiintyvää epänormaalin suurita tai pientä hiilidioksidin muodostusta, minkä seurauksena testin tulosksena saatava biohajoavuus on virheellinen. Ligniinin hajotessa muodostuu enemmän humusta kuin hiilidioksidia, koska ligniini on humuksen tärkein lähtöaine. Näin ollen ligniiniä sisältävät paperituotteet saattavat testin mukaan vaikuttaa biologisesti hajoamattomilta. Valkolahosienet hajottivat 4-23% ligniinistä hiilidioksidiksi ja T. versicolor 29% PCP:sta. Kompostissa ligniini hajosi hiilidioksidiksi 58°C:ssa huomattavasti vähemmän (8%) kuin lämpötiloissa 35°C ja 50°C (23-24%). Kompostin todennäköisesti tärkeimpien ligniinin hajottajien, termofiilisten sienten, tyypillinen optimilämpötila on 45°C, eivätkä ne ole enää aktiivisia 58°C:ssa. Sekä maassa että kompostissa ligniini sitoutui kuitenkin suurimmaksi osaksi humukseen. Valkolahosienet hajottivat sekä humukseen sitoutunutta ligniiniä että PCP:ia, mutta kompostin sekapopulaatio ei tähän pystynyt, ja ligniiniä sitoutui humukseen yhä enemmän kompostoinnin aikana. T. versicolor hajotti PCP:ia tehokkaasti, eikä se tuottanut myrkyllisiä kloorianisoleja, joita jotkut valkolahosienet saattavat muodostaa kloorifenoleista. Priming effect ilmiötä tutkittiin eri ikäisissä ja kypsyydeltään erilaisissa komposteissa. Kompostit erosvat toisistaan myös hajoamattoman jätteen määrän ja mikrobipopulaation suhteen. Negatiivinen priming effect havaittiin kaikissa epästabiileissa komposteissa (ikä enintään 6 kk), ja sen lisäksi yhdessä näistä komposteista positiivinen priming effect kokeen lopussa. Stabiileissa komposteissa (ikä vähintään 6 kk) ilmiötä ei sen sijaan havaittu. Epästabiileissa komposteissa biohajoavuudelle saadut tulokset eivät siis ole luotettavia. Työn tulosten perusteella valkolahosienet, ja erityisesti T. versicolor, ovat lupaavia saastuneen maan puhdistukseen, joskin sienirihmaston mahdollisuudet säilyä aktiivisena maan alkuperäisen mikrobipopulaation kanssa täytyy vielä selvittää. Kompostin sekapopulaatio, joka ei sisällä valkolahosieniä, hajotti ligniiniä yllättävän tehokkaasti termofiilisille sienille sopivissa lämpötiloissa, vaikka ligniini sitoutuikin pääasiallisesti humukseen. Kompostin kypsyys osoittautui tärkeäksi tekijäksi kontrolloidun kompostitestin onnistumisen kannalta. Priming effect ilmiön välttämiseksi on varmistettava, että testissä käytetty komposti on riittävän kypsä. Kompostien mikrobipopulaation koostumusta kompostoinnin eri vaiheissa tulisi tarkemmin selvittää, koska stabiilien ja epästabiilien kompostien ero aiheutui todennäköisesti populaatioiden rakenteessa vallitsevista eroista. Näin myös priming effect ilmiön syyt voitaisiin selittää paremmin.

Soils that are contaminated with organic aromatic compounds such as polyaromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans (PCDD/Fs) and 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) have previously been treated by combustion at elevated temperatures. Although, combustion is effective, it is expensive due to high energy and equipment requirements. However, innovative technologies such as the use of fungi and/or biochar can offer an alternative option that is friendly to the environment in treating such soils. This thesis evaluates three treatment options to treat these contaminants in soil: 1) the use of fungi growing on pine bark, 2) the use of fungal enzymes, and 3) treatment with both fungi and wood derived biochar. Fungal treatment of TNT-contaminated soil was applied in both laboratory and in pilot scale experiments. In the laboratory experiments, fungi were tested for their capability to grow in soil contaminated with the explosive 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) and to accelerate its degradation. TNT concentration in the soil was 1000 mg kg-1. White-rot fungi, Gymnopilus luteofolius, Kuehneromyces mutabilis, and Phanerochaete velutina grew in the contaminated soil and produced a significant amount of manganese peroxidase (MnP) in TNT contaminated soil during that incubation, but no laccase. The most efficient fungus, P. velutina, degraded 80% of TNT in 2.5 months. The soil treatment process was scaled-up in a 0.56 m3 reactor with 0.3 t of TNT-contaminated soil and P. velutina grown on pine bark. TNT concentration in the soil was 1000 mg kg-1 and the soil:fungal inoculum ratio was 30:1. P. velutina degraded 70% of TNT in 49 days, and no further degradation occurred during the next 58 days of incubation. TNT metabolites, namely 4-amino-2,6-diaminotoluene and 2-amino-4,6-diaminotoluene, accounted for less than 0.5% of the original TNT concentration at the end of the incubation. For PCDD/F-contaminated soil, the approach was to treat the soil with either fungal inoculum or crude MnP. Treatment with fungal inoculum proved to be an effective treatment option as PCDD/Fs were degraded 62% and 64% of the WHO-TEQ (World Health Organisation Total Equivalent) value by Stropharia rugosoannulata and P. velutina, respectively, compared to a control where no degradation was observed. However, when PCDD/F-contaminated soil was treated with crude MnP, no degradation was observed even though significant levels of MnP activity were detected in the soil. Treatment of PAH-contaminated soils (humus-poor soil named sloam and humus-rich forest soil) were studied. Pyrene-contaminated soil was amended with wood-derived biochar, and the ability of fungi to grow in the amended soil was tested. Agrocybe praecox and P. velutina survived well in the amended soil and were selected for further studies. In addition, the role of fungi in pyrene sorption to amended soil was investigated. Fungal treatment of pyrene-contaminated soil amended with biochar increased the sorption of pyrene up to 47 56% to biochar amended forest soils compared to the controls (13 25%) incubated without fungi. Strong fungal/biochar synergistic effects were observed in cases of the sorption of pyrene in the amended soils. In non-sterile contaminated forest soil amended with biochar and incubated with one fungus, higher levels of pyrene (50%) was sorbed to the soil compared with a mere 13% in a similar soil without the fungus. In humus-poor sloam amended with biochar and incubated with fungus, only 9 12% pyrene was sorbed to amended soil. Similar results were obtained for both fungi used in the study. They had significant impact on forest soil with a higher organic matter content compared with sloam. Fungal treatment provides a viable treatment option and an alternative to traditional treatment options such as combustion of soils that are contaminated with organic aromatic contaminants. Fungi have shown strong potential to degrade these contaminants in soil. The addition of biochar and fungi to PAH- contaminated soil may help to reduce the risk of leaching of contaminants to ground water and above all to promote remediation of contaminated soils. Tiivistelmä Polttokäsittely on perinteisesti polyaromaattisten hiilivetyjen (PAH), polykloorattujen dibentso-p-dioksiinien ja dibentsofuraanien (PCDD/Fs) hävittämiseksi käytetty menetelmä. Vaikkakin kyseinen keino on tehokas, sen energia- ja laitevaatimukset tekevät siitä kalliin. Uudet innovatiiviset tekniikat, kuten sienten ja biohiilen käyttö voivatkin osoittautua varteenotettaviksi ja ympäristöystävällisiksi vaihtoehdoiksi maan puhdistuksessa. Tässä väitöskirjassa arvioidaan seuraavien kolmen erilaisen vaihtoehdon soveltuvuutta maan puhdistukseen: 1) männyn kaarnalla kasvavien sienten käyttö, 2) sienistä eristettyjen entsyymien käyttö ja 3) sienten sekä puuperäisen biohiilen käyttö. Tässä väitöskirjatutkimuksessa toteutettiin TNT:lla pilaantuneen maan sienikäsittelyjä sekä laboratoriossa että pilot-mittakaavan kokeissa. Laboratoriokokeissa seurattiin, miten sienet kykenevät kasvamaan 2,4,6-trinitrotolueenilla (TNT) pilaantuneessa maassa ja kykenevätkö ne edesauttamaan TNT:n hajoamista maassa, jossa räjähteen pitoisuus on 1000 mg kg-1. Valkolahosienet Gymnopilus luteofolius, Kuehneromyces mutabilis ja Phanerochaete velutina kasvoivat hyvin pilaantuneessa maassa ja tuottivat merkittävän määrän mangaaniperoksidaasia (MnP). Tehokkain sieni, P. velutina hajotti jopa 80% TNT:sta kahden ja puolen kuukauden aikana. Suuremman mittakaavan koe toteutettiin 0,56 m3 bioreaktorissa, joka sisälsi 0,3 tonnia TNT:lla pilaantunutta maata. Kyseisessä kokeessa TNT:n hajotus toteutettiin lisäämällä reaktoriin männyn kaarnalla kasvava P. velutina. Maan ja sienisiirroksen suhde oli 30:1. P.velutina kykeni hajottamaan jopa 70% TNT:sta 49 päivässä, mutta kokeen jatkuessa vielä 58 päivää TNT ei enää hajonnut enempää. Kokeen lopussa TNT:n haitallisia hajotustuotteita, 4-amino-2,6-diaminotolueenia ja 2-amino-4,6-diaminotolueenia oli maassa vain alle 0,5% alkuperäisestä TNT-määrästä. PCDD/F-yhdisteillä pilaantunutta maata puhdistettiin sienikäsittelyllä tai sienen tuottamalla MnP-entsyymillä. Sekä Stropharia rugosoannulata että P. velutina hajottivat tehokkaasti PCDD/F:ja maassa. WHO-TEQ (World Health Organisation Total Equivalent) asteikolla S. rugosoannulata hajotti 62% ja P. velutina 64% PCDD/F-yhdisteistä kun taas kontrollimaassa ilman sientä hajotusta ei tapahtunut. Huolimatta siitä, että sienet tuottivat suuria määriä MnP:ia maassa hajottaessaan PCDD/F:ja, ei entsyymi yksinään kyennyt hajottamaan dioksiineja. Maan puhdistusta PAH-yhdisteistä tutkittiin kahdessa erilaisessa maalajissa, jotka poikkesivat humuspitoisuutensa suhteen. Pyreenillä pilaantuneseen maahan lisättiin puusta valmistettua biohiiltä, ja sienten kykyä kasvaa maassa seurattiin. Agrocybe praecox ja P. velutina kasvoivat hyvin biohiiltä sisältävässä maassa, ja ne valikoituivat jatkokokeisiin. Kokeessa tutkittiin myös sienten vaikutusta pyreenin adsoboitumiseen biohiileen. Sienen lisäys biohiililtä ja pyreeniä sisältävään maahan auttoi pyreenin adsorptiota, jolloin yhteensä 47 56 % pyreenistä imeytyi biohiileen. Ilman sienikäsittelyä vastaava luku oli 13 25%. Synergistinen vaikutus biohiilen ja sienen välillä oli merkittävä. Epästerilissä humuspitoisessa metsämaassa sienen ja biohiilen yhteisvaikutuksesta 50% pyreenistä saatiin puhdistettua verrattuna 13% ilman sienikäsittelyä. Maassa, jossa humuspitoisuus oli alhainen, vastaavassa käsittelyssä vain 9-12% pyreenistä imeytyi biohiileen. Molemmilla sienilajeilla saatiin samansuuntainen tulos: sienikäsitelyllä oli merkittävä vaikutus pyreenin adsorptioon etenkin paljon orgaanista ainesta sisältävässä metsämaassa. Orgaanisilla yhdisteillä pilaantuneen maan käsittely sienillä on varteenotettava vaihtoehto polttokäsittelyn sijasta. Sienet ovat osoittautuneeet näiden yhdisteiden tehokkaiksi hajottajiksi. Biohiilen ja sienten lisääminen yhdessä PAH-pilaantuneeseen maahan voi pienentää haitallisten yhdisteiden huuhtoutumista pohjavesiin ja ennen kaikkea mahdollistaa pilaantuneen maan puhdistamisen.

Wood-degrading fungi are able to degrade a large range of recalcitrant pollutants which resemble the lignin biopolymer. This ability is attributed to the production of lignin-modifying enzymes, which are extracellular and non-specific. Despite the potential of fungi in bioremediation, there is still an understanding gap in terms of the technology. In this thesis, the feasibility of two ex situ fungal bioremediation methods to treat contaminated soil was evaluated. Treatment of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)-contaminated marsh soil was studied in a stirred slurry-phase reactor. Due to the salt content in marsh soil, fungi were screened for their halotolerance, and the white-rot fungi Lentinus tigrinus, Irpex lacteus and Bjerkandera adusta were selected for further studies. These fungi degraded 40 - 60% of a PAH mixture (phenanthrene, fluoranthene, pyrene and chrysene) in a slurry-phase reactor (100 ml) during 30 days of incubation. Thereafter, B. adusta was selected to scale-up and optimize the process in a 5 L reactor. Maximum degradation of dibenzothiophene (93%), fluoranthene (82%), pyrene (81%) and chrysene (83%) was achieved with the free mycelium inoculum of the highest initial biomass (2.2 g/l). In autoclaved soil, MnP was the most important enzyme involved in PAH degradation. In non-sterile soil, endogenous soil microbes together with B. adusta also degraded the PAHs extensively, suggesting a synergic action between soil microbes and the fungus. A fungal solid-phase cultivation method to pretreat contaminated sawmill soil with high organic matter content was developed to enhance the effectiveness of the subsequent soil combustion. In a preliminary screening of 146 fungal strains, 28 out of 52 fungi, which extensively colonized non-sterile contaminated soil, were litter-decomposing fungi. The 18 strains further selected were characterized by their production of lignin-modifying and hydrolytic enzymes, of which MnP and endo-1,4-β-glucanase were the main enzymes during cultivation on Scots pine (Pinus sylvestris) bark. Of the six fungi selected for further tests, Gymnopilus luteofolius, Phanerochaete velutina, and Stropharia rugosoannulata were the most active soil organic matter degraders. The results showed that a six-month pretreatment of sawmill soil would result in a 3.5 - 9.5% loss of organic matter, depending on the fungus applied. The pretreatment process was scaled-up for a 0.56 m3 reactor, in which perforated plastic tubes filled with S. rugosoannulata growing on pine bark were introduced into the soil. The fungal pretreatment resulted in a soil mass loss of 30.5 kg, which represents 10% of the original soil mass (308 kg). Despite the fact that Scots pine bark contains several antimicrobial compounds, it was a suitable substrate for fungal growth and promoter of the production of oxidative enzymes, as well as an excellent and cheap natural carrier of fungal mycelium. This thesis successfully developed two novel fungal ex situ bioremediation technologies and introduce new insights for their further full-scale application. Ex situ slurry-phase fungal reactors might be applied in cases when the soil has a high water content or when the contaminant bioavailability is low; for example, in wastewater treatment plants to remove pharmaceutical residues. Fungal solid-phase bioremediation is a promising remediation technology to ex situ or in situ treat contaminated soil. Puuta lahottavat kantasienet, erityisesti valkolahosienet ja karikkeenlahottajasienet, pystyvät hajottamaan monia erilaisia vaikeasti hajoavia ympäristömyrkkyjä. Luonnossa nämä sienet hajottavat ligniiniä solunulkoisilla entsyymeillä, jotka ovat epäspesifejä ja sen vuoksi kykeneviä hajottamaan myös muita yhdisteitä, kuten maata pilaavia orgaanisia yhdisteitä. Sieniin perustuvaa puhdistustekniikkaa ei kuitenkaan ole vielä kaupallisesti saatavilla. Tässä väitöskirjassa tutkittiin kahden sienitekniikan toteuttamiskelpoisuutta pilaantuneen maan puhdistamiseksi. Polyaromaattisilla hiilivedyillä (PAH) pilaantuneen marskimaan käsittelyä tutkittiin sekoitettavassa bioreaktorissa. Koska marskimaa sisältää suolaa, sienet seulottiin ensimmäisessä vaiheessa suolan sietokyvyn perusteella, jolloin löydettiin kolme korkeaa suolapitoisuutta sietävää valkolahosientä: Lentinus tigrinus, Irpex lacteus ja Bjerkandera adusta. Nämä sienet hajottivat tehokkaasti PAH-seosta (fenantreeni, fluoranteeni, pyreeni, kryseeni) kolmessakymmenessä päivässä 100 ml kokoisessa reaktorissa, jossa oli 10 % maata ja loput nestettä. Prosessia testattiin myös viiden litran reaktorissa B. adusta-sienellä, jolloin glukoosin pitoisuus nesteessä, sienisiirroksen tyyppi ja biomassa optimoitiin. Kun sienisiirrosta lisättiin reaktoriin maksimimäärä (2,2 g/l) saavutettiin myös suurin hajotusteho: dibentsotiofeenista hajosi 93 %, fluoranteenista 82 %, pyreenistä 81 % ja kryseenistä 83 %. Glukoosin optimipitoisuus PAH-yhdisteiden hajotukselle oli 20 ± 3 g/l. B. adusta alkoi tuottaa mangaaniperoksidaasia (MnP) reaktorissa seitsemän päivän kasvatuksen jälkeen ja se oli todennäköisesti tärkein PAH-yhdisteitä hajottava entsyymi maassa, jossa kasvoi pelkästään B. adusta. Epästeriilissä maassa B. adusta oletettavasti hajotti PAH-yhdisteitä yhdessä maan omien mikro-organismien kanssa. Toinen sienitekniikkasovellus kehitettiin pilaantuneelle maalle, jossa orgaanisen aineen pitoisuus on suuri. Tällaista maata esikäsiteltäisiin sienen avulla ennen maan polttoa. Esikäsittelyn tarkoitus on maan orgaanisen aineen vähentäminen ja siten polttoprosessin tehostaminen. Sopivat sienet seulottiin 146 sienikannan joukosta, joista 34 kasvoi hyvin maahan. Näistä sienistä suurin osa eli 28 oli karikkeenlahottajasieniä. Kun parhaiten kasvaneita 18 sienikantaa kasvatettiin männyn (Pinus sylvestris) kaarnalla, ne tuottivat ligninolyyttisiä ja hydrolyyttisia entsyymejä; etenkin MnP:ia ja endo-1,4-β-glukanaasia. Kaikkein aktiivisimmin orgaanista ainetta maassa hajottivat Gymnopilus luteofolius, Phanerochaete velutina ja Stropharia rugosoannulata. Tulosten perusteella arvioitiin, että saha-alueen maan esikäsittelyllä saavutettaisiin 3.5 - 9.5 % orgaanisen aineen hävikki kuudessa kuukaudessa sienilajista riippuen. Maan esikäsittelyä testattiin myös 0.56 m3 reaktorissa, johon sienisiirros lisättiin verkkomaisissa muoviputkissa. Putket sisälsivät kaarnalla kasvavaa S. rugosoannulataa, joka levisi putkien raoista maahan koko reaktorissa. Maan massahävikki esikäsittelyssä oli 30,5 kg, eli n. 10 % maan alkuperäisestä massasta (308 kg). Männyn kaarnan käyttökelpoisuus sienen ravinteeksi maan käsittelyssä arvioitiin, ja kaarnan kemiallinen koostumus määritettiin. Kaarna sisälsi 45 % ligniiniä, 25 % selluloosaa ja 15 % hemiselluloosaa. Uuteaineista yleisimmät olivat hartsihapot (etenkin dehydroabietiinihappo) ja sitosteroli. Tyydyttymättömien rasvahappojen (UFA) pitoisuus oli korkea, koostuen pääasiassa oleiinihaposta, linolihaposta ja linoleenihaposta. Kaarnassa kasvaessaan sekä P. velutina että S. rugosoannulata hajottivat kaarnan kaikkia makromolekyylejä yhtäaikaisesti. Vaikka kaarna sisältää useita mikrobien kasvua ehkäiseviä yhdisteitä, sienet kasvoivat siinä hyvin tuottaen kasvaessaan erityisesti MnP:ia ja endo-1,4-β-glukanaasia. Tyydyttämättömien rasvahappojen hajoaminen oli samanaikaista kuin ligniinin hajoaminen ja MnP:n tuoton huippukohta. Tulos viittaisi siihen, että lipidiperoksidaatio eli rasvojen hapettuminen edisti osaltaan ligniinin hajoamista. Pilaantuneen maan käsittely sienitekniikalla tarjoaa vaihtoehtoisen menetelmän vakiintuneille menetelmille, kuten stabilointi ja poltto. Reaktoria voitaisiin hyödyntää tapauksissa, joissa maan vesipitoisuus on suuri tai kun pilaavan yhdisteen biosaatavuus on alhainen, esimerkiksi lääkejäämien poistoon jätevesistä. Pilaantuneille maamassoille sienitekniikkaa voitaisiin soveltaa sekä ex situ että in situ. Hinnaltaan edullinen männyn kaarna sopii sienten kasvualustaksi ja sienisiirroksen kantaja-aineeksi erinomaisesti edistäen hapettavien entsyymien tuottoa.