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We recently reported that chronic myeloid leukaemia (CML) patients harbour high levels of STAT5 when they progress to advanced phases of disease. Advanced disease is characterized by an increased incidence of BCR-ABL1 mutations. We now describe a highly significant correlation between STAT5 expression and the incidence of BCR-ABL1 mutations in primary CML. Forced expression of STAT5 in murine BCR-ABL1 transformed cells sufficed to enhance the production of reactive oxygen species (ROS) and to trigger DNA damage. STAT5-mediated ROS production is independent of JAK2 but requires concomitant BCR-ABL1 signalling as forced STAT5 expression in untransformed BCR-ABL1 negative cells has no impact on ROS levels. Only within the context of a BCR-ABL1 positive cell does STAT5 transcriptionally regulate a target gene or set of genes that causes the enhanced ROS production. Our study suggests the existence of a feed-forward loop accelerating disease progression, in which BCR-ABL1 enhances its own mutation rate in a STAT5-ROS dependent manner. This model explains the increased occurrence of inhibitor-resistant BCR-ABL1 mutations in advanced disease stages driven and characterized by high STAT5 expression.

B Zellen stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab. Ihre Entstehung ist ein stufenweiser Prozess, der hauptsächlich von Transkriptionsfaktoren gesteuert wird, deren Aufgabe zum einen darin besteht, B-Zelllinien-spezifische Gene zu aktivieren, und zum anderen, die Zugehörigkeit zur B-Zelllinie zu kontrollieren, indem weitere Entwicklungsmöglichkeiten verhindert werden. Der Transkriptionsfaktor Pax5 spielt eine Schlüsselrolle in dem transkriptionellen Netzwerk, das die Zugehörigkeit von Vorläuferzellen zur B-Zelllinie steuert. Pax5 kann sowohl B-Zell-spezifische Gene aktivieren, als auch nicht B Zell spezifische Gene hemmen. In der Abwesenheit von Pax5 ist die B Zellentwicklung im frühen pre pro B Zellstadium blockiert. Bisher ist es jedoch weitgehend unklar, durch welche Transkriptionsfaktoren die Aktivierung des Pax5 Gens beim Eintritt in das pro-B Zellstadium erfolgt. In vorherigen Arbeiten des Busslinger Labors konnten B Zell spezifische regulatorische Elemente im Pax5 Genlokus beschrieben werden, sowie verschiedene Trankriptionsfaktoren, die mit diesen Elementen interagieren. In den DNaseI hypersensitiven Stellen 6 und 7 (HS6 and HS7) des Pax5 Promotors befinden sich zwei Bindestellen für den Transkriptionsfaktor EBF1. Dies ist besonders interessant, da EBF1 epistatisch oberhalb von Pax5 agiert. Weiters sind in Ebf1–/– Vorläuferzellen die DNaseI hypersensitiven Regionen des Pax5 Promotors nicht ausgebildet, sondern mit der repressiven Histonmodifizierung H3K27me3 dekoriert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass EBF1 als Pioniertranskriptionsfaktor in der Lage ist Chromatinremodelierung hin zu einem aktiven Chromatinstatus zu steuern. Mein Interesse lag darin zu untersuchen, wie die Transkription von Pax5 durch den Verlust beider EBF1 Bindungsstellen innerhalb des Pomotors beeinflusst wird. Ich habe Targetingvektoren zur Deletion beider Bindungsstellen, einzeln und in Kombination miteinander, hergestellt. Um eventuelle Änderungen in der Pax5 Expression durch die beschriebenen Deletionen der EBF1-Bindungsstellen zu bestimmen, habe ich eine ES Zellline für homologe Rekombination verwendet, die ein IRES-humanCD2 Reportergen innerhalb der 3’ untranslatierten Region des Pax5 Gens trägt (Pax5ihCD2/+). Dadurch wird es ermöglicht, Änderungen der Pax5 Expression durch Verlust der Bindung von EBF1 an der Promotorregion in vivo in einzelnen B-Zellen zu erfassen. Die Targetingexperimente resultierten in der Herstellung von Pax5ΔEHS7/+ und Pax5ΔEHS6+7/+ Mäusen, denen entweder die EBF1-Bindungsstelle in HS7 oder beide EBF1-Bindungsstellen in HS6 und HS7 fehlen. Die Analyse der Pax5ΔEHS7/+ und Pax5ΔEHS7/ΔEHS7 Mäuse zeigte, dass die EBF1-Bindungsstelle in HS7 keinen Einfluss auf die Pax5 Expression oder die B-Zellentwicklung hat. Da die Bindung von EBF1 an die HS7 Stelle in den analysierten Mäusen zerstört wurde, komme ich zu dem Schluss, dass die Aktivität von EBF1 am Pax5 Promotor nicht alleine von der Bindung an HS7 abhängt. Allerdings, ist die Pax5 Expression (gemessen mit dem hCD2 Reporter) in den Anfangsstadien der B-Zellentwicklung im Knochenmark der Pax5ΔEHS6+7/+ und Pax5ΔEHS6+7/ΔEHS6+7 Mäuse zweifach reduziert. In reifen B Zellen hingegen ist die Pax5 Expression durch das Fehlen der zwei EBF1-Bindungsstelle nicht beeinflusst. Dies zeigt, dass die zwei EBF1-Bindungsstellen im Pax5 Promotor in Kooperation agieren, um die angemessenen Pax5 Expressionslevel vom pro-B zum unreifen B-Zellstadium aufrechtzuerhalten. Weitere Analysen sind erforderlich um festzustellen, welche Änderungen in der Promotorarchitektur, Chromatinlandschaft und Transkriptionsfaktorbindung mit der Disruption der beiden EBF1-Bindungsstellen am Pax5 Promotor einhergehen. Diese Experimente werden im letzten Kapitel der Thesis diskutiert., B cells derive from hematopoietic stem cells in a stepwise process, driven mainly by transcription factors that play an important role in activating lineage-specific genes and controlling commitment by repression of other developmental options. The transcription factor Pax5 is the key player of the transcriptional network leading to the commitment of progenitors to the B cell lineage and is involved in both suppression of lineage-inappropriate genes and activation of B cell-specific genes. In the absence of Pax5, B cell development is arrested at the early pre-pro-B cell stage. However, it is still largely unknown which transcription factors are responsible for the activation of the Pax5 gene at the onset of B cell development. Recent work from the Busslinger laboratory has identified all B cell-specific regulatory elements of the Pax5 locus and a few transcription factors that interact with these elements. Interestingly, the promoter region of Pax5 contains two EBF1-binding sites located in the DNaseI hypersensitive sites 6 and 7 (HS6 and HS7). This caught my attention since EBF1 acts genetically upstream of Pax5. Furthermore, in Ebf1¬¬–/– progenitor cells, the DNaseI hypersensitive regions of the Pax5 promoter are not formed and the repressive chromatin mark H3K27me3 is present. Based also on previous reports that identify EBF1 as a pioneer transcription factor able to drive chromatin remodeling to a transcription-permissive state, I was interested to investigate how the transcription of Pax5 is affected by removal of the two EBF1-binding sites in the gene promoter. I generated targeting vectors for deletion of either of the two sites individually or in combination. To allow comparison of the changes in the level of Pax5 expression upon the aforementioned EBF1-binding sites deletion, I targeted an ES cell line that carries an IRES humanCD2 reporter gene in the 3’ untranslated region of the Pax5 locus (Pax5ihCD2/+). This allows monitoring the changes in expression of Pax5 upon disruption of promoter binding by EBF1 in vivo at single cell resolution. Targeting experiments resulted in the generation of Pax5ΔEHS7/+ and Pax5ΔEHS6+7/+ mice that lack the EBF1-binding site in HS7 or both EBF1-binding sites in HS6 and HS7, respectively. Analysis of the Pax5ΔEHS7/+ and Pax5ΔEHS7/ΔEHS7 mice revealed no influence of the EBF1-binding site at HS7 on Pax5 expression levels or B cell development. Since EBF1 binding at this site is disrupted in the analyzed mice, I conclude that EBF1 action on the Pax5 promoter is not carried out through binding at HS7 alone. However, Pax5 expression (monitored by the hCD2 reporter) is two-fold reduced at the early stages of B cell development in the bone marrow of Pax5ΔEHS6+7/+ and Pax5ΔEHS6+7/ΔEHS6+7 mice. Notably, expression levels of Pax5 are not affected by EBF1-binding sites disruption in mature B cells. This demonstrates that the two EBF1-binding sites in the Pax5 promoter act in cooperation in order to maintain the correct expression levels of Pax5 from the pro-B cell to the immature B cell stage. Further analysis is required to identify what changes in promoter architecture, chromatin landscape, and transcription factor binding accompany the disruption of the two EBF1-binding sites in the Pax5 promoter, and these experiments are discussed in the final part of the thesis.