Search

El metabolisme embrionari s’ha relacionat amb la viabilitat embrionària, fet que suggereix el seu us per a ajudar en la selecció d’embrions d’alta qualitat en tecnologies de reproducció assistida (TRA). Malgrat els nous avenços per avaluar el metabolisme dels oòcits i embrions per determinar-ne la qualitat, encara falten mètodes per mesurar de manera no invasiva i robusta l’estat metabòlic. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) és una tècnica d’imatge no invasiva capaç de mesurar l’estat metabòlic de les cèl·lules. FLIM mesura l’autofluorescència del dinucleòtid de nicotinamida adenina (fosfat) (NAD(P)H) i el dinucleòtid de flavina adenina (FAD+), coenzims intracel·lulars essencials per a diversos processos metabòlics. FLIM permet mesurar no només la intensitat de fluorescència d’aquestes molècules, que es correlaciona amb la seva concentració, sinó també la vida mitja dels coenzims, que proporciona informació sobre la unió enzimàtica. Una imatge de FLIM produeix 9 paràmetres quantitatius que permeten la caracterització l’estat metabòlic cel·lular. Juntament amb FLIM, també es pot obtenir second harmònic generation (SHG), una tècnica que permet l’obtenció imatges d’estructures polaritzades com el fus mitòtic. El primer estudi d’aquesta tesi te com a objectiu explorar la viabilitat, sensibilitat i seguretat de les tècniques FLIM i SHG per ser utilitzades per a l’avaluació d’oòcits i embrions de ratolí. Aquest estudi ha demostrat que FLIM en combinació amb SHG permet detectar canvis metabòlics significatius durant el desenvolupament embrionari de ratolí o canvis en l’estat metabòlic causats per pertorbacions metabòliques, sense afectar el desenvolupament embrionari. La cooperació metabòlica entre els oòcits i les cèl·lules del cúmul que l’envolten és essencial per al correcte desenvolupament d’oòcits i embrions. L’objectiu del segon estudi era determinar si FLIM podia detectar diferències en l’estat metabòlic de cèl·lules del cúmul humanes. FLIM permet mesures quantitatives de l’estat metabòlic de les cèl·lules del cúmul i detecta variacions entre diferents grups de cèl·lules del cúmul, amb una major variació entre els grups de cèl·lules de cada pacient que entre pacients. A més, hem pogut observar associacions entre els paràmetres metabòlics de les cèl·lules del cúmul i l’edat del pacient i els nivells d’hormones anti Mulleriana, però no amb l’IMC. També s’han trobat variacions entre cèl·lules del cúmul que embolcallen oòcits madurs o immadurs, indicant la possible utilització d’aquesta tècnica com a mètode d’avaluació oocitària. Els embrions de mamífer experimenten variacions en el metabolisme al llarg del seu desenvolupament preimplantacional. Aquest metabolisme s’ha relacionat amb la viabilitat embrionària, fet que suggereix el seu possible ús per a seleccionar embrions d’alta qualitat en TRA. No obstant, el metabolisme dels embrions humans encara no està completament caracteritzat, probablement a causa de la manca de mètodes no invasius per mesurar el seu estat metabòlic. El tercer estudi s’ha enfocat a determinar si la tècnica no invasiva FLIM detecta variacions en els perfils metabòlics de blastocists humans donats per recerca. S’han observat grans canvis en l’estat metabòlic en el desenvolupament en 36 hores, associats al dia des de la fecundació de l’embrió o al seu estat de desenvolupament del blastocist. Hem pogut observar una significativa heterogeneïtat metabòlica dins dels mateixos blastocists, concretament entre la massa cel·lular interna i el trofectoderm, i entre les parts de blastocists en eclosió dins i fora de la zona pel·lúcida. Aquests resultats demostren encara més que el metabolisme embrionari pre-implantacional es altament dinàmic i plàstic. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi presenten que FLIM en combinació amb SHG pot proporcionar informació detallada i biològicament rellevant d’oòcits, embrions i cèl·lules del cúmul. Aquests nous enfocaments son prometedors per ajudar en l’avaluació de la qualitat oocitària i embrionària mitjançant mesures quantitatives no invasives del seu metabolisme i morfologia del fus mitòtic o meiòtic. El metabolismo embrionario se ha relacionado con la viabilidad embrionaria, lo que sugiere su utilización para ayudar en la selección de embriones de alta calidad en tecnologías de reproducción asistida (TRA). A pesar de nuevos avances en técnicas de evaluación el metabolismo de ovocitos y embriones para determinar su calidad, todavía faltan métodos para medir de forma no invasiva y robusta el estado metabólico. La fluorescencia lifetime imaging microscopy (FLIM) es una técnica de imagen no invasiva capaz de medir el estado metabólico celular. FLIM mide la autofluorescencia del dinucleótido de nicotinamida adenina (fosfato) (NAD(P)H) y el dinucleótido de flavina adenina (FAD+), coenzimas intracelulares esenciales para varios procesos metabólicos. FLIM permite medir la intensidad de fluorescencia de estas moléculas, que se correlaciona con su concentración, y también la vida media de las coenzimas, proporcionando información sobre la unión con enzimas. Una imagen de FLIM produce 9 parámetros cuantitativos que permiten la caracterización del estado metabólico celular. Junto con FLIM, se puede obtener second harmonic generation (SHG), una técnica que permite la obtención imágenes de estructuras polarizadas como el huso mitótico. El primer estudio de esta tesis tiene como objetivo explorar la viabilidad, sensibilidad y seguridad de las técnicas FLIM y SHG para ser utilizadas en la evaluación de ovocitos y embriones. Este estudio ha demostrado que FLIM en combinación con SHG puede detectar cambios significativos en el metabolismo durante el desarrollo embrionario de ratón o cambios causados por perturbaciones metabólicas, sin perjudicar el desarrollo embrionario. La cooperación metabólica entre los ovocitos y las células del cúmulo (CC) que le rodean es esencial para el desarrollo correcto de ovocitos y embriones. El objetivo del segundo estudio era determinar si FLIM podía detectar diferencias en el estado metabólico entre grupos de CC humanas. FLIM permite medidas cuantitativas del estado metabólico de las CC y detecta variaciones entre distintos grupos de CC, con una mayor variación entre grupos de células de cada paciente que entre pacientes. Además, hemos observado asociaciones entre los parámetros metabólicos de las CC y la edad del paciente y los niveles de hormonas anti Mulleriana, pero no con el IMC. También se han encontrado variaciones entre CC que rodean ovocitos maduros o inmaduros, indicando la posible utilización de esta técnica como método de evaluación ovocitária. Los embriones de mamífero experimentan variaciones en el metabolismo a lo largo de su desarrollo preimplantacional. Este metabolismo se ha relacionado con la viabilidad embrionaria, lo que sugiere su posible uso para seleccionar embriones de alta calidad en TRA. Sin embargo, el metabolismo de los embriones humanos todavía no está completamente caracterizado. El tercer estudio se ha enfocado a determinar si la técnica no invasiva FLIM puede detectar variaciones en los perfiles metabólicos de los blastocitos humanos donados para investigación. Hemos observado grandes cambios en el estado metabólico de los blastocitos humanos durante su desarrollo en 36 horas, cambios en el estado metabólico asociados al día desde la fecundación del embrión y a su estado de desarrollo del blastocito. Hemos podido observar una significativa heterogeneidad metabólica dentro de los propios blastocitos, concretamente entre la masa celular interna y el trofectodermo, y entre las partes de blastocitos en eclosión dentro y fuera de la zona pelúcida. Estos resultados demuestran aún más que el metabolismo embrionario preimplantacional es altamente dinámico y plástico. En conjunto, los resultados de esta tesis presentan que FLIM en combinación con SHG pueden proporcionar información detallada y biológicamente relevante de ovocitos, embriones y CC. Estos nuevos enfoques son prometedores para ayudar en la evaluación de la calidad oocitária y embrionaria mediante medidas cuantitativas no invasivas de su metabolismo y morfología del huso mitótico y meiótico. Embryo metabolism has long been linked to embryo viability, suggesting its potential utility to aid in selecting high quality embryos in assisted reproductive technologies (ART). Despite new advances to assess oocyte and embryo metabolism to determine their quality, non-invasive methods to robustly measure metabolic state are still lacking. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is a non-invasive method for measuring the metabolic state of cells. FLIM measures the autofluorescence of nicotinamide adenine (phosphate) dinucleotide (NAD(P)H) and flavine adenine dinucleotide (FAD+), intracellular coenzymes essential for cellular respiration and glycolysis. FLIM enables measures of not only the fluorescence intensity of these molecules, which correlates with their concentration, but also the fluorescence lifetimes, that provides information on enzyme engagement. A metabolic measurement produces 9 quantitative parameters for characterizing the metabolic state of cells. Along with FLIM, second harmonic generation (SHG), which allows imaging of polarized structures such as the spindle, can also be obtained. The first study of this thesis aimed to explore the feasibility, sensitivity, and safety of FLIM and SHG to be used for oocyte and embryo assessment. This study showed that FLIM in combination with SHG can detect sensitively meaningful changes in metabolism through mouse embryo development. FLIM detected changes in the metabolic state due to metabolic perturbations and does not significantly impair mouse embryo development. Metabolic cooperativity between the oocytes and its surrounding cumulus cells is essential for correct oocyte and embryo development. The aim of the second study was to determine whether FLIM could detect differences in the metabolic state among human cumulus cell clusters. FLIM enabled quantitative measurements of the metabolic state of cumulus cells and detected variations between clusters, with greater variance among clusters from each patient than between patients. Additionally, cumulus cell metabolic parameters were associated with patient age and anti-Mullerian hormone levels, but not with BMI. Variations between cumulus cells associated with mature and immature oocytes were also found, suggesting the potential utility of this technique in ART assessments. Mammalian embryos undergo variations in metabolism over the course of preimplantation development. Embryo metabolism has long been linked to embryo viability, suggesting its potential use in selecting high quality embryos in ART. Nonetheless, the metabolism of human embryos is not fully characterized yet, probably due to a lack of non-invasive methods to measure their metabolic state. The third study sought to determine whether non-invasive FLIM could detect variations in metabolic profiles of human discarded blastocysts. FLIM revealed extensive changes in the metabolic state of discarded human blastocysts associated with blastocyst development over 36h, the day after fertilization and blastocyst developmental stage. Significant metabolic heterogeneity was observed within individual blastocysts, between the inner cell mass and the trophectoderm, and between the portions of hatching blastocysts within and without the zona pellucida. These results further demonstrate the highly dynamic and plastic metabolism of preimplantation embryos and the potential utility of measures of metabolic state to aid in embryo selection in ART. This thesis has sought to deepen the knowledge of non-invasive assessments of oocyte, cumulus cell and embryo metabolism. Taken together, the results of the present thesis present that FLIM in combination with SHG can provide detailed biologically relevant information and could be promising approaches to assess oocyte and embryo developmental competency through non-invasive quantitative measures of their metabolism and spindle morphology. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia Cel·lular