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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas causadas por parasitos protozoários do gênero Leishmania. O controle desse complexo de doenças é crucial para a redução dos casos em humanos e cães, que são considerados os principais reservatórios urbanos do parasito Leishmania. Os métodos de diagnóstico são baseados em testes parasitológicos e imunológicos, que apresentam variável sensibilidade para a detecção de casos com baixa carga parasitária e sorologia antileishmanial, além de variável especificidade, uma vez que reações cruzadas com doenças causadas por outros Tripanossomatídeos acabam por ocorrer e dificultam assim o diagnóstico. Limitações crescentes nas estratégias quimioterápicas disponíveis e a ausência de uma vacina eficaz aprofundam a dificuldade no controle desse complexo de doenças. Portanto, novos estudos que buscam identificar antígenos mais sensíveis e específicos para o uso como diagnóstico e a pesquisa por novos agentes profiláticos são de importância. Desse modo, no presente trabalho, a proteína denominada como fator eucarioto de alongamento 1 beta de Leishmania (EF1β), que foi selecionada através de ensaios de imunoproteômica feitos usando o extrato proteico de Leishmania infantum, foi produzida sob a forma recombinante e avaliada em testes de ELISA para o diagnóstico sorológico das leishmanioses visceral canina e humana. Devido à elevada similaridade na sequência de aminoácidos da proteína no gênero Leishmania, ensaios foram também realizados para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar humana. A proteína rEF1β apresentou 100% de sensibilidade e especificidade, sendo capaz de identificar pacientes com leishmanioses visceral e tegumentar, bem como cães com a doença sintomática e assintomática, com ausência de reação cruzada significante com outras classes de soros. A proteína recombinante apresentou também excelentes resultados como marcador sorológico para o acompanhamento de pacientes após o tratamento e cura clínica da doença. Como alvo vacinal, EF1β foi administrada como vacina de DNA ou proteína recombinante associada a saponina como adjuvante em camundongos BALB/c, e os animais imunizados desenvolveram uma resposta imune do tipo Th1, caracterizada por altos níveis de IFN-γ, IL-12, GM-CSF, e anticorpos do subtipo IgG2a, antes da infecção com L. infantum. A resposta imune foi mantida após a infecção e se relacionou com reduções significativas na carga parasitária no fígado, baço, medula óssea e linfonodos dos animais imunizados, quando comparados aos resultados obtidos nos grupos controles. A vacinação com rEF1β mais saponina induziu a uma resposta Th1 mais robusta e melhor proteção parasitológica, quando comparada à vacina com DNA. Em conclusão, os resultados sugerem que a proteína EF1β pode ser considerada como um agente promissor para estudos futuros voltados para o diagnóstico e/ou candidato à vacina contra as leishmanioses. Leishmaniasis are neglected tropical diseases caused by protozoan parasites of the genus Leishmania. Controlling this complex of diseases is crucial for reducing cases in humans and dogs, which are considered the main urban reservoirs of the Leishmania parasite. Diagnostic methods are based on parasitological and immunological tests, which have variable sensitivity for detecting cases with low parasite load, in addition to variable specificity, since cross-reactions with diseases caused by other trypanosomatids are present. Growing limitations in available chemotherapy strategies and the absence of an effective vaccine deepen the difficulty in controlling leishmaniasis. Therefore, new studies that seek to identify more sensitive and specific antigens for potential use as a diagnosis and prophylactic agent are extremely important. Thus, in the present work, the protein called Leishmania elongation factor 1 beta (EF1β) was selected through immunoproteomic assay performed in Leishmania infantum protein extracts, and it was produced as recombinant antigen and tested in ELISA experiments for the serological diagnosis of canine and human visceral leishmaniasis. Due to the high similarity in the protein amino acid sequence in the Leishmania genus, assays were also performed for the diagnosis of human tegumentary leishmaniasis. The rEF1β protein showed 100% sensitivity and specificity, being able to identify patients with visceral and tegumentary leishmaniasis, as well as symptomatic and asymptomatic dogs, with no significant cross-reactivity withother serum classes. The recombinant protein also showed excellent results as a serological marker for the follow-up of patients after treatment and cure of disease. As a vaccine candidate, the antigen was administered as DNA vaccine or recombinant protein plus saponin as adjuvant in BALB/c mice, and immunized animals developed a Th1 type immune response, characterized by high levels of IFN-γ, IL-12, GM-CSF, and IgG2a subtype antibodies, before infection, which was maintained after challenge and corroborated with significant reductions in the parasite load in the liver, spleen, bone marrow and lymph nodes of the immunized animals, when compared to data obtained in the control groups. The vaccination using rEF1β plus saponin induced a more robust Th1 response and better parasitological protection, when compared to the DNA vaccine. In conclusion, results suggest that EF1β can be considered as a promising agent for diagnosis and/or as a vaccine candidate against leishmaniasis.

Background The development of new therapeutic strategies to treat patients for leishmaniasis has become a priority. The antileishmanial activity of the strychnobiflavone flavonoid was recently demonstrated against Leishmania amazonensis and Leishmania infantum amastigotes and promastigotes. The biological effect of this molecule was identified due to its capacity to interfere in the parasite mitochondrial membrane; however, the underlying molecular mechanism remains unclear. Methods and Results In this study, a computational approach using bioinformatics was performed to screen biological targets of strychnobiflavone in L. infantum. Computational programs, such as the target fishing approach and molecular docking assays, were used. Results showed that the putative pathway targeted by strychnobiflavone in L. infantum is the methylglyoxal degradation superpathway, and one hydrolase-like protein was predicted to be the molecular target of this flavonoid in the parasites. Conclusion In this context, this study provides the basis for understanding the mechanism of action of strychnobiflavone in L. infantum and presents a strategy based on bioinformatics programs to screen targets of other molecules with biological action against distinct pathogens.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico As leishmanioses são um complexo de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania. Por ser um grave problema de Saúde Pública e ainda apresentar problemas nos métodos de prevenção, diagnóstico e tratamento dos doentes; o desenvolvimento de vacinas pode se apresentar como uma medida adicional e efetiva para o controle da doença. Um grande desafio encontrado no desenvolvimento de vacinas para as leishmanioses é a baixa eficácia dos antígenos em proteger contra diferentes espécies dos parasitos, uma vez que os candidatos, geralmente, oferecem proteção espécie-específica. Dessa forma, no presente estudo, a proteína enolase de Leishmania braziliensis foi expressa e avaliada como candidata vacinal contra a infecção causada pela espécie Leishmania infantum. A proteína recombinante (rEnolase) foi avaliada em associação ao adjuvante saponina e os ensaios de imunização foram realizados em camundongos BALB/c. Três doses, com intervalos de 15 dias, foram administradas e, 30 dias após a última dose, metade dos animais dos grupos foram eutanasiados para avaliação da imunogenicidade, e a outra metade foi infectada com promastigotas em fase estacionária dos parasitos. As avaliações parasitológica e imunológica dos animais infectados foram realizadas após 10 semanas da infecção. Os resultados mostraram que a vacina induziu uma resposta imune do tipo Th1 com níveis elevados de IFN-, IL-12 e GM-CSF e uma produção de óxido nítrico pelas células fagocíticas após a estimulação in vitro com rEnolase ou usando o extrato solúvel dos parasitos, quando uma ELISA de captura e análises por citometria de fluxo foram realizadas. Os animais vacinados, quando comparados aos grupos controles, mostraram uma baixa carga parasitária no fígado, baço, medula óssea e linfonodos através das técnicas de diluição limitante e qPCR. Esses animais apresentaram baixos níveis de citocinas Th2, tais como IL-4 e IL-10, e de anticorpos do isotipo IgG1. A proteção foi também associada com a produção de IFN- por células T CD4+. Desse modo, conclui-se que a proteína recombinante enolase de L. braziliensis ofertou proteção heteróloga contra L. infantum e poderia ser considerada como um candidato vacinal contra a leishmaniose visceral. The leishmaniasis are a complex of parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania. Because it is a serious public health problem and still presents problems in the prevention and diagnosis methods, and treatment of the patients, the development of vaccines could be presented as an additional and effective measure for the control of the disease. A major challenge encountered in the development of vaccines for leishmaniasis is the low efficacy of antigens in protecting against different species of parasites, since they usually offer species-specific protection. Thus, in the present study, the enolase protein of Leishmania braziliensis was expressed and evaluated as a vaccine candidate against Leishmania infantum infection. The recombinant protein (rEnolase) was evaluated in combination with the saponin, and immunizations were performed on BALB/c mice. Three doses at 15 day intervals were administered and, 30 days after the last dose, half of the animals in the groups were euthanized for immunogenicity evaluations, and the other animals were infected with stationary-phase promastigotes of the parasites. The parasitological and immunological evaluations were performed after 10 weeks of infection. The results showed that the vaccine induced a Th1 immune response with elevated levels of IFN-γ, IL-12 and GM-CSF, and a production of nitric oxide by phagocytic cells, following the in vitro stimulation with rEnolase or using the soluble extract of the parasites, when an ELISA capture and flow cytometry were performed. The vaccinated animals, when compared to the control groups, showed a low parasite load in the liver, spleen, bone marrow and lymph nodes, through the limiting dilution and qPCR techniques. These animals also had low levels of Th2 cytokines, such as IL-4 and IL-10, and IgG1 isotype antibodies. Furthermore, the protection was associated with an IFN- production by CD4+ T cells. Thus, it is concluded that the recombinant enolase protein of L. braziliensis can offered heterologous protection against L. infantum and could well be considered as a vaccine candidate against visceral leishmaniasis.