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Die Einzelmoleküllokalisierungsmikroskopie (single molecule localization microscopy, SMLM) umfasst eine Gruppe von stochastischen photo-schaltenden hochauflösenden Mikroskopie Methoden, z.B. PALM und STORM, bei denen Einzelmolekülpositionen mit Hilfe von Algorithmen lokalisiert werden. Eine ausreichend geringe Dichte nicht überlappender, zufällig aktiver Fluorophore wird abgebildet, um ihre Sub-Pixel-Position zu bestimmen und ein hochauflösendes Bild aus Tausenden von Bildern zu rekonstruieren. Die Lokalisierung von Einzelmolekülsignalen ermöglicht es SMLM, die Auflösungsgrenze zu durchbrechen und Einzelmolekülzentren mit einer Genauigkeit von unter 20 nm zu lokalisieren. In den vier Beiträgen dieser Arbeit habe ich SMLM und fortgeschrittene Algorithmen angewandt, um die Morphologie subzellulärer Strukturen und die räumliche Verteilung von Proteinen zu analysieren: Erstens wurde SMLM eingesetzt, um das Aktinzytoskelett von Thrombozyten in verschiedenen morphologischen Zuständen zu beobachten. Verbesserte Bildgebungspuffer ermöglichten Lokalisierungsgenauigkeiten von bis zu 12 nm. Zweitens haben wir eine Software für die vergleichende Analyse von Proteinverteilungen in einem künstlichen Modell eines Blutgerinnsels entwickelt. Die auf 3D SMLM basierende Datenanalyseplattform bestätigte die unterschiedliche Verteilung von CD41 und CD62P. Drittens verbesserte ich den Echtzeit-3D-SMLM-Lokalisierungsalgorithmus durch die Kombination der least-square Methode mit Vorlagenbildern von Einzelmolekülen. In einem letzten Beitrag habe ich eine Plattform entwickelt, die Mikrofluidik, Zweifarben-3D-SMLM und fortschrittliche Algorithmen kombiniert, um die Thrombozytenaktivierung in einem Blutgefäßchip zu untersuchen. Wir konnten eine Verbindung zwischen aktivierten Thrombozyten und gestressten Endothelzellen nachweisen, die durch maschinelles Lernen und die Analyse der mitochondrialen Morphologie ermittelt wurde. Ich habe gezeigt, dass SMLM mit fortschrittlichen Algorithmen eine detailliertere Analyse subzellulärer Prozesse, zellulärer Strukturen und der Proteinverteilung auf Nanometerebene ermöglicht. Automatisierung, Echtzeitanalyse und verbesserte Bildpuffer erhöhten die für eine präzise Nachbearbeitung erforderliche Bildqualität. Die simultane Zweifarben-SMLM hat ihren Nutzen bei der Verknüpfung von Proteinverteilungen im Nanobereich mit makroskopischen subzellulären Strukturen bewiesen., Single molecule localization microscopy (SMLM) covers a group of stochastic photo-switching microscopy methods for example PALM, and STORM, in which fluorescent signals are localized using fitting algorithms. A sufficiently low density of non-overlapping, randomly active fluorophores are imaged to determine their sub-pixel position and reconstruct a super-resolved image from thousands of images. Localization of single molecule signals allows SMLM to break the resolution limit and localize emitter centres with sub 20 nm precision. In the four contributions included in this thesis, I applied SMLM and advanced algorithms to analyse morphology of subcellular structures and spatial distribution of proteins: Firstly, SMLM was applied to observe the actin cytoskeleton of platelets at different morphological states. Improved imaging buffers allowed localisation accuracies of up to 12 nm. Secondly, we developed a software for comparative analysis of protein distributions in an artificial clot model. 3D SMLM based data analysis platform confirmed different distribution of CD41 and CD62P. Thirdly, I improved real-time 3D SMLM localization algorithm by combining the least-square approach with template images. In a final contribution, I developed a platform combing microfluidics, two-colour 3D SMLM and advanced algorithms to study platelet activation in a blood vessel chip. We showed a link between activated platelets and stressed endothelial cells determined via machine learning assisted mitochondrial morphology analysis. I demonstrated that SMLM with advanced algorithms enable a more detailed analysis of subcellular processes, cellular structures, and protein distribution at a nanometre level. Automation, real-time analysis, and improved imaging buffers increased the image quality necessary for precise post-processing. Simultaneous two-colour SMLM has proven its utility in linking nanoscale protein distributions with macroscopic subcellular structures.

Das Inositol-1,4,5-trisphosphat Rezeptor assoziierte 2 (IRAG2) wird auch als Jaw1 oder lymphoid restricted membrane protein (LRMP) bezeichnet und ist über seine C-terminale Transmembrandomäne am endoplasmatischen Retikulum (ER) verankert. Exprimiert wird IRAG2 vor allem in lymphatischen Geweben und Zellen, wie Thymus, Milz, B-Zelllinien oder T-Zelllinien, aber auch in nicht lymphatischen Organen und Zellen, wie Sinusknoten, Geschmacksknospen vom Typ süß, bitter und umami oder in Bürstenzellen des Darms. Im Rahmen dieser Arbeit wird nun auch eine Expression von IRAG2 in Thrombozyten sowie im Pankreas gezeigt. Die coiled-coil-Domäne von IRAG2 zeigt eine ausgeprägte Homologie zu der des Inositol-1,4,5-trisphosphat Rezeptor assoziierten cGMP Kinase Substrats 1 (IRAG1). Diese Domäne ist für die Interaktion von IRAG1 mit den IP₃-Rezeptoren (IP₃R) entscheidend. Eine Interaktion von IRAG2 mit dem IP₃R3 ist bereits in transfizierten COS7-Zellen beschrieben, außerdem ist eine Interaktion mit dem IP₃R2 in intestinalen Bürstenzellen gezeigt. Auch in Thrombozyten und im Pankreas kann nun in der vorliegenden Arbeit eine Interaktion von IRAG2 mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3 nachgewiesen werden. Erstmals kann damit auch die Interaktion mit dem IP₃R1 bewiesen werden. IRAG1 bildet zusammen mit der PKGIβ sowie dem IP₃R1 einen trimären Komplex. Nach Phosphorylierung durch die PKGIβ hemmt IRAG1 die Ca²⁺-Freisetzung aus dem ER und somit auch die Thrombozytenaggregation. In der vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionspartner von IRAG2 in Thrombozyten untersucht. Eine stabile Interaktion von IRAG2 und der PKGIβ wird dabei nicht nachgewiesen. Allerdings kann gezeigt werden, dass IRAG2 in Thrombozyten nach Stimulation durch cGMP-Analoga phosphoryliert wird. Da IRAG2 in Thrombozyten mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3 interagiert, wurde der Einfluss von IRAG2 auf die Ca²⁺-Freisetzung sowie die Thrombozytenaggregation untersucht. Zudem wurde die NO/cGMP-abhängige Hemmung der Thrombozytenaggregation betrachtet. Dabei zeigt sich in IRAG2-KO Thrombozyten eine signifikant verringerte Ca²⁺-Freisetzung, verglichen mit dem IRAG2-WT, was sich auch auf die Aggregabilität der Thrombozyten auswirkt. Die Thrombozyten von IRAG2-KO Tieren weisen eine verringerte Aggregationsrate auf, verglichen mit dem IRAG2-WT. Bei Stimulation mit dem cGMP-Analogon 8-pCPT-cGMP sowie dem NO-Donor SNP ist die Aggregationshemmung in den Thrombozyten der IRAG2-KO Tiere sogar noch stärker ausgeprägt als in denen der IRAG2-WT Tiere. Alle diese Daten deuten darauf hin, dass IRAG2, nach Aktivierung des NO/cGMP/PKG-Signalweges, durch die PKGI phosphoryliert wird und somit die Ca²⁺-Freisetzung aus dem ER fördert. Dies wiederum resultiert in einer verstärkten Thrombozytenaggregation. Aus diesem Grund kann IRAG2 möglichweise als der Gegenspieler zu IRAG1 in Thrombozyten angesehen werden. IRAG2 wird im Rahmen dieser Arbeit im exokrinen Pankreas im apikalen Bereich der Azinus-Zellen lokalisiert. Diese Zelltypen sind für die Sekretion von Verdauungsenzymen von Bedeutung. Im Pankreas interagiert IRAG2 mit den IP₃-Rezeptor Subtypen 1, 2 und 3, die ebenso vor allem im apikalen Teil der Azinus-Zellen exprimiert werden. In der vorliegenden Arbeit kann im IRAG2-KO eine Verringerung der Expression des IP₃R2 sowie eine Erhöhung der IP₃R3 Expression nachgewiesen werden. Die basale Ca²⁺-Freisetzung ist dabei im IRAG2-KO signifikant verringert, verglichen mit dem IRAG2-WT. Dies resultiert auch in einer verringerten basalen Amylase-Sekretion. Durch die verminderte basale Amylase-Sekretion im IRAG2-KO bleibt mehr Amylase in den zymogenen Granula der Azinus-Zellen zurück. Dies scheint jedoch weder einen signifikanten Einfluss auf die Menge der Granula noch auf die Morphologie der Azini zu haben. Die IRAG2-KO Tiere entwickeln sich auch hinsichtlich ihrer Körpergewichte annähernd normal, was letztlich zu der Annahme führt, dass es durch die verminderte basale Amylase-Sekretion zu keiner signifikanten Beeinträchtigung der Verdauung von Nahrungsbestandteilen kommt und die verringerte Amylase-Sekretion somit ausgeglichen werden kann. IRAG2 fördert damit die basale Ca²⁺ Freisetzung, möglicherweise durch eine Aktivierung der IP₃-Rezeptoren. Bei Stimulation mit Carbachol hingegen wird in den IRAG2-KO Azinus-Zellen – normalisiert auf die basale Ca²⁺-Menge – mehr Ca²⁺ freigesetzt als im IRAG2-WT. Dies könnte auf einen Kompensationsmechanismus in den IRAG2-KO Azinus-Zellen zurückzuführen sein, durch den die verringerte basale Ca²⁺-Menge ausgeglichen werden soll. Auch die Frequenz von Ca²⁺-Oszillationen ist im IRAG2-KO höher als im IRAG2-WT. Die Ursache hierfür könnte eine Modulation der IP₃-Rezeptoren durch IRAG2 sein oder aber auch ein kompensatorischer Mechanismus zum Ausgleich der verminderten basalen Ca²⁺-Freisetzung., Inositol-1,4,5-trisphosphate receptor associated 2 (IRAG2) is also known as Jaw1 or lymphoid restricted membrane protein (LRMP) and is anchored to the endoplasmic reticulum (ER) via its C-terminal transmembrane domain. IRAG2 is expressed mainly in lymphoid tissues and cells, such as thymus, spleen, B-cell or T-cell lines, but also in non-lymphoid tissues and cells, such as sinoatrial nodes, sweet, bitter and umami taste-responsive cells or intestinal tuft cells. In this work, expression of IRAG2 is shown in platelets as well as in the pancreas. IRAG2 shows a homology to inositol-1,4,5-trisphosphate receptor associated cGMP kinase substrate 1 (IRAG1), especially in its coiled-coil domain. This domain is essential for the interaction of IRAG1 with IP₃-receptors (IP₃R). Interaction of IRAG2 with IP₃R3 was previously described in COS7 heterologous expression system. Also, interaction with IP₃R2 was shown in intestinal tuft cells. In the present work it can be demonstrated, that IRAG2 interacts with the IP₃-receptor subtypes 1, 2 and 3 in platelets and in the pancreas. Thus, an interaction of IRAG2 with IP₃R1 can be demonstrated for the first time. IRAG1 forms a macro complex consisting of IRAG1, PKGIβ and IP₃R1. After phosphorylation by PKGIβ, IRAG1 inhibits Ca²⁺-release from the ER and consequently inhibits platelet aggregation. In the present work, interaction partners of IRAG2 were investigated in platelets. A stable interaction of IRAG2 and PKGIβ is not detected. However, it can be shown that IRAG2 is phosphorylated in platelets upon stimulation with cGMP-analogues. As IRAG2 interacts with the IP₃-receptor subtypes 1, 2, and 3 in platelets, the effect of IRAG2 on Ca²⁺-release and platelet aggregation was investigated. In addition, NO/cGMP-dependent inhibition of platelet aggregation was examined. Thereby, IRAG2-KO platelets show a significantly decreased Ca²⁺-release compared with platelets of IRAG2-WT, which also affects platelet aggregability. Platelets from IRAG2-KO animals exhibit a decreased aggregation rate, compared to platelets from IRAG2-WT. Upon stimulation with the cGMP-analogue 8-pCPT-cGMP or the NO donor SNP, inhibition of platelet aggregation is even more pronounced in platelets from IRAG2-KO than in those from IRAG2-WT animals. These data suggest that IRAG2 is phosphorylated by PKGI and thus promotes Ca²⁺-release from the ER upon activation of the NO/cGMP/PKG pathway, resulting in an increased platelet aggregation. Therefore, IRAG2 may be considered as a counterpart of IRAG1 in murine platelets. In this work, IRAG2 is localized in the exocrine pancreas in the apical region of the acinar cells. These pancreatic acini are important for secretion of digestive enzymes. In the pancreas, IRAG2 interacts with IP₃-receptor subtypes 1, 2, and 3, which are also expressed primarily in the apical portion of the acinar cells. In the present work, a decrease in IP₃R2 expression and an increase in IP₃R3 expression can be detected in the pancreas of IRAG2-KO animals. Thereby, basal Ca²⁺-release is significantly decreased in IRAG2-KO compared to IRAG2-WT. This also results in a decreased basal secretion of amylase. The decreased basal amylase-secretion in IRAG2-KO animals leads to a higher amount of amylase that remains in the zymogenic granules of the acinar cells. However, this does not appear to have a significant effect on either the amount of granules or the morphology of the acini. The IRAG2-KO animals also develop normally with respect to their body weights, which leads to the assumption that there is no significant impairment of nutrient digestion due to the reduced basal amylase-secretion. Hence, IRAG2 promotes basal Ca²⁺-release, possibly by activating IP₃-receptors. In contrast, when stimulated with carbachol, more Ca²⁺ is released in IRAG2-KO acinar cells – normalized to basal Ca²⁺ levels – than in IRAG2-WT cells. This might be a compensatory mechanism in IRAG2-KO acinar cells to offset decreased basal Ca²⁺-amount. The frequency of Ca²⁺-oscillations is also higher in Acini of IRAG2-KO than in those of IRAG2-WT animals. This might be caused due to modulation of IP₃-receptors by IRAG2 or could also be a compensatory mechanism to offset decreased basal Ca²⁺-release.

Das ARDS ist ein häufiges Krankheitsbild mit hoher Letalität, zu dem bisher keine kausale Therapiemöglichkeit existiert. Der Einfluss von Thrombozyten ist sehr wichtig für die Immunantwort, die PMN-Auswanderung und die inflammatorische Schädigung. Komplexe aus Thrombozyten und PMNs (PNCs) werden über multiple Bindungen aufgebaut als Reaktion auf eine Inflammation und vermitteln anschließend die inflammatorische Schädigung. Mit dem Lipopolysaccharid-Inhalationsmodell sowie dem ventilator-induced lung injury-Modell und dem Einsatz genmodifizierter Mäuse wurde die Rolle der jeweiligen Rezeptoren und der Thrombozyten entsprechend der Genese eines akuten Lungenschadens untersucht. Je nach Mauslinie wurden unterschiedliche Proteine funktionell ausgeschaltet. Es wurden jeweils Zellzahl, Zytokine (IL-6, IL-1β, TNF-α), Protein- und Myeloperoxidase-Gehalt bestimmt sowie immunhistochemische Färbungen der Lungen zum Nachweis von Plättchen Neutrophilen-Komplexen durchgeführt. In beiden Modellen zeigten sich bei den gendefizienten Tieren überwiegend verminderte Zellzahlen in der BAL sowie verminderte PNC-Anzahlen im Lungengewebe. Dies ist nach aktuellem Wissensstand mit einem verbesserten klinischen Zustand assoziiert, die untersuchten Proteine stellen sich schlussfolgernd als vermutlich schädigend dar. In Bezug auf die Zytokine zeigte sich die Konzentration des IL-1β bei vielen der gendefizienten Linien nach Schädigung signifikant erhöht, für IL-6 sowie TNF-α konnten je nach Linie signifikant erhöhte, aber teilweise auch signifikant verminderte Konzentrationen gemessen werden. Die geprüften Proteine haben demzufolge einen großen Einfluss auf Zytokinproduktion und -freisetzung. Die bisherig publizierten Studien zeichnen ein sehr inkonsistentes Bild der Rolle von Thrombozyten in der Immunantwort. Aus diesem Grund sind unsere Ergebnisse mit einigen Studien kongruent, zu anderen jedoch konträr. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit spielen Thrombozyten zusammenfassend bei der Ausbildung einer Lungenschädigung eine zentrale Rolle. Die Blockade spezieller thrombozytärer Proteine könnte eine vielversprechende Therapieoption darstellen und die Lungenschädigung vermindern. Für weitere Studien empfiehlt sich eine Kombination beider Modelle, um die multifaktorielle Genese des ARDS besser abzubilden. Die Ergebnisse dieser Studie bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen mit dem Einsatz von Antikörpern, um die Erforschung einer gezielten ARDS-Therapie weiter voranzutreiben.

Kardiovaskuläre Ereignisse sind häufig die Folge rupturierter atherosklerotischer Plaques. Dabei kommt es unter anderem zu einer Kollagen-vermittelten Thrombozytenaktiverung. Glykoprotein VI (GPVI) ist ein Kollagenrezeptor der Thrombozyten. Die vorliegende Arbeit stellt die Frage, ob sich eine Nanopartikel-basierte Applikation von GPVI auf die Thrombusbildung auswirkt. GPVI-beladene Nanopartikel wurden mit BSA-beladenen Nanopartikeln verglichen. Die Nanopartikel wurden mittels FACS und unter dem Mikroskop auf ihre Beschaffenheit und ihr Bindungsverhalten untersucht. Das Flusskammer-Modell stellte bei verschiedenen Scherraten den Einfluss auf die Thrombusbildung dar. Die ADP-initiierte Thrombusbildung wurde mit der Thrombelastografie geprüft. Mit dem impedanzaggregometrischen Verfahren wurde die durch lösliches Kollagen initiierte Thrombusbildung analysiert. Es zeigte sich, dass die Nanopartikel im FACS eine gewisse Größenvarianz aufwiesen. Die Bindung der mit GPVI beladenen Nanopartikeln wurde nach Inkubation auf Cover-Slips und unter Perfusion mikroskopisch dargestellt. In der Flusskammer zeigte sich nach Nanopartikelinkubation bei einer Scherrate von 3500 s-1 eine kleinere Gesamtthrombusfläche. Bei niedrigeren Scherraten blieb dieser Effekt aus. Lösliches GPVI hatte keinen Einfluss auf die Gesamtthrombusfläche. In Tertile unterteilt, zeigte sich in der Gruppe der größten Thromben, dass sich unter der Wirkung der Nanopartikel bei allen Scherraten kleinere Thromben bildeten. Im Thrombelastografiemodell und bei der impedanz-aggregometrischen Untersuchung hatten die Nanopartikel keinen Einfluss auf die Thrombusbildung. Unsere in vitro Ergebnisse zeigen, dass der Einfluss der Nanopartikel auf die Thrombusbildung scherratenabhängig ist. Wir können außerdem zeigen, dass die mit GPVI beladenen Nanopartikel an Kollagenstrukturen binden, wodurch sie gezielt und fokussiert wirken können. Durch Kombination der Nanopartikel mit Hemmstoffen der Thrombozytenaggregation oder der Gerinnungskaskade könnte eine lokal begrenzte Hemmung der Hämostase erfolgen. Demzufolge wäre es wichtig, in vivo die Bindung von Nanopartikeln an Gefäßstrukturen sowie die Kinetik der Nanopartikelelimination zu untersuchen.

Thrombozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Metastasenbildung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Fließinkubationssystem entwickelt, das es ermöglicht, die Wechselwirkung von A549-Tumorzellen und Thrombozyten unter laminaren Fließbedingungen quantitativ und qualitativ zu bestimmen. Dabei konnte gezeigt werden, dass Thrombozyten zunächst äußerlich an zirkulierende Tumorzellen adhärierten, um im zeitlichen Verlauf von diesen gänzlich internalisiert zu werden. Die in dieser Arbeit mittels Sphere-formation Assay gewonnen Tumorstammzellen zeichneten sich durch eine schnellere und quantitativ ausgeprägtere Interaktion mit Thrombozyten aus. P-Selektin ist maßgeblich an der Kontaktbildung zwischen Tumorzellen und Thrombozyten beteiligt. Durch den Einsatz des niedermolekularen Heparins, Tinzaparin, konnte dieses Oberflächenprotein inhibiert werden. Der hemmende Effekt auf die Wechselwirkung mit Thrombozyten war sowohl bei differenzierten Tumorzellen als auch Tumorstammzellen signifikant.

Die Versorgung traumatischer Meniskusverletzungen stellt bis heute eine Herausforderung dar. Meniskusrisse der avaskulären, zentralen Zone zeigen aufgrund ihrer schlechten Gefäßversorgung eine geringe Heilungstendenz. Die Therapie der Wahl von Meniskusrissen in der avaskulären Zone ist aktuell die partielle Meniskektomie, die jedoch das Risiko für eine Knorpelabnutzung und damit für den verfrühten Beginn einer Gonarthrose erhöht. Dieses Risiko korreliert mit der Menge an reseziertem Meniskusgewebe. Neue Behandlungsansätze zielen daher darauf ab, möglichst viel Meniskusgewebe zu erhalten und das intrinsische Reparationsvermögen des Meniskus durch heilungsfördernde Substanzen wie Thrombozyten-reiches Plasma (PrP) und mesenchymale Stromazellen (MSCs) zu verbessern. PrP wirkt sich positiv auf die Zellproliferation, die Bildung der extrazellulären Matrix und die Chemotaxis der MSCs aus. Die MSCs wirken als Reparationszellen und über die Sekretion parakrin wirkender Mediatoren. Eine wichtige Rolle bei der Angiogenese, Zellproliferation, -migration und Wundheilung spielen die Wachstumsfaktoren Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) und Plateletderived growth factor beta (PDGF-β), die sowohl im PrP als auch von den MSCs exprimiert werden. Tierexperimentelle Studien am Knochen und Gelenkknorpel belegen ein additives Heilungspotential der Kombination aus PrP und MSCs. In in vitro Versuchen wirkten sich sowohl das PrP als auch MSCs positiv auf Meniskuszellen und auf die Sekretion heilungsfördernder Wachstumsfaktoren und Zytokine aus; die kombinierte Applikation von PrP und MSCs verstärkte diese Effekte. Diese Befunde wurden partiell auch in Tierversuchen für die Heilung avaskulärer Meniskusrisse bestätigt. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, den Effekt einer Applikation von PrP und/oder MSCs auf die Heilung von Meniskusrissen in der avaskulären Zone zu untersuchen. Dabei sollte geprüft werden, wie sich die unterschiedlichen Therapien auf die makroskopische Heilung auswirken und die Anzahl VEGF-A, PDGF-β und Faktor VIII positiver Zellen als Marker der Angiogenese beeinflussen. Hierzu wurden 30 Schafe, bei denen ein longitudinaler Riss in der avaskulären Zone des Meniscus medialis gesetzt wurde, den fünf Therapiegruppen (je n =6) (1) Naht, (2) Naht + Kollagen-Scaffold, (3) Naht + Kollagen-Scaffold + PrP, (4) Naht + Kollagen-Scaffold + MSCs und (5) Naht + Kollagen-Scaffold + PrP + MSCs zugeordnet. Die kontralateralen Menisken dienten als individuelle Referenz bei den Auswertungen. Nach acht Wochen wurden die operierten und kontralateralen Menisci mediales entnommen und makroskopisch, histologisch sowie immunhistochemisch (VEGF-A, PDGF-β und Faktor VIII) untersucht. Zusätzlich wurde die relative messenger Ribonukleinsäure-(mRNA)-Expression der Wachstumsfaktoren VEGF-A und PDGF-β mit Hilfe der quantitativen real-time Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) quantifiziert. Die statistische Signifikanz der detektierten Unterschiede wurde mittels Wilcoxon-, Kruskal-Wallis- und Dunn-Test überprüft. Das Signifikanzniveau betrug p, The treatment of traumatic meniscal injuries is still posing a challenge today. Meniscal tears in the avascular, central zone show a poor tendency to heal due to their poor blood supply. The therapy of choice for lesions in the avascular zone so far has been the partial meniscectomy, which inevitably leads to a higher risk for gonarthrosis in the future. This risk correlates with the amount of resected tissue. New treatment approaches therefore aim to preserve as much meniscal tissue as possible and to improve the healing potential by adding healing promoting substances such as platelet-rich plasma (PrP) and mesenchymal stromal cells (MSCs). PrP has a positive effect on cell proliferation, the formation of extracellular matrix and chemotaxis of MSCs. MSCs act as reparation cells and through the secretion of paracrine mediators. The growth factors vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) and the platelet-derived growth factor-β (PDGF-β) expressed in PrP and in MSCs are playing a critical role in angiogenesis, cell proliferation, cell migration and wound healing. The enhanced healing potential of the combination of PrP and MSCs has already been shown in bone and cartilage repair. Animal experiments have also shown that PrP and MSCs could partially improve the repair of avascular meniscal tears. The aim of this study was to investigate the effect of PrP and/or MSCs on the healing of meniscal tears in the avascular zone. It should be examined to what extent the different therapies affect macroscopic healing and the concentrations of VEGF-A, PDGF-β and factor VIII as a marker of angiogenesis. For this purpose, a longitudinal tear was created in the avascular zone of the medial meniscus in 30 sheep. The sheep were treated in five therapy groups (n=6 each). (1) suture, (2) suture + collagen scaffold, (3) suture + collagen scaffold + PrP, (4) suture + collagen scaffold + MSCs, and (5) suture + collagen scaffold + PrP + MSCs. The contralateral meniscus served as an individual reference for evaluating the growth factors. After eight weeks the operated and the contralateral meniscus were harvested and gross healing, histology and immunohistochemistry (VEGF-A, PDGF-β and factor VIII) were examined. The relative messenger ribonucleic acid (mRNA) expression of the growth factors VEGF-A and PDGF-β was also quantified by real time polymerase chain reaction (RT-PCR). Statistical analysis was performed using Kruskal-Wallis-, Wilcoxon and Dunn-tests. Significance level was set to p

Fragestellung: Neben Ihrer Schlüsselrolle bei der Hämostase sind Thrombozyten Teil der posttraumatischen Immunantwort. Kürzlich konnten wir zeigen, dass Thrombozyten posttraumatisch mit dem adaptiven Immunsystem über eine reziproke Aktivierung von CD4+regulatorischen T Zellen [zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL]

Einleitung: Thrombozytenhochkonzentrate sind ein wertvolles, verderbliches Blutprodukt [ref:1] . Sie werden prophylaktisch eingesetzt, um das Blutungsrisiko zu verringern, oder therapeutisch, um aktive Blutungen zu behandeln. Meist bei hämatologischen und onkologischen Patienten, gefolgt [zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL]

Bei der Behandlung der koronaren Herzkrankheit konnten mit Stentimplantation und der dualen antithrombozytären Therapie mit Clopidogrel und ASS deutliche Fortschritte erzielt werden. Dennoch gibt es erhebliche Unterschiede bezüglich des Auftretens von kardiovaskulären Ereignissen nach PCI. Aus vorherigen Studien ging hervor, dass PEAR1 SNPs mit der Thrombozytenfunktion assoziiert sind. In der vorliegenden Studie wurden die PEAR1 SNPs rs12566888, rs2768759, rs41273215, rs3737224 und rs822442 bei 582 Patienten mit stabiler koronarer Herzerkrankung oder akutem Koronarsyndrom, behandelt mit PCI und dualer antithrombozytärer Therapie, untersucht. Über einen Zeitraum von 365 Tagen nach initialer PCI wurde ein Follow-up durchgeführt, wobei der primäre Endpunkt, definiert war als kombinierter Endpunkt bestehend aus Tod, Myokardinfarkt oder ischämischem Schlaganfall. Als sekundäre Endpunkte, wurden Tod, Myokardinfarkt oder ischämischer Schlaganfall beobachtet. Außerdem wurden Thrombozytenfunktionsanalysen mittels Impedanzaggregometrie durchgeführt und auf Zusammenhänge mit den verschiedenen PEAR1 SNPs untersucht. Cox Regressionsanalysen ergaben bei homozygoten PEAR1 rs2768759 Minorallelträgern ein signifikant höheres Risiko für das Auftreten eines primären Endpunktes (HR=3,16, 95% Konfidenzintervall: 1,4-7,13, p=0,006). Geschlechterspezifische Untersuchungen ergaben eine geringfügig signifikante Assoziation bei männlichen PEAR1 rs12566888 Minorallelträgern mit dem primären Endpunkt (hazard ratio, 2.12; 95% confidence interval, 1.02–4.43, p = 0.045; n = 425). Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass PEAR1 rs2768759 Träger ein signifikant höheres Risiko hatten einen der folgenden sekundären Endpunkte zu erreichen: Myokardinfarkt (p = 0.013), sowie erhöhte Sterblichkeitsrate (p = 0.051). Bei PEAR1 rs41273215 Minorallelträgern wurde eine geringere durch TRAP initiierte Thrombozytenaggregation festgestellt (75), als bei homozygoten Majorallelträgern (83, p= 0.0094). In der vorliegenden Studie wurden erstmals die Auswirkungen ausgewählter PEAR1 SNPs auf das klinische Outcome bei kardiovaskulären Patienten mit stabiler KHK oder ACS, bei denen eine PCI durchgeführt wurde und die mit einer dualen antithrombozytären Therapie behandelt wurden, untersucht.

Bei 284 Patienten mit symtomatischer KHK wurde eine erhöhte Expression von TGF-beta1 und SDF-1, CXCR4 und CXCR7 auf zirkulierenden Thrombozyten nachgewiesen. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen der Expression von TGF-beta1 und SDF-1, CXCR4 und CXCR7. Um eine mögliche positive Interaktion von TGF-beta1 mit der SDF-1/CXCR4/CXCR7 Achse in Thrombozyten nachzuweisen, wurde bei gesunden Probanden untersucht, ob die thrombozytäre Expression von SDF-1, TGF-beta1, CXCR4 und CXCR7 durch TGF-beta1 oder SDF-1 induziert werden kann. Erstmalig konnte gezeigt werden, dass bei gesunden Probanden SDF-1 über seine Rezeptoren CXCR4 und CXCR7 die Freisetzung von TGF-beta1 auf Thrombozyten in vitro stimuliert. Die SDF-1 induzierte Freisetzung von TGF-beta1 konnte durch Blockade sowohl des CXCR4 und CXCR7 gehemmt werden. Umgekehrt fanden wir keine Hinweise für eine Stimulation der thrombozytären Expression von SDF-1, CXCR4 und CXCR7 durch TGF-beta1 in vitro. Diese Ergebnisse weisen auf eine Interaktion der SDF-1/CXCR4/CXCR7 Achse und TGF-beta1 auf thrombozytärer Ebene hin.