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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28). Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011 A interação e clivagem de DNA por pequenas moléculas atraí grande atenção por parte da biotecnologia e biologia molecular, pois oferece novas ferramentas para a manipulação de ácidos nucléicos. Com esse propósito, o presente trabalho teve como objetivo investigar a interação e a clivagem de DNA (ao abrigo de luz e sob luz UV-A) por dois novos complexos de cobre(II) derivados do antibiótico tetraciclina e doxiciclina e do ligante heterocíclico 1,10-fenantrolina. Ambos os complexos Cu(dox)(phen) e Cu(tc)(phen) mostraram-se capazes de clivar DNA plasmidial em condições brandas de pH e temperatura e em concentrações na escala de micromolar, tanto ao abrigo da luz como sob luz UV-A. Nestas condições observou-se que os complexos foram capazes de provocar o surgimento de quebras-simples e também quebras-duplas na estrutura do DNA, sendo que estatisticamente, as quebras-duplas devem ser oriundas de quebras-simples não aleatórias. O mecanismo de clivagem mostrou-se dependente da geração de Espécies Reativas de Oxigênio. Os ensaios com T4 DNA ligase mostram que o DNA linearizado pelos complexos não pode ser ligado pela enzima, sugerindo também que o processo de clivagem deva ocorrer por um mecanismo oxidativo. Do ponto de vista cinético, os complexos ao abrigo de luz clivam o DNA rapidamente, diminuindo o tempo de meia-vida do DNA para menos de 20 minutos, o que sob luz UV-A, é menor que 30 segundos. Isso representa um aumento de quase 40 vezes na atividade de clivagem quando na presença de luz UV-A. Ambos os complexos mostraram depender da interação com o sulco maior do DNA para que o processo de clivagem ocorra. A titulação espectrofotométrica reforçou esta hipótese, indicando também que a constante de ligação dos complexos com o DNA é relativamente alta, embora muito menor se comparada à do brometo de etídio. Os ensaios de desnaturação térmica de DNA revelaram que os complexos ligam-se ao ácido nucléico mudando seu perfil de desnaturação em escala semelhante a de agentes não-intercalantes de DNA. Por fim, a espectroscopia de dicroísmo circular mostrou que ambos os complexos modificam a estrutura secundária do DNA, principalmente no que diz respeito ao empilhamento de bases do DNA.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 O Mycoplasma synoviae é um dos mais importantes patógenos de aves domésticas em todo o mundo, sendo o agente causador de doenças respiratórias, sinovites e doenças sistêmicas, e, por consequência, torna-se responsável por grandes perdas econômicas na produção avícola. Com a recente conclusão do sequenciamento do genoma do M. synoviae, deu-se novo impulso na realização de estudos pós-genômicos. O presente trabalho apresenta o mapa proteômico preliminar das proteínas citoplasmáticas do M. synoviae, desenvolvido utilizando a eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. Os mapas proteômicos foram realizados em duas faixas de pH (pH 4 a 7 e pH 3 a 10), e em dois tamanhos de tiras de IPG (7 cm e 13 cm). As proteínas foram identificadas utilizando espectrometria de massa MALDI/TOF e a ferramenta de busca MASCOT. Baseado na sequência genômica um total de 42 sequências codificantes de DNA (CDSs) foram identificadas, sendo que as proteínas mais abundantes foram a chaperona DnaK, o fator de elongação Tu e a tiol peroxidase. De acordo com a classificação funcional, a maioria das proteínas identificadas pertence à classe de metabolismo (39%) e à classe de armazenamento e processamento de informação (29%). Finalmente, foi realizada uma análise imunológica, na qual identificamos duas proteínas antigênicas de M. synoviae reconhecidas pelo soro de animais imunizados com esse patógeno, sendo elas a frutose-bifosfato aldolase e a proteína hipotética MS53_0025. O mapa proteômico obtido será útil como referência para outras análises de expressão protéica em M. synoviae. Mycoplasma synoviae is a major pathogen of poultry throughout the world, being the causative agent of respiratory diseases, synovitis and systemic diseases, and consequently, it is responsible for great economic losses in poultry production. Recently the sequencing of M. synoviae genome was concluded and this accomplishment has stimulated pos-genomic studies This study presents the preliminary proteomic map of citoplasmatic proteins of M. synoviae, constructed using two-dimensional gel electrophoresis in combination with mass spectrometry. The proteomic maps were produced in two pH ranges (pH 3-10 and pH 4-7), and using two different IPG strips lengths (7 cm and 13 cm). Proteins were identified using MALDI/TOF mass spectrometry and the search engine MASCOT. Based on the genome sequence of M. synoviae, a total of 42 different coding DNA sequences (CDSs) were identified. The most prominent proteins were the molecular chaperone DnaK, the elongation factor Tu and thiol peroxidase. According to the functional classification, the majority of the identified proteins belong to the class of metabolism (39%) and the class of information storage and processing (29%). Finally, we performed an immunological analysis which identified two antigenic proteins from M. synoviae recognized by sera from animals immunized with this pathogen. The proteome map obtained will be useful as reference for further analysis of protein expression in M. synoviae.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 As espécies Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma synoviae causam pneumonia em porcos e sinovite em frangos e perus, respectivamente, e em decorrência à perda de peso dos animais e susceptibilidade a infecções secundárias, essas bactérias têm causado prejuízos à suinocultura e avicultura catarinenses. Assim, o objetivo principal deste projeto foi submeter à análise proteômica amostras bacterianas ricas em proteínas de membrana, para identificação das mesmas por espectrometria de massa e construção de mapas proteômicos para as duas espécies. A identificação e caracterização de proteínas de membrana mostram-se úteis, já que essas proteínas estão envolvidas em funções celulares essenciais como transdução de sinais, osmoregulação, metabolismo e interação com hospedeiro. Os dados obtidos servirão de base para a identificação de possíveis alvos para fármacos, anticorpos monoclonais e também no auxílio em diagnósticos. Foram analisados no total, seis géis bidimensionais para cada espécie de Mycoplasma na faixa de pH 3-10, tendo duplicatas para os três detergentes utilizados: ASB14, CHAPS e SB3-10. Em relação à resolução em número de spots e número de identificações, o detergente ASB14, mostrou-se mais eficiente para M. hyopneumoniae e no total foram identificadas por espectrometria de massas 24 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). Para M. synoviae o detergente mais eficiente foi CHAPS e foram identificadas por espectrometria de massas 36 proteínas de membrana (10 proteínas distintas). Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma synoviae are causative agents of pneumonia in pigs and synovitis in chickens and turkeys, respectively. Due to the loss of animal weight and susceptibility to secondary infections, these bacteria have caused damage to pigs and poultry in Santa Catarina. Thus, the main objective of this project was to perform proteomic analysis of samples rich in bacterial membrane proteins, in order to identify them by mass spectrometry and to build proteomics maps for both species. The identification and characterization of membrane proteins is useful, since these proteins are involved in essential cellular functions such as signal transduction, osmoregulation, metabolism and interaction with host. The results obtained will help the identification of possible targets for drugs, monoclonal antibodies, and also in diagnosis. We analyzed a total of six two-dimensional gels for each species of mycoplasma in the pH range 3-10, with duplicates for the three detergents used: ASB14, CHAPS and SB3-10. Regarding gel resolution by the number of spots and the number of identifications, the detergent ASB14 was more efficient for M. hyopneumoniae and a total of 24 membrane proteins were identified by mass spectrometry (10 different proteins). For M. synoviae the detergent CHAPS was most effective and there were identified 36 membrane proteins by mass spectrometry (10 different proteins).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 As lipases são enzimas altamente versáteis que catalisam reações químicas com diversos substratos em diferentes condições e possuem características tanto bioquímicas quanto estruturais que lhes conferem resistência e termotolerância, além de serem empregadas em vários bioprocessos industriais como na produção de alimentos e biocombustíveis. A lipase de S. xylosus (AF208229) foi recentemente isolada e inicialmente caracterizada por nosso grupo de pesquisa e colaboradores. Essa proteína possui uma alta homologia e identidade estrutural com diversas outras lipases da família I.5, e apresenta atividade enzimática sobre p-nitrofenil-ésteres. Apesar de ser considerada uma enzima moderadamente termoestável e ter atividade enzimática sobre diferentes ésteres, o mecanismo de ação catalítica ainda permanece desconhecido, e principalmente, os mecanismos estruturais envolvidos em sua estabilização térmica nunca foram descritos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar bioquimicamente a lipase recombinante AF208229 de S. xylosus recentemente clonada e expressa heterologamente, e investigar os possíveis mecanismos envolvidos em sua termotolerância por meio de análises de espectroscopia de dicroísmo circular (DC). Nesse trabalho a lipase de S. xylosus (AF208229) foi expressa e purificada, submetida a ensaios enzimáticos em três temperaturas (25°C, 37°C e 42°C), e três pH (7,0 8,0 e 9,0), sua especificidade catalítica foi analisada utilizando-se diferentes p-nitrofenil-ésteres como substratos (de 2 a 18 carbonos) e sua termoestabilidade foi acompanhada durante 10, 20 e 30 minutos em 95°C. Para as análises espectroscópicas, a enzima foi submetida a um tratamento de remoção de íons (produzindo-se a apo enzima) e sua atividade enzimática e sua termotolerância foram reavaliadas. Por fim o espectro de dicroísmo circular (DC) da apo e da holo_enzima foram analisados em diferentes condições. Os resultados obtidos apresentam pela primeira vez o perfil estrutural e os mecanismos de estabilidade 8 térmica dessa lipase. O perfil de DC da holo_enzima foi avaliado nas mesmas temperaturas descritas para os ensaios enzimáticos, bem como sua capacidade de re-enovelamento. O perfil de DC e a capacidade de re-enovelamento também foram observados para a apo_enzima. O efeito dos cofatores metálicos Zn2+ e Ca2+ foram avaliados nos ensaios enzimáticos da apo_enzima, na sua termotolerância, no seu perfil de DC e na sua capacidade de re-enovelamento. Observou-se que a holo_enzima apresenta sua maior atividade em pH 9,0 e 42°C, que tem preferência por substratos de cadeias curtas (pNP-acetato, 2 carbonos) e que retem 77% de sua atividade enzimática após 10 minutos de tratamento térmico (95°C). A holo_enzima é capaz de se re-enovelar, readquirindo sua conformação estruturalmente estável e ativa. A apo_enzima também é capaz de se re-enovelar após o tratamento térmico, porém perde quase totalmente sua atividade. Observou-se que na presença do íon Zn2+ a apo_enzima se re-enovelou e reteve sua atividade enzimática. Com base nesses resultados poderia afirmar-se que a lipase de S. xylosus (AF208229) é uma metaloenzima dependente de zinco e que esse íon possivelmente localizado em um motivo estrutural rico em -hélices próximo ao ativo site. Lipases are highly versatile enzymes, which catalyze many chemical reactions with different substrates in different conditions. These enzymes have particular biochemical and structural characteristiscs which promote stability and thermal resistance. Besides, they are used by industries, i.e: food technology, detergents and biofuels. S. xylosus lipase (AF208229) was recently isolated and characterized by our group. This enzyme shares a high homology with other lipases among I.5 lipases family and has activity on p-nitrophenyl esters. Although considered a moderated thermostable lipase, its catalytic function remains unclear and its structural mechanisms for thermal stabilization have never been described. This work assessed the enzymatic activity of the recombinant lipase from S. xylosus in three different temperatures (25°C, 37°C and 42°C) and pH (7.0, 8.0 and 9.0), and the thermostability (incubation at 95°C for 10, 20 and 30 minutes). In order to investigate the mechanism involved in enzymatic activation, the enzyme was submitted to an ion removal treatment (to obtain an apo_- enzyme) and its activity and themotolerance were evaluated in the presence and absence of Zn2+ and Ca2+. The structural profile of apo-_enzyme and holo_enzyme were assessed by circular dichroism (CD) at different conditions in the presence an in the absence of metal cofactors as: Zn2+ and Ca2+. These results represent the first insights on S. xylosus lipases secondary structure and its mechanism for thermal stabilization. S. xylosus lipase (AF208229) was more active in pH 9.0, 42°C with specificity for short-chain substrates (pNP-acetate C2). In addition, this enzyme was able to maintain 77% of its activity after a thermal treatment (95°C for 10 min) and to refold to its stable conformation. apo_enzyme showed the same ability to refold as seen to holo_enzyme, but was not able to keep its activity after thermal treatment, which indicate the need of metal for its activity stabilization. Interesting, in the presence of Zn2+ the apo_enzyme was able to acquire a more stable conformation after thermal treatment and still keep residual activity. 10 These results propose that S. xylosus lipase (AF208229) is a metalloenzyme which uses Zn2+ as its metal coordinating, and the Zn2+ is possibly located in a-helical rich motif close to the active site.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica O ácido desoxirribonucléico (DNA) é alvo constante de estudo nas áreas de bioquímica, biotecnologia e biologia molecular por sua importância biológica, por isso a busca por novas ferramentas para sua manipulação torna-se necessária. Com este objetivo foram estudadas a interação e clivagem de DNA por complexos metálicos de Cu(II), Cu(acac)dppz](ClO4), [Cu(bpma)dppz](ClO4)2.0,67H2O, [Cu(diaza)dpq](ClO4).H2O e Tb(III), [Tb(tdzp)(acac)3]. Para avaliar a capacidade de clivagem dos complexos foram realizados testes com diferentes concentrações destas moléculas e na presença e ausência de luz UV-A. O mecanismo de clivagem foi avaliado pelo aumento de força iônica, adição de sequestradores de radicais livres e ligantes do sulco maior e menor do DNA às reações. Testes na presença e ausência de oxigênio também foram realizados. Os ensaios cinéticos ocorreram no abrigo e na presença de luz UV-A. Os complexos de Cu(II) foram avaliados quanto à sua interação ao CT-DNA, para tanto foram realizadas titulações espectrofotométricas do complexo na presença e ausência de CT-DNA, desnaturação térmica de CT-DNA na ausência e presença dos complexos e avaliação de alterações na estrutura do DNA na presença dos complexos por espectroscopia de dicroísmo circular. Os quatro complexos foram capazes de clivar o DNA plasmidial em concentrações micromolares em cinco minutos de reação quando fotoativados por luz UV-A. O aumento de força iônica reduziu a atividade dos complexos e o mecanismo de clivagem ocorre pela formação de espécies reativas de oxigênio e carbono-centrados. Os ensaios cinéticos revelaram tempos de meia-vida do DNA abaixo dos cinco minutos quando as reações foram fotoativadas. Os complexos de Cu(II) com ligantes dppz forneceram Kb de ~105 M-1 e o Kb para o complexo de Cu(II) com ligante dpq foi de ~104 M-1. Os três complexos de Cu(II) promoveram aumento da Tm do DNA e alterações na estrutura do CT-DNA foram observadas pelos espectros de dicroísmo circular

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia A subfamília de genes MYB R2R3 de plantas é um dos maiores grupos de fatores de transcrição descritos até hoje. Fatores de transcrição MYB R2R3 de Arabidopsis thaliana regulam uma variedade de processos incluindo respostas a fatores ambientais e a via de transdução de sinal do ácido abscísico (ABA). O Óxido Nítrico (NO) pode influenciar a atividade transcricional de uma grande variedade de genes em Arabidopsis e já foi demonstrado estar presente em plantas e envolvido na resposta a diversos tipos de estresse. O objetivo do presente trabalho foi investigar a possibilidade do NO modificar a atividade de ligação ao DNA de AtMYB2, um típico domínio MYB R2R3 de A. thaliana por uma modificação pós-traducional do seu resíduo Cys53 conservado. Nós clonamos, expressamos e purificamos o domínio MYB R2R3, um domínio mínimo ativo que compreende os resíduos 19-125 (M2D). Em ensaios de Retardamento de Migração Eletroforética a proteína M2D se liga à seqüência de DNA 5#-[A]AACC[A]-3#. Os doadores de NO, NPS e SNOG, inibiram a ligação de M2D ao DNA. De acordo com o esperado para o mecanismo de Snitrosilação da cisteína, os efeitos do NO foram revertidos por DTT. A Snitrosilação em M2D foi detectada pelo método de biotinilação. Esses resultados demonstram que a ligação de M2D ao DNA é inibida por Snitrosilação da Cys53 como conseqüência da ação do NO, estabelecendo pela primeira vez uma relação entre o estado redox e a propriedade de ligação ao DNA de um fator de transcrição MYB de plantas.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. No Brasil, a levedura Saccharomyces cerevisiae é utilizada em grande escala para a produção de álcool combustível através da fermentação de mostos (caldo-de-cana e/ou melaço) contendo altas concentrações de sacarose. Neste processo, a elevada produtividade de álcool é altamente desejável (fermentação total dos açúcares em um curto espaço de tempo), pois resulta em maior rendimento na produção industrial. A análise molecular das vias de utilização deste açúcar por S. cerevisiae tem revelado a existência de duas rotas metabólicas: a hidrólise extracelular pela ação da invertase periplasmática (produzindo glicose e frutose que são a seguir captadas e fermentadas pelas células), e outra envolvendo o transporte ativo da sacarose com a posterior hidrólise intracelular do açúcar. Entretanto, a hidrólise extracelular do dissacarídeo é indesejada, pois contribui para incrementar o estresse osmótico das células, além de que os monossacarídeos liberados no meio podem servir de fonte de carbono para microorganismos contaminantes do processo fermentativo. Com o intuito de otimizar a produção de álcool combustível, levando em conta as características do setor industrial, neste trabalho foi realizada a também análise bioquímica de leveduras dominantes isoladas a partir desse processo industrial, e comparadas com linhagens de laboratório com genótipos conhecidos e modificadas através de engenharia genômica, de forma a expressar apenas uma das vias de utilização de sacarose. Nas leveduras industriais a capacidade de fermentar a sacarose é devida à expressão da invertase periplasmática, sendo que apenas uma das linhagens industriais analisadas apresentou amplificação dos genes SUC, e conseqüente alta atividade invertase. Algumas destas linhagens industriais foram capazes de fermentar também a maltose, indicando a presença de loci MAL funcionais nestas leveduras. Os resultados indicam também que embora algumas linhagens industriais possuam o gene da permease AGT1, apenas em algumas linhagens este transportador é funcional. Por outro lado, os resultados mostram que quando o gene SUC2 foi deletado do genoma da linhagem de laboratório, as células continuaram fermentando eficientemente a sacarose, com a vantagem de não produzir glicose e frutose no meio. Nestas cepas engenhadas a sacarose é transportada diretamente para o interior da célula, onde é hidrolisada pela maltase (a?glicosidase) citoplasmática. A seguir, foram simuladas condições industriais de fermentação em batelada (altas concentrações de células e sacarose). Enquanto as linhagens industriais consumiram e fermentaram a sacarose com relativa eficiência (embora produzissem altas concentrações de glicose e frutose no meio), as leveduras modificadas sem atividade invertase não foram capazes de consumir totalmente a sacarose. Portanto, os resultados demonstram que as células de levedura são capazes de fermentar a sacarose mesmo sem atividade invertase (p.ex. pela deleção do gene SUC2), mas novos estudos ainda são necessários para otimizar a captação deste açúcar pelas células, especialmente em condições de fermentação em batelada com altas concentrações de sacarose. Acreditamos que a análise molecular das vias de utilização de sacarose por S. cerevisiae possibilitará melhorar a performance fermentativa das leveduras industriais, identificando os genes alvo para otimização via engenharia genômica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Em Saccharomyces cerevisiae, a permease codificada pelo gene AGT1 é responsável pelo transporte ativo de uma série de a-glicosídeos usados em diversas aplicações industriais de leveduras, como panificação, cervejaria, produção de bebidas destiladas e álcool combustível. O transporte destes açúcares para dentro da célula, através de proteínas transportadoras, é o passo inicial para seu metabolismo, e também constitui um fator limitante na fermentação do açúcar. Com o intuito de compreender detalhes moleculares do mecanismo de transporte e contribuir para a otimização do processo fermentativo, no presente trabalho foi analisado os resíduos de aminoácidos da permease Agt1p que poderiam estar envolvidos na ligação do próton e/ou especificidade do substrato. Analisando a estrutura prevista para o transportador Agt1p, identificamos 4 resíduos de aminoácidos carregados em seus segmentos transmembrana (Glu-120, Asp-123, Glu-167 e Arg-504), resíduos que estão significativamente conservados nas mesmas posições em outros genes de transportadores de a-glicosídeos em Saccharomyces, Torulaspora, Kluyveromyces e Candida. Permeases Agt1p mutantes nos resíduos Glu-120, Asp-123 e Arg-504 foram geradas por mutagênese sítio-dirigida, expressadas em uma cepa agt1?, e a funcionalidade das permeases foi testada através do crescimento em maltotriose. A substituição do resíduo Arg-504 pela alanina aboliu completamente a utilização de maltotriose pelas células, enquanto que as permeases mutantes geradas pela substituição do Asp-123 pela glicina ou do Glu-120 pela alanina ocasionaram menores taxas de consumo de maltotriose e menor rendimento de etanol quando comparado ao transportador Agt1p normal, porém não impediram o crescimento em maltotriose. A atividade de transporte da permease Agt1p normal ou dos mutantes derivados também foi avaliada pelo transporte de pNPaG (substrato específico para o transportador Agt1p) e pelo transporte ativo de outros a-glicosídeos (maltose, maltotriose, trealose, sacarose e a-metil glicosídeo). Nesses ensaios, a mutação R504A ocasionou a maior perda na atividade de transporte da permease, tendo em vista que apresentou taxas similares às células sem a permease Agt1p. Em contrapartida, os mutantes E120A e D123G apresentaram atividades de transporte de pNPaG e de co-transporte açúcar-H+ inferiores à observada para o transportador Agt1p normal, condizendo com o perfil de utilização de maltotriose. Apesar das diferentes atividades de transporte encontradas para as permeases construídas, todas essas permeases (normal ou mutantes) quando fusionadas à GFP em sua extremidade C-terminal apresentaram-se normalmente localizadas na membrana plasmática. Portanto, os resultados demonstram o envolvimento dos resíduos mutados no transporte ativo de açúcares realizado pela permease Agt1p, sugerindo a participação dos resíduos Glu-120 e Asp-123 na translocação do próton, e de Arg-504 na ligação do substrato. Porém, estudos ainda são necessários para melhor esclarecer o mecanismo de transporte ativo realizado pela permease Agt1p, o que certamente é de grande relevância para o desenvolvimento de estratégias que permitam a otimização dos processos fermentativos industriais.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química Foi estudada a interação de cinco complexos metálicos de Cu2+ com moléculas de DNA. Foram estudados o complexo macrocíclico Cu2BMXD, o complexo mononuclear CuMFF e os complexos binucleares Cu2L-dtb, Cu2L-H e Cu2L-NO2 (estes diferenciam-se por substituições no anel fenólico terminal do ligante). Os estudos foram feitos pela incubação com o plamídio pBSK-II em diferentes condições e presença de inibidores e ligantes específicos do DNA. A constante de ligação intrínseca dos complexos com o DNA foi determinada por titulação UV-Vis. Todos os complexos foram capazes de causar quebras no DNA. O complexo Cu2BMXD tem uma grande afinidade por DNA, sendo ativo na degradação oxidativa destas moléculas através de um ciclo catalítico que envolve a formação de Cu+ e radicais HO×. O complexo CuMFF possui menor afinidade pelo DNA, mas é capaz de clivar estas moléculas hidroliticamente. Já os complexos Cu2L-X apresentam um mecanismo misto de degradação de DNA, sendo o Cu2L-dtb o mais ativo, seguido do Cu2L-NO2 e Cu2L-H. O complexo Cu2L-dtb é o que apresenta a maior tendência de degradação oxidativa do DNA. Entretanto, para todos os complexos a via hidrolítica é aumentada com o aumento do pH. A constante de ligação intrínseca destes complexos com o DNA é menor do que para os anteriores, porém, parece ser ela a responsável pela diferença de atividade encontrada entre os complexos Cu2L-H e Cu2L-NO2.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa catarina, Centro de Ciências Biológiocas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Drogas ou moléculas que interagem com DNA e RNA, especialmente aquelas capazes de clivar ácidos nucléicos, têm sido alvo de grande interesse por servir como ferramentas em biologia molecular, bioquímica e terapêutica. Nucleases químicas são compostos sintéticos que mimetizam a ação de nucleases enzimáticas naturais e podem ser utilizadas como uma alternativa em processos bioquímicos e biotecnológicos com algumas vantagens, tais como menor tamanho, o que lhes permite ação em regiões de macromoléculas inacessíveis a enzimas, e pelo fato de que sua especificidade e eficiência podem ser moduladas. O ligante macrocíclico poliaza 3,6,9,17,10,23-hexaazatriciclo[23.3.1.111,15]triaconta-1(29),11-(30),12.14,2S(26),27-hexaeno (BMXD) foi produzido pela primeira vez em 1990. Consiste de um macrociclo formado por duas porções dietilenotriamina separadas por duas pontes fenol, capaz de coordenar um ou dois centros Cu(II) pelas porções dietilenotriamina. Foi demonstrado previamente que o ligante BMXD apresenta afinidade por ATP e é capaz de promover sua conversão em ADP e ortofosfato através de uma reação oxidativa. Coordenando um ou dois centros de zinco, o ligante BMXD é capaz de se ligar a maleato, pirofosfato e melanina e é capaz de promover a clivagem hidrolítica de BNP. É demonstrado, no presente trabalho, que o complexo Cu2BMXD é capaz de promover a clivagem oxidativa de DNA, convertendo DNA plasmidial superenovelado em DNA plasmidial circular aberto com uma velocidade de 4,67 x 10-2h-1 a 50°C em pH 7,0.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia O receptor órfão nuclear NOR-1 é um membro uma superfamília composta por um grupo de fatores de transcrição envolvidos na resposta a esteróides, ácidos graxos, ácidos retinóicos, e outras moléculas lipofílicas. A subfamília de NOR-1está implicada na proliferação celular, diferenciação, apoptose, condrosarcomas, processos inflamatórios e de aterogênese. O receptor NOR-1 é um órfão de ligante atuando sobre a transativação gênica. Até hoje, nenhum ligante é conhecido para este receptor. A estrutura tridimensional do domínio LBD homólogo, Nurr1, foi resolvida através de técnicas de cristalografia. Surpreendentemente, a estrutura não apresentou a cavidade típica de interação com ligantes, nem um sítio de ligação clássico para co-fatores. Com a finalidade de estudar estruturalmente um outro membro da subfamília NR4, dois de seus domínios AF-1 e LBD foram os focos deste trabalho, realizando-se experimentos de expressão, purificação, e análises preliminares de estrutura por UV e Dicroísmo Circular (CD). O domínio LBD de NOR-1 foi purificado com alto grau de pureza, rendendo 3 mg/litro de meio de cultivo e sua estrutura foi avaliada por UV e CD apresentando um conteúdo de a-hélices de 52 % compatível a estrutura 3D do seu homólogo Nurr1. A desnaturação térmica, monitorada por UV e CD, sugere um correto enovelamento para proteína LBD recombinante.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e matemáticas. Programa de Pós-graduação em Química Foi analisada a interação de diferentes compostos de coordenação com moléculas de DNA e proteínas. O complexo CuMFF mostrou-se efetivo na clivagem de proteínas, com dependência de temperatura, pH, concentração e tempo de incubação. A adição de captadores de radicais livres não alterou a ação deste complexo. A clivagem gerou fragmentos de tamanhos específicos, indicando especificidade na quebra das ligações peptídicas, sendo estas possivelmente dirigidas a regiões da proteína mais expostas ao solvente. O complexo RuCP apresentou atividade sobre a degradação de proteínas, embora não tenha apresentado nenhuma atividade sobre moléculas de DNA. Este complexo parece não ser tão ativo na degradação de proteínas quanto o complexo CuMFF, por outro lado, parece ser mais específico na clivagem. O complexo MACu2 não mostrou nenhuma influência sobre a atividade da enzima Taq DNA Polimerase. A série M2BMXD mostrou ser dependente do centro metálico em relação à interação com moléculas de DNA. Uma vez que o complexo Ni2BMXD foi inerte, o Zn2BMXD apresentou uma pequena interação e o Cu2BMXD foi extremamente ativo na degradação de moléculas de DNA.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Curso de Pós-Graduação em Química Neste trabalho analisou-se a atividade de clivagem do complexo metálico [Cu (C21H21N3O2)(OH2)2] ( CuMFF ) sobre o B-DNA dupla fita e circular. A clivagem do DNA mostrou-se ser dependente da temperatura, pH, força iônica e concentração deste complexo. A adição de captadores de radicais livres não alterou a fração de clivagem sobre o DNA exercida por CuMFF o que indica que possivelmente radicais livres difusos não estão envolvidos no processo de clivagem. Não houve alteração da banda a 408 nm exibida por CuMFF com a adição de DNA plasmidial o que nos leva a supor que CuMFF não é um complexo metálico que intercala na dupla hélice de DNA. Estudou-se a reação de clivagem usando-se excesso de CuMFF e então parâmetros cinéticos para a degradação do DNA foram estabelecidos. Nos experimentos de sequênciamento utilizando-se uma modificação do método de Sanger os resultados nos levam a concluir que CuMFF não exibe um padrão de clivagem específico e que portanto este reage de forma aparentemente randômica sobre a dupla hélice de DNA.