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Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis Doutorado Genética de Microorganismos Doutor em Genética e Biologia Molecular

Agradecimentos: We thank Halley Caixeta de Oliveira and Li Yang for valuable suggestions and critical reading of the article, Marc Lohse for his assistance with the MapMan annotation, Ramon Vidal for assistance with the bioinformatics, and Ricardo Silverio Machado for helping with the photosynthesis measurements. We thank the University of North Carolina High Throughput Sequencing Facility team for intense support with RNA-seq. This work was supported by the Sao Paulo Research Foundation (FAPESP, Grants 2009/51018-1, 2009/50119-9, 2006/59843-3, 2008/54527, and 2012/09136-0) Abstract: Witches' broom disease (WBD), caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is one of the most devastating diseases of Theobroma cacao, the chocolate tree. In contrast to other hemibiotrophic interactions, the WBD biotrophic stage lasts for months and is responsible for the most distinctive symptoms of the disease, which comprise drastic morphological changes in the infected shoots. Here, we used the dual RNA-seq approach to simultaneously assess the transcriptomes of cacao and M. perniciosa during their peculiar biotrophic interaction. Infection with M. perniciosa triggers massive metabolic reprogramming in the diseased tissues. Although apparently vigorous, the infected shoots are energetically expensive structures characterized by the induction of ineffective defense responses and by a clear carbon deprivation signature. Remarkably, the infection culminates in the establishment of a senescence process in the host, which signals the end of the WBD biotrophic stage. We analyzed the pathogen's transcriptome in unprecedented detail and thereby characterized the fungal nutritional and infection strategies during WBD and identified putative virulence effectors. Interestingly, M. perniciosa biotrophic mycelia develop as long-termparasites that orchestrate changes in plant metabolism to increase the availability of soluble nutrients before plant death. Collectively, our results provide unique insight into an intriguing tropical disease and advance our understanding of the development of (hemi) biotrophic plant-pathogen interactions FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP Fechado

Witches’ broom disease (WBD), caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is one of the most devastating diseases of Theobroma cacao, the chocolate tree. In contrast to other hemibiotrophic interactions, the WBD biotrophic stage lasts for months and is responsible for the most distinctive symptoms of the disease, which comprise drastic morphological changes in the infected shoots. Here, we used the dual RNA-seq approach to simultaneously assess the transcriptomes of cacao and M. perniciosa during their peculiar biotrophic interaction. Infection with M. perniciosa triggers massive metabolic reprogramming in the diseased tissues. Although apparently vigorous, the infected shoots are energetically expensive structures characterized by the induction of ineffective defense responses and by a clear carbon deprivation signature. Remarkably, the infection culminates in the establishment of a senescence process in the host, which signals the end of the WBD biotrophic stage. We analyzed the pathogen’s transcriptome in unprecedented detail and thereby characterized the fungal nutritional and infection strategies during WBD and identified putative virulence effectors. Interestingly, M. perniciosa biotrophic mycelia develop as long-term parasites that orchestrate changes in plant metabolism to increase the availability of soluble nutrients before plant death. Collectively, our results provide unique insight into an intriguing tropical disease and advance our understanding of the development of (hemi)biotrophic plant-pathogen interactions.

Plants live in biogeochemically diverse soils that harbor extraordinarily diverse microbiota. Plant organs associate intimately with a subset of these microbes; this community’s structure can be altered by soil nutrient content. Plant-associated microbes can compete with the plant and with each other for nutrients; they can also provide traits that increase plant productivity. It is unknown how the plant immune system coordinates microbial recognition with nutritional cues during microbiome assembly. We establish that a genetic network controlling phosphate stress response influences root microbiome community structure, even under non-stress phosphate conditions. We define a molecular mechanism regulating coordination between nutrition and defense in the presence of a synthetic bacterial community. We demonstrate that the master transcriptional regulators of phosphate stress response in Arabidopsis also directly repress defense, consistent with plant prioritization of nutritional stress over defense. Our work will impact efforts to define and deploy useful microbes to enhance plant performance.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Paulo José Pereira Lima Teixeira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma cultura perene de notável importância econômica mundial, sendo historicamente responsável pela geração de riquezas para o país. A produtividade da cacauicultura brasileira foi drasticamente reduzida ao longo dos anos 90, quando a doença vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, se espalhou pela principal região produtora do Brasil, o sul da Bahia. O impacto desta grave fitopatologia vem trazendo problemas de ordem econômica, social e ambiental para o país, o que torna imperativo o desenvolvimento de estratégias eficientes para o seu controle. Importantes avanços na compreensão das estratégias de patogenicidade do fungo vêm sendo alcançados com o estudo do seu genoma e investigação de dados transcriptômicos da interação M. perniciosa ¿ cacaueiro. Notavelmente, a inspeção dos dados de expressão gênica revelou que uma quitinase de M. perniciosa (Mp-chi) figura entre os genes alta e exclusivamente expressos durante a fase biotrófica da infecção do cacaueiro. Surpreendentemente, no entanto, esta proteína apresenta duas substituições de aminoácidos que presumivelmente levam à ausência de atividade quitinolítica. Tais propriedades sugeriam que a quitinase Mp-Chi não participasse do catabolismo de quitina e que, em vez disso, poderia estar envolvida em alguma função de patogenicidade. Uma vez que a proteína possui os resíduos de interação com o seu substrato (quitina) conservados, o seu papel na interação poderia estar relacionado com a ligação à quitina. A fim de esclarecer o papel funcional da Mp-Chi durante a vassoura de bruxa, a quitinase de M. perniciosa foi expressa em sistema heterólogo e submetida a testes funcionais in vitro. Os resultados obtidos indicaram que, de fato, a Mp-Chi é cataliticamente inativa. A capacidade quitinolítica da proteína é restabelecida a partir da restauração de ambos os resíduos conservados do seu domínio catalítico, o que demonstra que a ausência de atividade se deve pelo menos a essas duas substituições. Testes de afinidade a carboidratos confirmaram que a Mp-Chi é capaz de se ligar à quitina e quito-oligômeros, o que a capacitaria para agir como um fator de patogenicidade de M. perniciosa, atuando na proteção da parede celular do fungo contra enzimas hidrolíticas da planta ou na supressão da imunidade vegetal desencadeada por quitina. Utilizando plataformas experimentais modelo, os potenciais papeis da proteína no contexto da doença foram avaliados. A quitinase de M. perniciosa não exibiu capacidade protetora, mas preveniu a ativação da imunidade vegetal elicitada por quitina. Notavelmente, esta função foi abolida em uma versão mutante da proteína com afinidade reduzida à quitina, demonstrando que, de fato, a capacidade de ligação à quitina é a propriedade funcional chave para que a Mp-Chi exerça sua função de patogenicidade. Conjuntamente, os resultados obtidos confirmam que a Mp- Chi se constitui em um potencial efetor de M. perniciosa envolvido na prevenção do reconhecimento do fungo pela planta, contribuindo para o sucesso da colonização do cacaueiro por M. perniciosa. A caracterização funcional desta quitinase na doença vassoura de bruxa representa um importante passo na compreensão das estratégias de evasão de M. perniciosa contra as defesas da planta, assim como compreende uma novidade relevante para a fitopatologia. Adicionalmente à caracterização funcional da Mp-Chi, no sentido de viabilizar a realização de estudos funcionais in vivo, foi iniciado o desenvolvimento de uma metodologia para manipulação genética de M. perniciosa utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9. O vetor contendo todos os elementos necessários para a edição do genoma do fungo foi construído e permitirá a transformação do fungo. Uma vez estabelecido, o procedimento poderá ser utilizado para produção de linhagens deficientes no gene Mp-chi e inúmeros outros genes de interesse, constituindo-se em uma poderosa ferramenta para o estudo dos fatores envolvidos na patogenicidade de M. perniciosa Abstract: Cacao (Theobroma cacao) is a perrenial crop of remarkable economic importance worldwide, historically accounting for wealth to Brazil. The productivity of brazilian cacao farming suffered a drastic decrease over the 90¿s, when the witches¿s broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, spread widely throughout the major brazilian producing region, southern Bahia. The impact of this severe disease is bringing economic, social and environmental issues to the country, which makes the development of efficient management strategies a clear priority. Important progress has been achieved in understanding the pathogenicity mechanisms deployed by M. perniciosa during plant colonization through genomic and transcriptomic approaches. Remarkably, a first inspection of gene expression data revealed a fungal chitinase (Mp-chi) among the genes highly and exclusively expressed during the biotrophic stage of cacao infection. Surprisingly, though, the predicted amino acid sequence of such chitinase exhibited two substitutions (E167?Q and M238?L) in key conserved residues for enzymatic catalysis, which presumably would lead to complete absence of chitinolytic activity. Taken together, these properties suggested that the chitinase Mp-Chi, instead of participating in chitin catabolism, could be playing a role in fungal pathogenicity. Given that the residues involved in chitin binding are conserved in the protein sequence, its role in the interaction could be related to chitin binding. In order to investigate the functional role performed by Mp-Chi during WBD, the protein was expressed in heterologous system and subjected to in vitro functional assays. The results showed that Mp-Chi is indeed catalytically inactive. The enzymatic function of Mp-Chi was regained upon restoration of both conserved catalytic residues, demonstrating that the absence of chitinolytic activity is a direct consequence of these two substitutions, at least. Carbohydrate binding assays demonstrated that Mp-Chi binds chitin and chito-oligomers (GlcNAc6), which would enable the protein to act as a fungal pathogenicity tool, either protecting the fungal cell wall from hydrolytic enzymes secreted by the host plant or suppressing Chitin-Triggered Immunity. Using model experimental platforms, it was demonstrated that, although Mp-Chi does not provide protection against hydrolytic enzymes, the protein prevents the activation of Chitin-Triggered Immunity. Remarkably, the ability to circumvent Chitin- Triggered Immunity was abolished in a mutated version of the protein impaired in chitin binding, indicating that the ability to bind chitin is the key functional property for Mp-Chi to play its role in fungal pathogenicity. Collectively, the results support the role of Mp-Chi as a potential effector protein deployed by M. perniciosa to avoid recognition by the host plant, therefore contributing for successful colonization of T. cacao. The functional characterization of Mp-Chi represents an important step towards a better understanding of the evasion strategies against the host plant exploited by M. perniciosa during WBD. Also, given that a chitinase has never been implicated in such function, our findings represent a relevant novelty in modern plant pathology. In addition to the functional characterization of Mp-Chi, we started the development of a methodology for M. pernciosa genetic manipulation using the novel CRISPR/Cas9 technology. The vector containing all the elements required for genome editing has been built and will allow fungal transformation. Once established, the procedure will allow for the production of Mp-chi deficient strains and several other strains of interest, providing a powerful tool for understanding the mechanisms involved in M. perniciosa pathogenicity in vivo Mestrado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2014/06181-0

Orientador: Alessandra Alves de Souza Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As plantas apresentam receptores de membrana que são capazes de reconhecer padrões moleculares associados ao patógeno/microrganismo (PAMPs/MAMPs), os quais são cruciais para a ativação do sistema imune. O receptor EFR, restrito a família das Brassicaceae, é um dos receptores de reconhecimento de padrões (PRR) mais bem estudado. Esse receptor quinase com repetições ricas em leucina em seu domínio extracelular (LRR-RK) é capaz de perceber a proteína ET-Tu das bactérias e seu epítopo elf18. A transferência desse receptor para outras espécies revelou a possibilidade de aumentar a resistência a bacterioses em culturas como tomate, arroz, trigo e batata. Diante disso, foram desenvolvidas variedades de laranja doce superexpressando o gene EFR para conferir resistência em amplo espectro a duas das principais doenças bacterianas de citros, cancro cítrico e clorose variegada dos citros (CVC). As linhagens transgênicas foram capazes de reconhecer os peptídeos elf18Xcc e elf26Xf derivados das bactérias Xanthomonas citri e Xylella fastidiosa, respectivamente, ativando o sistema imune da planta. Além da ativação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indução de MAPK e de genes de defesa, foi possível verificar gradual aumento da resistência ao cancro cítrico e CVC em alguns eventos em comparação com o wild-type (WT). Nesse trabalho, também foram realizadas análises in silico de um candidato a receptor LRR-RK altamente expresso em Citrus reticulata (resistente a CVC). Os resultados mostraram que o receptor putativo CrLRR-RK e seu ortólogo em Citrus sinensis (espécie suscetível) codificam proteínas com domínios conservados. Contudo, existem substituições de aminoácidos entre elas que sugerem mudanças conformacionais na estrutura tridimensional das proteínas, de acordo com a predição do modelo proteico gerado pelo I-Tasser. Isso poderia explicar as diferenças no reconhecimento de patógeno por laranja doce e tangerina, sendo um indicativo de que CrLRR-RK está associado ao reconhecimento de PAMPs derivados de X. fastidiosa. Para provar essa hipótese, foram produzidas plantas de Arabidopsis expressando CrLRR-RK e receptores quiméricos entre CrLRR-RK e o receptor FLS2. Essas plantas darão suporte a estudos futuros para comprovar empiricamente a funcionalidade desse receptor e buscar por PAMPs capazes de se ligarem ao domínio extracelular da proteína. Também foram produzidas variedades comerciais de laranja doce expressando o gene CrLRR-RK na tentativa de se obter maior nível de tolerância a patógenos bacterianos de citros. Juntos, esses resultados indicam que a utilização de receptores LRR-RK é uma estratégia que possui grande potencial para aumentar a resistência em amplo espectro em citros e futuramente poderão suportar os programas de melhoramento genético Abstract: Plants employ cell surface receptors that recognize pathogen (or microbe)-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs), which are crucial for immune system activation. The EFR receptor, restrict to the Brassicaceae family, is one of the well-studied pattern recognition receptors (PRR). This leucine-rich repeat receptor kinase (LRR-RK) is capable to recognize the widely conserved bacterial PAMP EF-Tu and its derived peptide elf18. The interfamily transference of the EFR receptor revealed the possibility to increase crop disease resistance in species such as tomato, rice, wheat and potato. Here, we developed sweet orange varieties expressing EFR to confer broad-spectrum resistance, focused on the to two major citrus bacterial diseases citrus canker and citrus variegated chlorosis (CVC). The transgenic lines were able to sense elf18Xcc and elf26Xf derived peptides from Xanthomonas citri and Xylella fastidiosa, respectively, activating the immune system of the plant. A quick oxidative burst was detected, followed by MAPK activation and induction of defense marker genes. In addition, it was possible to verify a gradual increase of resistance to citrus canker and CVC and a greater capacity to control bacterial growth in some transgenic lines compared to the wild type (WT). Here, we also performed in silico analyzes of an overexpressed LRR-RK receptor on Citrus reticulata (CVC resistant). The results showed that the putative receptor CrLRR-RK and its ortholog in Citrus sinensis (susceptible species) encode conserved domain proteins. However, there are amino acid substitutions between them that led to conformational changes in the 3D structure of proteins, according to the protein model generated by I-Tasser. This would explain the differences in pathogen recognition by sweet orange and mandarin, indicating that CrLRR-RK is associated with the recognition of X. fastidiosa-derived PAMPs. To prove this hypothesis, Arabidopsis plants expressing CrLRR-RK and chimeric receptors between CrLRR-RK and the FLS2 receptor were produced. These plants will support future studies to empirically prove the receptor functionality and seek for PAMPs capable of binding in the extracellular domain. We also produced commercial varieties of sweet orange expressing the CrLRR-RK gene in order to obtain a higher level of tolerance against citrus bacterial pathogens. Together, these results indicate that the use of LRR-RK receptors is a strategy that has great potential for increasing broad-spectrum resistance in citrus and hereafter support breeding programs Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES CNPQ 208406/2017; 142014/2015-0