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Las Jornadas sobre la Adaptación al EEES en la Facultad de Biología forman parte de las actividades del Proyecto de Innovación Educativa de la Facultad de Biología "Iniciativas para la integración en el EEES", y pretenden difundir las experiencias desarrolladas en el marco de la Convergencia con el Espacio Europeo de Educación Superior a lo largo de estos últimos cinco años. Las Jornadas están abiertas a toda la comunidad universitaria que este interesada en conocer nuestras iniciativas, pero muy expecialmente a la relacionada con la Facultad de Biología

En la literatura científica, desde el año 1965, se han descrito más de 800 enzimas que sufren desviaciones de la cinética de Michaelis-Menten, basándose en estudios de estado estacionario '. Estos hechos han animado a distintos autores a intentar explicar los resultados experimentales bajo enfoques más rigurosos que los utilizados previamente -. encontrando que a diferencia de la ecuación clásica de Michaelis-Menten, que es de grado 1:1 con respecto al sustrato, podrían darse grados tales como 1:2; 2:2; 2:3; 3:4; etc. Estos descubrimientos cuestionan fuertemente si debe aceptarse que las enzimas son en su mayoría michaelianas, ya que si esto no es así. los parámetros clásicos tales como KM y Vma, perderían su significado físico para tales enzimas. Es conocida la existencia de posibles causas que pueden dar lugar a desviaciones de la cinética de Michaelis-Menten •*. Algunos ejemplos son: la enzima que contiene una impureza que reacciona con el sustrato, o bien la enzima que existe en dos formas con diferentes actividades o en la que se producen agregaciones o micelas '. Algunas de las desviaciones cinéticas encontradas podrían deberse a tales hechos. No obstante, una vez suprimidos tales efectos donde es posible, ios hechos experimentales indican que son muchas las enzimas que dan cinéticas anómalas, entre ellas se encuentran acetilcolinesterasa, fosfatasa acida, adenosín desaminasa, ariisulfatasa, bencilamina oxidasa. a-quimotripsina, fumarasa, p-galactosidasa, galactosa deshidrogenasa, peroxidasa y xantín oxidasa ~. Algunas posibles causas cinéticas para explicar estas desviaciones podrían ser: a) inhibición por sustrato, b) activación por sustrato, c) rutas al azar, d) efectos alostéricos. El grupo más numeroso de desviaciones de la cinética de Michelis-Menten corresponde a la inhibición por sustrato (352 ejemplos). En la mayoría de los casos en los que aparece este tipo de efecto, lo que se ha hecho es trabajar a bajas concentraciones de sustrato, de tal manera que se obtenga una ecuación de velocidad 1:1 con respecto al sustrato y así poder definir KM y V„„. No obstante, se han utilizado en algunos trabajos ^ concentraciones elevadas de sustrato de tal manera que se obtiene la ecuación de velocidad real para el mecanismo bajo estudio; la regresión no lineal permite calcular los parámetros globales que aparecen bajo estas condiciones en la ecuación de velocidad. Sin embargo, el cálculo de las constantes de velocidad implicadas en el mecanismo no puede llevarse a cabo con datos únicamente de estado estacionario. La posibilidad del uso de técnicas rápidas permite obtener información sobre la fase de transición del sistema y la elucidación completa del mecanismo puede llevarse a cabo mediante la utilización conjunta de ambas técnicas ". Bajo este enfoque abordamos el estudio cinético del mecanismo más simple de inhibición por sustrato: mecanismo de Michaelis-Menten con inhibición por sustrato o bien mecanismo Uni-Uni con inhibición por sustrato.

El estudio cinético de las reacciones enzimáticas trisustrato se ha llevado a cabo bajo la aproximación del estado estacionario, la expresión de la ecuación de velocidad y sus distintas representaciones gráficas permiten distinguir entre los posibles mecanismos y obtener los parámetros cinéticos (KM y V^^,) que caracterizan al enzima actuando sobre los distintos sustratos (1-4). Sin embargo el enfoque en fase de transición, consigue una información más profunda sobre las distintas etapas del ciclo catalítico que tiene lugar en la transformación de los sustratos a productos. Estudios cinéticos en fase de transición, se han realizado fundamentalmente con reacciones enzimáticas monosustrato y bisustrato (5) y también se ha aplicado a un mecanismo trisustrato ordenado tipo Theorell-Chance (6). El grupo de mecanismos tipo Ping-Pong en reacciones trisustrato es muy amplio (4, 7). Respecto a enzimas que siguen un mecanismo Hexa Uni Ping-Pong,mejor estudiado en estado estacionario es piruvato-fosfato diquinasa de Propionibacterium shermanii (8) y de Bacillus symbiosus (9) que cataliza la conversión de piruvato, ATP y Pi a fosfoenolpiruvato, AMP y PPi. El objetivo de nuestro trabajo es obtener las ecuaciones cinéticas de formación de los productos, válidas tanto para la fase de transición como para el estado estacionario correspondientes al mecanismo (I), y establecer un método para la determinación de todas las constantes de velocidad implicadas en él, a partir de los perfiles concentracióntiempo de los productos, en el caso bastante frecuente de que en el sistema se den las condiciones de equilibrio rápido en la unión de los distintos sustratos

Objetivos El presente trabajo pretende utilizar métodos de cromatografía de gases rápida (FGC) y cromatografía de gases enantioselectiva (EsGC) con detección por espectrometría de masas (MSD) para el la determinación cualitativa y cuantitativa de los componentes de aceites esenciales extraídos de plantas aromáticas cultivadas en Murcia, así como determinar cuantitativamente la distribución enantiomérica de sus principales componentes, e ilustrar su aplicabilidad caracterizando aceites esenciales de muestras de plantas de la familia Lamiaceae. También pretende evaluar sus posibles capacidades antioxidante global por varios métodos e inhibidora de enzimas hialuronidasa y lipoxigenasa. Metodología Cada muestra de planta seca estudiada se destiló por arrastre con vapor. Las especies ensayadas fueron Lavandula angustifolia (lavanda), Lavandula latifolia (espliego), Lavandula stoechas (cantueso), Lavandula x intermedia (lavandín), Thymus zygis (tomillo rojo), Thymus hyemalis (tomillo de invierno), Origanum vulgare (orégano italiano) y Thymbra capitata (orégano español). Cada aceite esencial se analizó por cromatografía de gases en columna apolar con detección por espectrometría de masas para determinar sus componentes. Determinando las concentraciones relativas, basada en área de pico del cromatograma, y absoluta, basada en las respuestas de los compuestos calibrados con patrones comerciales. Se realizó una cromatografía enantioselectiva para determinar la distribución relativa de los principales enantiómeros presentes en los aceites esenciales. Los resultados se contrastaron con las normas ISO existentes y con los informes de la bibliografía científica internacional. También se evaluaron las muestras mediante ensayos de capacidad antioxidante por diversos métodos, y de capacidad inhibidora sobre las enzimas lipoxigenasa e hialuronidasa, relacionadas con procesos inflamatorios, oxidantes y de envejecimiento de la piel. Resultados Los compuestos mayoritarios determinados fueron fenchona y alcanfor en cantueso; linalol y acetato de linalilo en lavandín y lavanda; alcanfor, 1,8-cineol y linalol en espliego; timol, γ-terpineno y p-cimeno en tomillo rojo con alto timol; γ-terpineno, terpinen-4-ol y linalol en tomillo rojo con alto linalol; 1,8-cineol en tomillo de invierno y p-cimeno, γ-terpineno y carvacrol en los oréganos español e italiano. Los enantiómeros mayoritarios han sido determinados como (+)-alcanfor y (+)-fenchona en cantueso; (+)-alcanfor, (-)-linalol y (-)-acetato de linalilo en lavandín, lavanda y espliego; (-)-linalol, (+)-limoneno y (-)-borneol en los tomillos rojo y de invierno y (-)-linalol, (+)-limoneno y (+)-terpinen-4-ol en los oréganos español e italiano. Observamos que el tomillo rojo presenta alta capacidad antioxidante en los ensayos ABTS, DPPH, RdP, TBARS y óxido nítrico, mientras que el género Lavandula muestra mayor capacidad de quelatacion y de neutralizar ciertos radicales oxigenados como los presentes en los métodos ORAC e hidroxilo. Los oréganos presentan un comportamiento cercano al del tomillo rojo ya que su componente principal, el carvacrol es isómero del timol. Pese a la similitud estructural de estos dos isómeros, el timol presenta mejores características antioxidantes. Los aceites de tomillos rojos, predominantemente, son los que mejor resultado han mostrado en la inhibición de las enzimas hialuronidasa y lipoxigenasa, principalmente debido al timol que contienen. Conclusiones • Se ha optimizado y aplicado satisfactoriamente un método de cromatografía de gases rápida con detección de espectrometría de masas (FGC-MSD), para el análisis de aceites esenciales de distintas plantas aromáticas. • Se han identificado y determinado cuantitativamente las concentraciones y las distribuciones enantioméricas de los principales ingredientes de los aceites esenciales estudiados, contrastando sus cantidades relativas con las establecidas en las correspondientes normas ISO. • La evaluación de las capacidades antioxidante global e inhibidoras de lipoxigenasa y hialuronidasa indican que las muestras son especialmente efectivas en los distintos métodos ensayados animando a un mayor uso de los aceites esenciales estudiados como potenciales antioxidantes para distintas aplicaciones, así como potenciales tratamientos de enfermedades de base inflamatoria y cosméticos anti-envejecimiento para preservar de la degradación del ácido hialurónico., Objectives The present work aims to develop and use fast gas chromatography (FGC) and enantioselective gas chromatography (EsGC) coupled to mass spectrometry detection (MSD) methods to determine qualitatively and quantitatively the composition of essential oils extracted from aromatic plants cultivated in Murcia. Also, this work aims to determine the enantiomeric distribution of the main components of the essential oils and exemplify its usability with several samples of the Lamiaceae family. Finally, the possible antioxidant and inhibitory activities on hyaluronidase and lipoxygenase of these samples will be tested by several different methods. Methodology Each sample of dry plant was steam distilled. The assayed species were Lavandula angustifolia (lavender), Lavandula latifolia (spike lavender), Lavandula stoechas (topped lavender), Lavandula x intermedia (lavandin), Thymus zygis (red thyme), Thymus hyemalis (winter thyme), Origanum vulgare (Italian oregano) and Thymbra capitata (Spanish oregano). Each essential oil was analyzed to determine its components by means of gas chromatography in a non-polar column coupled to mass spectrometry. Both relative concentrations, based on peak area of the chromatogram, and absolute concentrations, based on responses of calibrated commercial standards, were determined. An enantioselective gas chromatography was performed to determine the relative distribution of the main enantiomers of the essential oils. The results were compared to the ISO normative for each species and to the worldwide reports found in the literature. Furthermore, antioxidant capacities and inhibitory activities on lipoxygenase and hyaluronidase were evaluated by different methods for each sample. The mentioned enzymes are highly related to inflammatory, oxidant and skin-ageing processes. Results The main components found were fenchone and camphor in topped lavender; linalool and linalyl acetate in lavandin and lavender; camphor, 1,8-cineole and linalool in spike lavender; thymol, γ-terpinene and p-cymene in red thyme with high thymol; γ-terpinene, terpinen-4-ol and linalool in red thyme with high linalool; 1,8-cineole in winter thyme and p-cymene, γ-terpinene and carvacrol in Spanish and Italian oregano. The main enantiomers found are: (+)-camphor and (+)-fenchone in topped lavender; (+)-camphor, (-)-linalool and (-)-linalyl acetate in lavandin, lavender and spike lavender; (-)-linalool, (+)-limonene and (-)-borneol in red and winter thyme and (-)-linalool, (+)-limonene and (+)-terpinen-4-ol in Spanish and Italian oregano. It has been observed that red thyme shows very high antioxidant capacity in ABTS, DPPH, RdP, TBARS and nitric oxide assay, while Lavandula genus shows better chelating power and better capacity to scavenge some oxygenated radicals, like the ones present in ORAC and hydroxyl assays. Both oregano species show a similar behaviour to red thyme, due to its main component, carvacrol, which is a thymol isomer. Despite the structural similarity of both isomers, thymol shows better antioxidant power. Red thyme essential oils have shown the best inhibitory results in both enzymes hyaluronidase and lipoxygenase, mainly due to their high content of thymol. Conclusions • A method using fast gas chromatography coupled to mass spectrometry (FGC-MSD) has been developed and optimized to analyze essential oils from different aromatic plants. • The identity, quantitative concentrations and enantiomeric distributions of the essential oil main ingredients have been determined and their relative concentrations have been compared to worldwide literature reports and international commercial ISO standards. • Antioxidant capacity and lipoxygenase and hyaluronidase inhibitory activities have been positively evaluated, thus, encouraging the use of the studied essential oils as potential antioxidants and unveiling potential applications in new therapies for inflammatory diseases, or in anti-aging cosmetic treatments to preserve hyaluronic acid from degradation.

OBJETIVOS: En esta tesis se han marcado como objetivos profundizar en el conocimiento del mecanismo de acción de tirosinasa, así como desarrollar un método que sea fiable para distinguir los verdaderos sustratos alternativos, activadores e inhibidores de la enzima. METODOLOGÍA: Se realizaron las siguientes técnicas: aislamiento, concentración y purificación de tirosinasa, sirviéndonos de FPLC o microgeles de electroforesis, para disponer de una isoenzima purificada; caracterización de la actividad, y regulación por inhibición e inactivación enzimática de tirosinasa, utilizando sustratos cromogénicos y fluorogénicos y ensayos de absorbancia mediante espectrofotometría ultravioleta/visible; optimización de métodos cromatográficos con detección mediante espectrometría de masas (GC-MS y HPLC-MS), para la identificación y cuantificación de biomoléculas; ensayos de RMN, para obtener valores de desplazamiento químico y acoplamiento molecular computacional o docking, para entender los modos de unión de tirosinasa con distintos ligandos; y, finalmente, cuantificación de la fiabilidad de los resultados experimentales obtenidos mediante parámetros de estadística descriptiva y pruebas de significación estadística. CONCLUSIONES: Gracias al desarrollo de esta tesis, se ha avanzado en el estudio del mecanismo cinético y estructural de la enzima tirosinasa, y se han establecido criterios cinéticos para distinguir entre sustratos alternativos, activadores e inhibidores, siendo además los mecanismos propuestos, apoyados y confirmados por los estudios de docking. De este modo, se confirmó que las 3-4/-aminoacetofenonas son realmente inhibidores, a pesar de exhibir activación o inhibición en función de la cantidad de L-dopa utilizada en los ensayos; un hecho que se justifica por la formación de un aducto de mayor absorbancia que el dopacromo. Se confirmó el compuesto 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona (Uvinul D50) como inhibidor de la enzima, estableciendo como nuevas constantes de inhibición aparente e IC50 los valores de 2.02 ± 0.09 mM y 3.82 ± 0.39 mM, respectivamente. También se estudió la acción de tirosinasa sobre los ácidos cafeico y p-cumárico, mediante nuevos métodos que evitaran interferencias por la inestabilidad de los compuestos generados, y que así, permitieran su correcta caracterización cinética. Posteriormente se estudiaron los agentes despigmentantes, α y β-arbutina, y su derivado la desoxiarbutina en sendos artículos, comprobando que ambos casos se tratan realmente de sustratos alternativos de la enzima, hecho que debe ser tenido en cuenta para su aplicación en cremas cosméticas. Además, se demostró que la desoxiarbutina es el único sustrato de tirosinasa descubierto hasta el momento que no libera o-difenol al medio después de la hidroxilación. El siguiente estudio fue realizado acerca de la acción de tirosinasa sobre ácido cafeico y su n-nonil éster, el n-nonil cafeato, que resultaron ser sustratos suicidas que inactivan la enzima, siendo el cafeato más potente que el cafeico en este aspecto. Finalmente, se estudió la acción de tirosinasa sobre ácido cinámico y algunos de sus derivados, comprobando que los ácidos cinámico, 2-hidroxicinámico, 2,3 y 4-metoxicinámico son inhibidores de tirosinasa, mientras que los ácidos 3-hidroxicinámico, 4-hidroxicinámico y 3,4-dihidroxicinámico actúan como sustratos de tirosinasa. Además, se caracterizó cada uno de ellos con sus correspondientes constantes cinéticas. OBJECTIVES: For this thesis, they had been established as objectives to deepen in the mechanism of the action of tyrosinase and to develop a reliable method to distinguish the true alternative substrates, activators and inhibitors of the enzyme. METHODOLOGY: The following techniques were made: isolation, concentration and purification of tyrosinase, using FPLC or microgel electrophoresis, to obtain a purified isoenzyme; characterization of the activity of tyrosinase, and regulation of the enzyme by means of inhibition or activation, using cromogenic and fluorogenic substrates as well as absorbance essays with Ultraviolet/visible spectrophotometry; optimization of chromatographic methods with detection by using mass spectrometry (GC-MS and HPLC-MS), to identify and quantify biomolecules; NMR essays, to obtain chemical shift values and computational simulation of molecular coupling or docking, to understand the types of binding of tyrosinase with different ligands; and finally, quantification of the reliability of the experimental results obtained by means of parameters of descriptive statistics and tests of statistical significance. CONCLUSIONS: Thanks to the development of this thesis, the understanding of the kinetic and structural mechanism of tyrosinase has advanced, and kinetic criteria to distinguish between alternative substrates, activators and inhibitors of the enzyme has been established. Moreover, these findings have been supported and confirmed by docking studies. In this way, we confirmed that 3-4/-aminoacetophenones are really inhibitors, despite showing activation or inhibition depending on the quantity of L-dopa used in the essays, which is due to the formation of an adduct which absorbs more than dopachrome. 2,2',4,4'-tetrahydroxybenzophenone (Uvinul D50) was confirmed as an inhibitor of the enzyme, establishing the new constants of apparent inhibition and IC50 as 2.02 ± 0.09 mM y 3.82 ± 0.39 mM, respectively. We also studied the action of tyrosinase on caffeic and p-coumaric acids, by using new methods to avoid interferences caused by the instability of the generated compounds, so the kinetic characterization was correct. Subsequently, the depigmenting agents α y β-arbutin were studied as well as their derived desoxiarbutin, checking that are alternative substrates of the enzyme, so it has to be taken into account for its use in cosmetics. Moreover, desoxiarbutin was proved as the single discovered substrate that not release o-diphenol to the medium after the hydroxylation. The following research was about the action of tyrosinase on caffeic acid and its n-nonyl ester, n-nonyl caffeate, which were proved as suicide substrates that inactivate the enzyme. N-nonyl caffeate showed more potency to inactivate the enzyme than caffeic acid. Finally, the action of tyrosinase on cinnamic acid and some derivatives was studied, checking that cinnamic, 2-hydroxycinnamic, 2,3 and 4-methocycinnamic acids are inhibitors of tyrosinase, whereas 3-hydroxycinnamic, 4-hydroxycinnamic and 3,4-dihydroxycinnamic acids are substrates of the enzyme. Moreover, the kinetic constants of these compounds were characterized.

Los aceites esenciales (AEs) han sido utilizados desde tiempos remotos por sus propiedades aromáticas y medicinales. En la actualidad, el interés por conocer y mejorar la aplicabilidad de los AEs en diferentes industrias está en aumento. Este estudio muestra la composición detallada de los AEs obtenidos a partir de cuatro especies de la famila Lamiaceae: Thymus mastichina L., R. officinalis L., Salvia lavandulifolia VAHL and S. officinalis L. Además, las actividades antimicrobianas de estos AEs fueron comparadas con las de los AEs de Thymus zygis Loefl. ex L. y Thymus hyemalis LANGE. Todas las plantas fueron cultivadas en la Región de Murcia y sus AEs obtenidos mediante hidrodestilación. Además, se determinó la actividad antimicrobiana de cuatro AEs durante la elaboración y el almacenamiento de mezclas de frutas y verduras. La composición de cada AE fue determinada mediante cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas. Los resultados fueron expresados en concentraciones relativas y absolutas. Los principales compuestos identificados en los AEs fueron: α-pineno, β-pineno, 1,8-cineol, linalol y α-terpineol en AEs de T. mastichina; α-pineno, canfeno, 1,8-cineol y alcanfor en AEs de R. officinalis; α-pineno, canfeno, 1,8-cineol y alcanfor en AEs de S. lavandulifolia; 1,8-cineol, α-tuyona, β-tuyona y alcanfor en los AEs de S. officinalis. Mediante la cromatografía de gases enantioselectiva, las proporciones enantioméricas de las principales biomoléculas quirales de los AEs fueron analizadas. Algunos enantiómeros se encontraron en altas concentraciones en todos los AEs: (-)-canfeno, (+)-hidrato de sabineno, (+)-terpinen-4-ol, (-)-linanol, (+)-acetato de α-terpinilo y (-)-β-cariofileno. Sin embargo, las distribuciones enantioméricas de otros componentes fueron diferentes dependiendo del AE. Estas propiedades son útiles para determinar la autenticidad y el origen de los AEs. Los AEs mostraron actividades antioxidantes similares con todos los métodos usados. Los AEs de T. mastichina fueron los más activos en los métodos ORAC y TBARS. La actividad contra el radical libre DPPH fue similar en todos los AEs analizados. Los AEs de romero fueron, en general, los más activos en el método ABTS, aunque el AESo-1 y el AETm-1 mostraron capacidades antioxidantes superiores a las del resto de AEs. Sólo los AEs de Salvia mostraron capacidad reductora. Los AEs de R. officinalis y S. lavandulifolia mostraron capacidades quelatantes ligeramente superiores que el resto. Las capacidades de los AEs para inhibir las actividades enzimáticas de lipoxigenasa (LOX) y acetilcolinesterasa (AChE) fueron determinadas, ya que estas enzimas están relacionadas con varias enfermedades, procesos inflamatorios y neurotransmisión. Todos los AEs fueron capaces de inhibir la actividad LOX, debido sobre todo a la presencia de acetato de bornilo, limoneno y linalol. La enzima AChE fue también inhibida por los AEs estudiados en esta Tesis Doctoral, ya que contienen alta concentración de 1,8-cineol. En cuanto a la actividad antimicrobiana, P. aeruginosa fue el microorganismo más resistente y S. aureus y C. albicans los más sensibles. Los AEs de T. zygis mostraron la mayor actividad antimicrobiana. Entre las biomoléculas, α-Pineno, p-cimeno, limoneno, linalol, borneol, timol y carvacrol mostraron capacidad antimicrobiana. Además, la adición de AEs de Citrus medica, Mentha piperita, Salvia officinalis y Thymus zygis durante el lavado de frutas y verduras, fue útil para la conservación de tres de las cinco formulaciones probadas, sin cambiar las condiciones organolépticas del producto final. Estos resultados pueden utilizarse como punto de partida para futuras investigaciones sobre la aplicación de AEs en industrias alimentarias. Los estudios llevados a cabo durante esta Tesis Doctoral determinan que los AEs obtenidos a partir de plantas cultivadas en la Región de Murcia podrían ser utilizados como antioxidantes naturales, inhibidores de enzimas y antimicrobianos en industrias alimentarias, cosméticas y farmacéuticas. Essential oils (EOs) have been used since ancient times because of their aromatic and medicinal properties. Nowadays, the interest in knowing and improving the applicability of EOs in many industries is increasing. The current study shows the detailed compositions and bioactivities of EOs obtained from four Lamiaceae species: Thymus mastichina L., R. officinalis L., Salvia lavandulifolia VAHL and S. officinalis L. In addition, the antimicrobial activities of these EOs were compared to that from Thymus zygis Loefl. ex L. and Thymus hyemalis LANGE EOs. All plants were cultivated in the Region of Murcia and their EOs were obtained by hydrodistillation. Moreover, the antimicrobial activity of four EOs was tested during the processing and storage of fruits and vegetables mixtures. The composition of each EO was determined by gas chromatography coupled with mass spectrometry. The results were expressed in relative and absolute concentrations. Main compounds identified in the EOs were: α-pinene, β-pinene, 1,8-cineole, linalool and α-terpineol in the EOs from T. mastichina; α-pinene, camphene, 1,8-cineole and camphor in the EOs from R. officinalis; α-pinene, camphene, 1,8-cineole and camphor in the EOs from S. lavandulifolia; 1,8-cineole, α-thujone, β-thujone and camphor in the EOs from S. officinalis. Using enantioselective gas chromatography, the enantiomeric ratios of main chiral biomolecules of the EOs were analyzed. Some enantiomers were the most abundant in all EOs: (-)-camphene, (+)-sabinene hydrate, (+)-terpinen-4-ol, (-)-linanool, (+)-terpinyl acetate and (-)-β-caryophyllene. However, the enantiomeric distributions of other compounds were different depending on the EO. These properties are useful to determine the authenticity and origin of EOs. The EOs revealed similar antioxidant capacities with all methods used. EOs from T. mastichina were the most active in ORAC and TBARS methods. The activity against DPPH radical was similar in all the EOs analyzed. In general, the EOs from rosemary were the most active in the ABTS method, although AESo-1 and AETm-1 had higher antioxidant capacities than the other EOs. Only the EOs from Salvia showed reducing capacity. The EOs from R. officinalis and S. lavandulifolia presented slightly higher chelating activity than the other EOs. The capacities of EOs to inhibit the lipoxygenase (LOX) and acetylcholinesterase (AChE) activities were assayed, because these enzymes are related to several illnesses, inflammatory process and neurotransmission. All EOs were able to inhibit LOX activity, mainly due to the presence of bornyl acetate, limonene and linalool. AChE activity was also inhibited by the EOs investigated in this PhD Thesis, because they contained high concentration of 1,8-cineole. Regards to the antimicrobial activity, P. aeruginosa was the most resistant microorganism and S. aureus and C. albicans were the most sensitive ones. The EOs from T. zygis showed the highest antimicrobial activities. α-Pinene, p-cymene, limonene, linalool, borneol, thymol and carvacrol were compounds with antimicrobial activity. Moreover, the addition of EOs from Citrus medica, Mentha piperita, Salvia officinalis and Thymus zygis during washing of fruits and vegetables, was useful for the conservation of three of five formulations, without changing the organoleptic properties. These results can serve as a starting point for future research about the applicability of EOs in food industries. The studies carried out in this PhD Thesis make it possible to establish that EOs from plants grown in Murcia (S.E. Spain) have potential applicability as natural antioxidants, enzyme inhibitors and antimicrobials in food, cosmetic and pharmaceutical industries.

Objetivos • Caracterización cinética de la oxidación de diversas fenotiazinas comerciales, catalizada por lacasa, mediante un método espectrofotométrico, útil para posibles ensayos de gestión de la calidad en industrias farmacéuticas. • Desarrollo de un método espectrofotométrico apropiado, para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa, que originan productos cromofóricos inestables. • Optimización de la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes como TCP y PCP, con peróxido de hidrógeno y peroxidasa sin mediadores sintéticos. • Optimización de la biodegradación enzimática de TCP por oxígeno molecular, catalizada por lacasa en presencia de mediadores naturales, sin mediadores sintéticos ni peróxido de hidrógeno. • Determinación enzimática y espectrofotométrica de tioles, y aplicación a ensayos de gestión de la calidad de fármacos tiólicos, superando a otros métodos instrumentales alternativos. • Análisis cuantitativo de ácido ascórbico, en muestras sintéticas y en fármacos, utilizando un nuevo método enzimático y espectrofotométrico, capaz de superar a otros métodos ópticos y electroquímicos. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Ensayos de cromatografía de gases acoplada a detector de espectrometría de masas (GC-MS) Los espectros de masas fueron realizados con un espectrómetro de masas Agilent 5975 acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 7890N. Ensayos espectrofluorométricos Los espectro de fluorescencia fueron registrados con un lector de placas fluorescente GeminiTM XPS. Ensayos oximétricos Las medidas de evolución de consumo de oxígeno fueron medidas con un electro de tipo Clark acoplado a un oxígrafo Hansatech. Caracterización cinética de fenotiazinas y sustratos fenólicos La oxidación de diferentes fenotiazinas y sustratos fenólicos por lacasa procedente de Trametes villosa (TvL), fue seguida por la absorbancia de cada uno de los cationes radical cromofóricos. Parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), o su cuadrado (Amax2) y la velocidad en estado estacionario VSS fueron determinados. Biodegradación enzimática de clorofenoles La biodegradación de contaminantes clorados fue llevada a cabo por dos tipos de enzimas, lacasa (TvL) como enzima principal de estudio, y peroxidasas de sofá y rábano (SBP y HRP, respectivamente), con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del 2,4,6-triclorofenol y del pentaclorofenol (PCP). Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente la oxidación de varias fenotiazinas comerciales por lacasa, comprobando los efectos de diversas variables experimentales, sobre la formación enzimática y la destrucción no enzimática, de sus correspondientes radicales cromofóricos. • Se ha conseguido desarrollar un método espectrofotométrico simple, fiable y eficaz para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa que originan productos cromofóricos inestables, superando los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos de velocidad inicial. • El uso de peróxido de hidrógeno con peroxidasas de rábano picante (HRP) y de soja (SBP), ha demostrado ser una buena alternativa para la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes, como TCP y PCP. • Se ha conseguido optimizar el proceso, ofreciendo un método rápido, eficaz, sin peróxido de hidrógeno, y medioambientalmente sostenible, superando a otros métodos que utilizan mediadores sintéticos, con alto coste y toxicidad. • La elevada reproducibilidad de los métodos enzimáticos con lacasa para la determinación de tioles y de ácido ascórbico, ha indicado una satisfactoria precisión de los mismos. • La validez de los métodos enzimáticos con lacasa respecto a métodos de referencia, para la determinación de D-penicilamina o de ácido ascórbico en fármacos, ilustra su aplicabilidad para el análisis de muestras reales, especialmente de principios activos reductores como tioles y ácido ascórbico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral., Objectives • Kinetic characterization of the oxidation of several commercial phenothiazines catalyzed by laccase, using a spectrophotometric assay, useful for quality management assays in pharmaceutical industries. • Development of an appropriate spectrophotometric assay, for the kinetic characterization of phenolic substrates, which produce unstable chromophoric products. • Optimization of the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols like TCP and PCP, with hydrogen peroxide and peroxidase in the absence of synthetic mediators. • Optimization of the enzymatic biodegradation of TCP by molecular oxygen, catalysed by laccase in the presence of natural mediators, and without synthetic mediators neither hydrogen peroxide. • Enzymatic and spectrophotometric determination of thiols, and application in quality management assays of thiolic drugs, with improved performance than other instrumental alternative assays. • Quantitative analysis of ascorbic acid, in synthetic samples and drugs, using a new enzymatic and spectrophotometric assay, that offer better specifications than other optical and electrochemical assays. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Gas chromatography/Mass spectrometry Mass spectra were realized with a Mass spectrometer Agilent 5975 coupled to a gases chromatograph Agilent 7890N. Spectrofluorometric assays Fluorescence spectra were recorded in a fluorescence microplate reader GeminiTM XPS. Oxymetric assays Oxygen evolution was measured with a Clark-type electrode coupled to a Hansatech Oxygraph. Kinetic characterization of phenothiazines and phenolic substrates The oxidation of different phenothiazines and phenolic substrates by laccase from Trametes villosa (TvL), was monitored recording the absorbance of each chromophoric radical cation. Kinetic parameters as maximum absorbance (Amax), maximum square absorbance (Amax2) and the steady-state rate VSS were determined. Enzymatic biodegration of chlorophenols The biodegradation of chlorophenolic pollutants were carried out with two kind of enzymes, laccase (TvL) as the main research one, and peroxidase (SBP and HRP) to constrast the biodegradation yields of 2,4,6-trichlorophenol (TCP) and pentachlorophenol (PCP). Conclusions • The oxidation of several commercial phenothiazines with laccase has been kinetically characterized, checking the effects of many experimental variables, on the enzymatic formation and non-enzymatic breakdown, of their corresponding chromophoric radicals. • A simple, reliable and effective spectrophotometric method has been developed, for the kinetic characterization of phenolic substrates of laccase that generate unstable chromophoric products, overcoming the drawbacks of the spectrophotometric methods of the initial rate. • The use of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase (HRP) and soybean peroxidase (SBP), has demonstrated to be a great alternative for the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols, like TCP and TCP. • The process has been optimized, offering a method that is fast, effective, without hydrogen peroxide, and environmentally sustainable, overcoming other methods that use synthetic mediators, with high cost and toxicity. • The high reproducibility of the enzymatic methods with laccase to determine thiols and ascorbic acid, has shown a successful precision of these methods. • The validity of the enzymatic methods with laccase with respect to reference methods, for the determination of D-penicillamine or ascorbic acid in drugs, show their applicability to analyse real samples, especially reductant active ingredients like thiols and ascorbic acid. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.

En esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el mecanismo cinético de actuación de tirosinasa sobre distintas parejas monofenol/o-difenol. A partir de los resultados obtenidos, se puso de manifiesto que la afinidad de la enzima por oxigeno es mayor en la ruta favorecida que en la ruta lenta. Se ha demostrando cinéticamente que desoxitirosinasa existe en dos formas: relajada y tensa (mayor distancia entre los átomos de cobre). Gracias a este estudio, se han determinado dos pKas críticos en tirosinasa. En relación a la caracterización de sustratos de tirosinasa, se han desarrollado una serie de métodos de medida que han permitido caracterizar una gran variedad de o-difenoles, trifenoles, flavonoides y compuestos no fenólicos como aminas aromáticas y o-aminofenoles. Por otra parte, se han realizado estudios cinéticos sobre el proceso de inactivación suicida que sufre tirosinasa cuando actúa sobre sus sustratos proponiendo un mecanismo estructural que explica los resultados obtenidos. In this Doctoral Thesis, we have depth on the kinetic mechanism of action of tyrosinase acting on different pairs of monophenol/o-diphenol substrates. The results obtained revealed that the affinity of the enzyme for oxygen is greater in the kinetically preferred pathway than in the slow pathway. It has been demonstrated kinetically that deoxytyrosinase exists in two forms: relaxed and tense (greater distance between copper atoms). Thanks to this study, we have identified two critical pKas in tyrosinase. Relating to the characterization of tyrosinase substrates, we have developed a series of measurement methods that allow the characterization of a variety of o-diphenols, triphenols, flavonoids and non-phenolic compounds such as aromatic amines and o-aminophenols. Furthermore, kinetic studies have been conducted on the suicide inactivation process that tyrosinase suffers when acting on their substrates and a structural mechanism that explain the obtained results has been proposed.

Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral consisten en la profundización en el mecanismo de actuación e inhibición de la enzima tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa, además del establecimiento de una metodología que permita discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de la enzima. También la identificación y caracterización cinética como sustratos de algunas de las moléculas descritas como inhibidores de tirosinasa y usadas como tales en la industria cosmética y / o alimentaria. METODOLOGÍA: Ensayos espectrofotométricos, para realizar medidas de actividad monofenolasa y difenolasa de tirosinasa y estudiar su inhibición; ensayos oximétricos, para realizar medidas de actividad de tirosinasa siguiendo el consumo de oxígeno, cosustrato de la enzima; ensayos de RMN, para determinar los valores de desplazamiento químico los átomos de carbono de las moléculas de interés; ensayos de simulación, para comprobar la validez de los resultados obtenidos experimentalmente; docking computacional, para entender los modos de unión de tirosinasa a distintos ligandos; cromatografía de proteínas en FPLC, para la purificación de la tirosinasa comercial; análisis por regresión lineal y no lineal. CONCLUSIONES: Se ha establecido un diseño experimental que permite discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa de la enzima. Las medidas de actividad monofenolasa se deben realizar añadiendo al medio de reacción la cantidad de o-difenol necesaria para suprimir el periodo de retardo que aparece al inicio de los registros de actividad. Siguiendo esta metodología, se han identificado los compuestos alcohol p-hidroxibencílico, tirosol, floretina y floricina como sustratos alternativos de tirosinasa. Se han identificado como sustratos de la enzima a los compuestos 4-hexilresorcinol, descrito como inhibidor y usado en la industria cosmética y alimentaria como despigmentante y antipardeante, y oxiresveratrol, propuesto para los mismos fines debido a su ya descrito efecto inhibidor sobre esta enzima. Estas moléculas son hidroxiladas por la enzima y posteriormente oxidadas a una o-quinona que rápidamente isomeriza a una p-quinona, más estable. Además, estos sustratos han sido caracterizados cinéticamente, llegando a la obtención de los parámetros cinéticos KM (constante de Michaelis) y kcat (constante catalítica). Mediante métodos espectrofotométricos se ha identificado como sustrato de tirosinasa al ácido elágico, compuesto descrito como inhibidor y usado como despigmentante en la industria cosmética. Se ha llevado a cabo su caracterización cinética como sustrato, llegando a la obtención de los valores de KM y kcat. Se ha determinado que el ácido elágico inhibe la ruta de biosíntesis de melaninas por su efecto antioxidante, reaccionando con el anión superóxido, las o-quinonas y semiquinonas producidas durante el proceso. Se investigó el mecanismo de actuación de inhibidores análogos a sustratos fenólicos de tirosinasa, llegando a la conclusión de que aquellos que producen el mismo grado de inhibición en las actividades monofenolasa y difenolasa, se unen a las mismas especies enzimáticas en ambas actividades, siendo el tipo y las constantes de inhibición aparentes también similares. Se estableció una metodología para el estudio de inhibidores de tirosinasa y se observó que los valores de muestran una ligera dependencia de la naturaleza del sustrato, a través de las constantes k2 y k6. Finalmente, se estudió el efecto del pH en la catálisis de tirosinasa. Se propuso que un grupo con un pKa de 4.63 ± 0.04 podría ser el responsable de dicho efecto. Este grupo podría corresponder al ácido glutámico E322, que controlaría el acceso de los sustratos al sitio activo según su estado de protonación. Los protones actúan como inhibidores competitivos, uniéndose a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. El pKa de los hidroxilos fenólicos y la carga de grupo R también son importantes., The main objectives of this report are (1) to investigate further the mechanisms of action and inhibition of tyrosinase enzyme, considering the monophenolase and diphenolase activities, (2) to establish a methodology in order to distinguish phenolic inhibiting molecules from alternative substrates of the enzyme, and finally, (3) to identify and kinetically characterize as substrates some molecules described as inhibitors in the scientific literature and used as such in the cosmetic and food industries. METHODOLOGY: Spectrophotometric assays, to measure the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase and study its inhibition; oxymetric assays, to measure tyrosinase activity by following the oxygen consumption (oxygen is a cosubstrate of the enzyme); RMN assays, to determine carbon atom chemical shift values of the molecule of interest; simulation assays, to test the validity of the experimental results; computational docking, to understand the binding modes of tyrosinase with different ligands; protein chromatography in FPLC equipment, to purify commercial tyrosinase; lineal and non-lineal regression. CONCLUSIONS: An experimental design has been established which permits to distinguish inhibiting phenolic molecules from alternative substrates of tyrosinase, considering the monophenolase and diphenolase activities of the enzyme. The measurements of the monophenolase activity should be made by adding the quantity of o-diphenol, needed to abolish the lag period at the beginning of the activity recordings, to the reaction medium. The compounds p-hydroxybenzyl alcohol, tyrosol, phloretin and phloridzin have been identified as alternative substrates of tyrosinase, by following this methodology. The compounds 4-hexylresorcinol, described as inhibitor and used in the cosmetic and food industries as a depigmenting and anti-browning agent, and oxyresveratrol, proposed for the same purposes due to the described inhibitory effect on this enzyme, have been identified as tyrosinase substrates. These molecules are hydroxylated by the enzyme and subsequently oxidized to an o-quinone, which rapidly isomerizes to a more stable p-quinone. Moreover, these substrates have been kinetically characterized, obtaining the kinetic parameters KM (Michaelis constant) and kcat (catalytic constant). Ellagic acid, a compound described as inhibitor and used as a depigmenting agent in the cosmetic industry, has been identified as a tyrosinase substrate by spectrophotometric methods. Its kinetic characterization as a substrate has been carried out, obtaining the KM and kcat values. It has been determined that ellagic acid inhibits the melanin biosynthesis pathway due to its antioxidative effect, by reacting with superoxide anions, o-quinones and semiquinones produced during the process. The action mechanism of inhibitors which are analogous to phenolic substrates was studied. We concluded that those inhibitors which produce the same degree of inhibition on the monophenolase and diphenolase activities, bind to the same enzymatic species in the two activities, being the type and the apparent inhibition constants the same too. A methodology was established in order to study tyrosinase inhibitors. It was observed that values show a slight dependence on the substrate nature, through the constants k2 and k6. Finally, the pH effect on the catalysis of tyrosinase was studied. It was proposed that a group with a pKa value of 4.63 ± 0.04 might be responsible for this effect. This group could correspond to the glutamic acid E322, which would control the substrate access to the active site depending on its protonation state. Protons act as competitive inhibitors, binding to the met-tyrosinase and oxy-tyrosinase forms. The pKa value of the phenolic hydroxyl groups and the charge of the R group are important too.

Estudio de la bibliografía especializada y realización de ensayos preliminares que permitan la proposición de un mecanismo de reacción sometido a análisis cinético, que aporte expresiones útiles para un diseño experimental , aplicable para comprobar la validez del mecanismo de reacción planteado, así como para la caracterización cinética de los sistemas enzimáticos investigados, superando a otros métodos descritos en la bibliografía. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación enzimática por peroxidasas, de los colorantes Índigo Carmín (IC) y Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR), mediante un método espectrofotométrico. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de IC, por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la biodegradación de RBBR por sistemas enzima-mediador en presencia de mediadores naturales. • Caracterización cinética y optimización de la determinación de fenoles con aplicaciones biotecnológicas, mediante un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Biodegradación de IC con peroxidasas La reacción se realizó en tubos de plástico con una concentración de enzimas HRP y SBP que varió entre 2.5-30 nM , la concentración de contaminante entre 10-120 M y la de peróxido de hidrógeno también entre 10 y 120 M , todo ello a pH óptimo de 10 mM de tampón citrato de pH 5.0 y 4.0 para HRP y SBP respectivamente, a 25 ºC.Se analizaron las reacciones en el espectrofotómetro y en el HPL, determinando los parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), la velocidad en estado estacionario VSS y la constante de biodegradación (). Biodegradación de IC con sistemas lacasa/peroxidasa-mediador Se comparó el estudio a 25 ºC de SBP con el de TvL para la degradación de IC entre con los mediadores MSG, ASG, SGA y SGO con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del colorante. Biodegradación de RBBR con sistemas lacasa-mediador Se optimizaron las condiciones de reacción para la degradación de RBBR con sistemas EML a temperatura ambiente, eligiendo el sistema mediador más eficaz para dicha reacción. Bioanálisis enzimático de fenoles Se diseña y optimiza un método de análisis enzimático espectrofotométrico para el análisis de distintos tipos de fenoles industriales (fármacos, contaminantes y fitoquímicos). La reacción se realiza en presencia de AA como reductor acoplado y biomolécula detectora, catalizada por HRP. Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente y optimizado la biodegradación enzimática de IC y RBBR por H2O2, catalizada por las peroxidasas HRP y SBP, mediante un método espectrofotométrico • Se ha conseguido la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática del IC, por varios sistemas enzima-mediador (EMS). En concreto, las enzimas SBP con H2O2 y TvL con O2, en presencia del premediador natural SGO, y de los mediadores naturales, MSG, ASG y SGA. • Se ha estudiado la caracterización cinética y la optimización de la biodegradación enzimática de RBBR por TvL con O2, ante el premediador natural SGO y los mediadores naturales MSG, ASG y SGA. • Se ha desarrollado un método espectrofotométrico y ultrasensible de bioanálisis enzimático, útil para la determinación de concentraciones nanomolares, de diferentes contaminantes, fármacos y fitoquímicos fenólicos de interés biotecnológico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral., Kinetic characterization and optimization of a spectrophotometric method, for the enzymatic biodegradation by peroxidases, of the dyes Indigo Carmine (IC) and Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR). • Kinetic characterization and optimization of the IC biodegradation, by enzyme-mediator systems in the presence of natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the RBBR biodegradation, by enzyme-mediator systems with natural mediators. • Kinetic characterization and optimization of the determination of bioactive phenols, by using a spectrophotometric and ultrasensitive method of enzymatic bioanalysis. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Biodegradation of the dyes IC and RBBR by POD. This chapter describes a new ecofriendly alternative for removal Remazol Brilliant Blue (RBBR) and Indigo Carmine by soybean (SBP) and horseradish (HRP) peroxidases. Thus, studies for optimization of reaction conditions (pH, concentration of enzymes/substrates/hydrogen peroxide) have been proposed. Biodegradation of IC by enzyme-mediator systems. A reaction mechanism is proposed beside the pH results. This mechanism involves enzymatic and nonenzymatic reactions, in which a premediator (PM), mediator (M) and the mediator radical (MR) are considered. Vss values were determined from enzymes, mediator and IC effects. Thus, the assay conditions for biodegradation of IC, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Vss values were determined from enzyme, mediator and RBBR effects. The experimental data obtained confirmed the reliability of the reaction mechanism proposed. Thus, the assay conditions for biodegradation of RBBR, with the enzyme-mediator systems, were optimized. Biodegradation of RBBR by laccase-mediator systems. Remazol Brilliant Blue Royal (RBBR) biodegradation was carried out by laccase from Trametes villosa (TvL) using the natural mediators ASG, MSG, SGA and SGO Enzymatic bioanalysis of phenols. A number of analytical methods with different sensitivity, complexity, quickness and cost have been proposed The aim of this chapter is the possible determination of phenols of biotechnological interest, in nanomolar concentrations, by using an enzymatic and spectrophotometric method of bioanalysis, easy, quick and with low cost. Conclusions • It has characterized kinetically and optimized the enzymatic biodegradation of IC and RBBR by H2O2, catalyzed by the peroxidases HRP and SBP, with a spectrophotometric method. • It has reached the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of IC, by several systems enzyme-mediator (EMS). In particular, the enzyme SBP with H2O2 and TvL with O2, in presence of the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has been studied the kinetic characterization and the optimization of the enzymatic biodegradation of RBBR by TvL and O2, with the natural premediator SGO and the natural mediators MSG, ASG and SGA. • It has carried out a spectrophotometric and ultrasensible method of enzymatic biodegradation, useful for the determination of nanomolar concentrations of different phenolic contaminants, drugs and phytochemicals of biotechnological interest. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.