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La douleur est un problème de santé publique majeur puisqu'elle touche 20 % de la population mondiale. Les traitements actuels procurent souvent un soulagement limité et sont associés à des effets secondaires. Il y a donc un besoin urgent de meilleurs traitements contre la douleur. La douleur résulte de l'activation d'un sous-ensemble de neurones somatosensoriels appelés nocicepteurs qui sont spécialisés pour détecter les stimuli potentiellement douloureux. Prdm12 est un régulateur épigénétique sélectivement exprimé dans les nocicepteurs dans le système nerveux en développement dont la mutation provoque une insensibilité congénitale à la douleur, une maladie génétique rare caractérisée par l'incapacité à ressentir la douleur. Au cours des années précédentes, notre laboratoire a montré que Prdm12 est nécessaire durant la neurogenèse sensorielle pour la génération du lignage nociceptif. L’expression de Prdm12 est maintenue dans les nocicepteurs matures suggérant un rôle fonctionnel potentiel chez l'adulte. Nos résultats ont montré que la perte de Prdm12 dans les nocicepteurs matures provoquait une dérégulation des gènes codant pour des récepteurs et des canaux ioniques impliqués dans la nociception, modifie l'excitabilité neuronale ainsi que les réponses comportementales à la formaline et à la capsaïcine. En conclusion, nos données ont montré que Prdm12 exerce également une influence sur le bon fonctionnement des nocicepteurs chez la souris adulte.Pain is a major health burden as it affects 20% of the worldwide population. Current therapies often provide limited relief and are associated with side effects. There is thus an urgent need for better analgesics. Pain results from the activation of a subset of somatosensory neurons called nociceptors that are specialized to detect potentially painful stimuli. Prdm12 is an epigenetic regulator selectively expressed in nociceptors in the developing peripheral nervous system whose mutation causes congenital insensitivity to pa, Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ribosomes are essential nanomachines responsible for protein production. Although ribosomes are present in every living cell, ribosome biogenesis dysfunction diseases, called ribosomopathies, impact particular tissues specifically. Here, we evaluate the importance of the box C/D snoRNA-associated ribosomal RNA methyltransferase fibrillarin (Fbl) in the early embryonic development of Xenopus laevis .We report that in developing embryos, the neural plate, neural crest cells (NCCs), and NCC derivatives are rich in fbl transcripts. Fbl knockdown leads to striking morphological defects affecting the eyes and craniofacial skeleton, due to lack of NCC survival caused by massive p53-dependent apoptosis. Fbl is required for efficient pre-rRNA processing and 18S rRNA production, which explains the early developmental defects. Using RiboMethSeq, we systematically reinvestigated ribosomal RNA 2’-O methylation in X .laevis ,confirming all 89 previously mapped sites and identifying 15 novel putative positions in 18S and 28S rRNA. Twenty-three positions, including 10 of the new ones, were validated orthogonally by low dNTP primer extension. Bioinformatic screening of the X .laevis transcriptome revealed candidate box C/D snoRNAs for all methylated positions. Mapping of 2’-O methylation at six developmental stages in individual embryos indicated a trend towards reduced methylation at specific positions during development. We conclude that fibrillarin knockdown in early Xenopus embryos causes reduced production of functional ribosomal subunits, thus impairing NCC formation and migration., SCOPUS: ar.j, info:eu-repo/semantics/published

Background: The skeleton is the first and most common distant metastatic site for breast cancer. Such metastases complicate cancer management, inducing considerable morbidities and decreasing patient survival. Osteomimetism is part of the complex process of osteotropism of breast cancer cells. Recent data indicate that Farnesoid X Receptor (FXR) is involved in the transformation and progression of breast cancer. Methods: The expression of FXR, Runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone proteins were evaluated on two tumor cell lines (MCF-7 and MDA-MB-231) by immunohistochemistry, immunofluorescence and western blotting and quantified. Results: In a series of 81 breast cancer patients who developed distant metastases, we found a strong correlation between FXR expression in primary breast tumors and the development of bone metastases, especially in patients with histological grade 3 tumors. In in vitro studies, FXR activation by Chenodeoxycholic acid (CDCA) increased the expression of numerous bone proteins. FXR inhibition by lithocholic acid and z-guggulsterone decreased bone protein expression. Short Hairpin RNA (ShRNA) against FXR validated the involvement of FXR in the osteomimetism of breast cancer cells. Conclusion: Our experimental results point to a relationship between the expression of FXR in breast cancer cells and the propensity of these tumor cells to develop bone metastases. FXR induces the expression of RUNX2 which itself causes the synthesis of bone proteins by tumor cells., SCOPUS: ar.j, info:eu-repo/semantics/published

Ribosomes are cellular nanomachines responsible for protein production in all living cells. When ribosome biogenesis is compromised, or ribosome function unfaithful, it causes diseases called ribosomopathies. The primary goal of my PhD was to understand the consequences of ribosome biogenesis dysfunction on translation. I have contributed to this understanding through four different projects which were aimed to understand how ribosome function affects the different steps of protein translation in the cell. In my first project, we tested if a ribosomal RNA sugar methylation present on the large ribosomal subunit plays a role in translation. We found that the loss of the modification does not grossly inhibit ribosome production or growth. However, these mutants are resistance towards G418, and make fewer decoding errors as compared to the control cells. In my second project, I studied a methyltransferase called Mtq2, which methylates the translation termination release factor eRF1. We found that Mtq2 is directly involved in late steps of large ribosomal subunit maturation and that the catalytic activity of Mtq2 is required for efficient 60S subunit production and for pre-60S export. In project 3, I studied a natural, plant-derived alkaloid called haemanthamine (HAE). We showed that HAE binds the peptidyl transferase center of the large subunit of the eukaryotic ribosome, where it interacts with the 25S rRNA. We also showed that HAE inhibit early stages of pre-rRNA processing and elicit nucleolar stress response in the cells. In project 4, I studied a long non-coding RNA called SAMMSON. SAMMSON plays a crucial role in melanoma survival. We found that depletion of SAMMSON adversely affects ribosome biogenesis. We also demonstrated that by modulating the binding affinity of a single protein, namely CARF, SAMMSON rewires the RNA-protein network and promotes a synchronized increase in rRNA maturation both in the cytosol and mitochondria, thereby boosting translation in bot, Les ribosomes sont des nanomachines cellulaires responsables de la production de protéines dans toutes les cellules vivantes. Lorsque la biogenèse des ribosomes est compromise ou que la fonction des ribosomes est infidèle, elle provoque des maladies appelées ribosomopathies. L'objectif principal de ma thèse était de comprendre les conséquences du dysfonctionnement de la biogenèse des ribosomes sur la traduction. J'ai contribué à cette compréhension par le biais de quatre projets différents visant à comprendre comment la fonction des ribosomes affecte les différentes étapes de la traduction des protéines dans la cellule. Dans mon premier projet, nous avons voulu determiner si une méthylation sur l’ARN ribosomique d’un sucre présente sur la grande sous-unité ribosomique joue un rôle dans la traduction. Nous avons constaté que la perte de cette modification n'inhibait pas grossièrement la production ou la croissance des ribosomes. Cependant, ces mutants sont résistants à G418 et font moins d’erreurs de décodage par rapport aux cellules contrôles. Dans mon deuxième projet, j'ai étudié une méthyltransférase appelée Mtq2, qui méthyle le facteur de libération de la terminaison de la traduction, eRF1. Nous avons constaté que Mtq2 est directement impliqué dans les dernières étapes de la maturation des grandes sous-unités ribosomiques et que l'activité catalytique de Mtq2 est nécessaire pour une production efficace de sous-unités 60S et pour une exportation antérieure à 60S. Dans le cadre du projet 3, j'ai étudié un alcaloïde naturel d'origine végétale appelé hémanthamine (HAE). Nous avons montré que HAE lie le centre de la peptidyl transférase de la grande sous-unité du ribosome eucaryote, où il interagit avec l'ARNr 25S. Nous avons également montré que HAE inhibe les stades précoces du traitement pré-ARNr et induit une réponse au stress nucléolaire dans les cellules. Dans le projet 4, j'ai étudié un long ARN non codant appelé SAMMSON. SAMMSON joue un rôle crucial dans la su, Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les ribosomes sont des complexes ribonucéoprotéiques responsables de la traduction de l’information génétique. Ces nanomachines sont essentielles pour la viabilité cellulaire. Une perturbation de la synthèse ou de la fonction des ribosomes va engendrer des pathologies humaines nommées ribosomopathies. La première partie de mon travail a permis une meilleure compréhension des ribosomopathies au travers l’étude de la Fibrillarine (FBL), une 2’-O-méthyltrasnférase responsable de la modification des ARNr, au cours du développement chez le Xénope. Grâce à cette étude, j’ai proposé un modèle avec des évidences démontrant que les ribosomes sont distribués de manière asymétrique au sein des différents tissus, apportant un complément d’information sur la spécificité des manifestations cliniques retrouvées dans les ribosomopathies. Dans la seconde partie de ma thèse, j’ai cartographié les sites 2’-O-méthylés durant le développement, en utilisant une nouvelle méthode quantitative, le Ribometh Sequencing. Elle a permis de mettre en évidence l’existence de ribosomes spécialisés, jouant un rôle vital durant le développement embryonnaire.Ribosomes are ribonucleoprotein complexes responsible for translating genetic information. These nanomachines are essential for cell viability. A disruption in synthesis or function of ribosomes leads to human pathologies called ribosomopathies. The first part of my work provides a better understanding of the ribosomopathies through the study of Fibrillarin (FBL), a 2’-O-methyltransferase, responsible of rRNA modification, during the development of Xenopus. Herein, I proposed the model and provided evidences that there is an asymmetric distribution of ribosomes among tissues, which is the reason why only certain tissues or organs are strongly affected in ribosomopathies. In the second part of my thesis, I mapped 2’-O- ribose methylation sites during development, using a new quantitative method, called Ribometh Sequencing. This study highlights the, Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dietary restriction (DR) is a metabolic intervention that extends the lifespan of multiple species, including yeast, flies, nematodes, rodents, and, arguably, rhesus monkeys and humans. Hallmarks of lifelong DR are reductions in body size, fecundity, and fat accumulation, as well as slower development. We have identified atx-2,theCaenorhabditis elegans homolog of the human ATXN2L and ATXN2 genes, as the regulator of these multiple DR phenotypes. Down-regulation of atx-2 increases the body size, cell size, and fat content of dietary-restricted animals and speeds animal development, whereas overexpression of atx-2 is sufficient to reduce the body size and brood size of wild-type animals. atx-2 regulates the mechanistic target of rapamycin (mTOR) pathway, downstream of AMP-activated protein kinase (AMPK) and upstream of ribosomal protein S6 kinase and mTOR complex 1 (TORC1), by its direct association with Rab GDP dissociation inhibitor β, which likely regulates RHEB shuttling between GDP-bound and GTP-bound forms. Taken together, this work identifies a previously unknown mechanism regulating multiple aspects of DR, as well as unknown regulators of the mTOR pathway. They also extend our understanding of diet-dependent growth retardation, and offers a potential mechanism to treat obesity., SCOPUS: cp.j, info:eu-repo/semantics/published

Nuclear pore complexes (NPCs) are embedded in the nuclear envelope (NE) and composed of proteins called nucleoporins. NPCs as such control the bidirectional traffic of proteins and RNAs between the nucleus and the cytoplasm in eukaryotic cells whereas individual nucleoporins were found to be implicated in other cellular processes such as, cell division, kinetochore assembly, gene expression and cell migration. A prime example for nucleoporin functional versatility can be seen in Nup153. Nup153 is since its discovery known to be a central player in nucleocytoplasmic transport, but additionally participates directly or indirectly, for example, in gene expression and cell cycle control. In this context, it was previously shown that altered levels of Nup153 led to mitotic abnormalities, particularly in cytokinesis and in the spindle assembly checkpoint (SAC). The SAC promotes accurate chromosome separation to ensure the faithful segregation of genetic material to daughter cells. Nup153 was found to interact with the SAC protein Mad1. In the present study, we have further dissected the interaction between Nup153 and Mad1 and investigated the function of the Nup153-Mad1 complex in human cells. By using the high resolution imaging technique “in situ proximity ligation assay”, we found that Nup153 and Mad1 interact with each other exclusively in the presence of a NE, from late mitosis to prophase. By in vitro binding assays, we have confirmed the direct interaction between Nup153 and Mad1 and furthermore identified two independent Nup153-binding sites in Mad1. We have also provided some evidence that Nup153 interacts also with SUMO-modified Mad1.It was previously shown that depletion of Nup153 had no obvious effect on Mad1 and SAC activity. In the present study, we have shown by time-lapse imaging microscopy that the depletion of Mad1 led to a delayed recruitment of Nup153 at the reforming NE during anaphase in living cells, which was often accompanied by a prolongation of, Les pores nucléaires sont des structures enchâssées dans l’enveloppe nucléaire et composées de protéines appelées les nucléoporines. Ces pores nucléaires contrôlent le trafic bidirectionnel des protéines et des ARNs entre le noyau et le cytoplasme dans les cellules eucaryotes tandis que les nucléoporines individuelles sont également impliquées dans d’autres processus cellulaires tels que la division cellulaire, l’assemblage des kinétochores, l’expression génétique et la migration cellulaire. Un exemple primordial de la versatilité fonctionnelle des nucléoporines peut être observé à travers Nup153. Depuis sa découverte, Nup153 est connue pour être un élément clé dans le transport nucléo-cytoplasmique, mais il a également été démontré qu’elle participait directement ou indirectement à l’expression génétique et au contrôle du cycle cellulaire. Dans ce contexte, nous avons montrés précédemment que des niveaux altérés de Nup153 menaient à des anomalies mitotiques, particulièrement en cytokinèse et dans le point de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique (SAC). Le SAC assure la ségrégation correcte du matériel génétique entre les cellules filles. Il a été montré que Nup153 interagit avec la protéine du SAC Mad1. Dans cette étude, nous avons utilisé une technique d’imagerie de haute résolution, « in situ proximity ligation assay » pour disséquer davantage l’interaction entre Nup153 et Mad1 dans les cellules humaines. Nous avons montré que ces deux protéines interagissent exclusivement au niveau de l’enveloppe nucléaire, depuis les dernières phases de la mitose jusqu’à la prophase. Par des expériences d’interaction in vitro, nous avons également identifiés sur Mad1 deux sites de liaison indépendants pour Nup153. Nous avons également fourni des indications que Nup153 interagit aussi avec une forme SUMOylée de Mad1. La déplétion de Mad1 menait à un recrutement tardif de Nup153 au niveau de l’enveloppe nucléaire en cours de reformation en anaphase dans les cellules vivant, Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le ribosome est un macro complexe moléculaire en charge de la synthèse de toutes lesprotéines de la cellule. Depuis les premiers essais de reconstruction in vitro d’un ribosome procaryote,des générations de chercheurs se sont succédées durant plusieurs décennies pour tenter d’éluciderles voies par lesquelles les ribosomes sont assemblés par la cellule. Un regain d’intérêt pour l’étude dela biogenèse du ribosome est advenu récemment suite à la mise en évidence de maladies liées à desmutations dans des acteurs de la biogenèse du ribosome mais également, et surtout, suite à la miseen évidence du rôle fondamental du ribosome dans les processus de transformation oncogénique.Le ribosome est composé de deux sous-unités, une petite et une grande, formées, ellesmêmes,d’un assemblage intriqué d’ARN ribosomique et de protéines ribosomiques. La formation d’unribosome, appelée biogenèse du ribosome, est un processus complexe, intégré et extrêmementhiérarchisé impliquant, chez la levure, plus 200 facteurs accessoires. Bien que les principes sousjacentsà la biogenèse du ribosome eucaryote établis à partir d’études réalisées chez la levure semblentconservés chez l’Homme, de nombreux éléments suggèrent qu’elle y soit plus complexe. Ainsi, latransposition directe chez l’Homme des connaissances acquises chez la levure quant à la biogenèse duribosome serait, tout du moins partiellement, inexacte.Au cours de ma thèse, j’ai poursuivi différents objectifs s’intégrant tous dans le cadre de labiogenèse du ribosome eucaryote. D’une part, chez la levure, j’ai poursuivi la caractérisation du rôlede la protéine Las1 dans la biogenèse de la grande sous-unité ribosomique. D’autre part, chezl’Homme, mon objectif premier a été de participer à l’identification de nouveaux facteurs accessoiresimpliqués dans la biogenèse du ribosome et à la caractérisation fonctionnelle de certains d’entre eux.Dans un second temps, je me suis concentré sur l’implication de deux particules ribonucléoprotéiquesnucléolai, Doctorat en Sciences, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les ribosomes sont des macrocomplexes ribonucléoprotéiques sophistiqués, essentiels pour décoder l’information génétique et la traduire en protéines fonctionnelles. Chez les organismes eucaryotes, le ribosome est constitué de deux sous-unités, la petite (40S) et la grande (60S). Leur biogenèse est un processus fondamental, très complexe, qui mène à la synthèse et l’assemblage de 4 ARNr et 80 protéines ribosomiques (79 chez la levure). La biogenèse du ribosome a longtemps été étudiée chez Saccharomyces cerevisiae. Près de 20 ans de recherches ont été nécessaires à la communauté scientifique pour identifier les quelques 200 facteurs de synthèse du ribosome levurien. Alors que le schéma global de cette voie de biosynthèse semble conservé chez les organismes eucaryotes, de nombreux éléments suggèrent qu’elle serait plus élaborée chez l’homme et nécessiterait un plus grand nombre de facteurs que chez la levure. De plus, la caractérisation de nombreuses ribosomopathies, ou maladies du ribosome prédisposant aux cancers, a suscité un intérêt accru pour l’étude de la voie de biosynthèse du ribosome dans le paradigme expérimental le plus approprié, la cellule humaine.Au cours de ma thèse de doctorat, j’ai contribué à un projet systématique d’identification de facteurs d’assemblage (FA) du ribosome chez l’homme. Pratiquement, nous avons identifié 286 FA humains, dont beaucoup sont homologues aux facteurs levuriens connus, et 74 sont sans équivalent chez la levure. Par ailleurs, j’ai caractérisé en détail certains facteurs. En particulier, Trm112 pour lequel j’ai montré qu’il agit comme un stabilisateur de la méthyltransférase (MTase) Bud23, spécifique à l’ARNr 18S de la sous-unité levurienne 40S. J’ai également participé à la caractérisation de mutations à l’interface du complexe Bud23-Trm112. Enfin, j’ai contribué à l’étude de trois FA que nous avons identifiés chez l’homme, DIMT1L et WBSCR22-TRMT112. J’ai montré que ces protéines sont les orthologues des MTases levurie, Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Influenza A NS1 and NS2 proteins are encoded by the RNA segment 8 of the viral genome. NS1 is a multifunctional protein and a virulence factor while NS2 is involved in nuclear export of viral ribonucleoprotein complexes. A yeast two-hybrid screening strategy was used to identify host factors supporting NS1 and NS2 functions. More than 560 interactions between 79 cellular proteins and NS1 and NS2 proteins from 9 different influenza virus strains have been identified. These interacting proteins are potentially involved in each step of the infectious process and their contribution to viral replication was tested by RNA interference. Validation of the relevance of these host cell proteins for the viral replication cycle revealed that 7 of the 79 NS1 and/or NS2-interacting proteins positively or negatively controlled virus replication. One of the main factors targeted by NS1 of all virus strains was double-stranded RNA binding domain protein family. In particular, adenosine deaminase acting on RNA 1 (ADAR1) appeared as a pro-viral host factor whose expression is necessary for optimal viral protein synthesis and replication. Surprisingly, ADAR1 also appeared as a pro-viral host factor for dengue virus replication and directly interacted with the viral NS3 protein. ADAR1 editing activity was enhanced by both viruses through dengue virus NS3 and influenza virus NS1 proteins, suggesting a similar virus-host co-evolution., Journal Article, info:eu-repo/semantics/published

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The present invention relates to methods for screening substances capable of modulating the replication of an influenza virus. More particularly, the present invention relates to methods for screening a plurality of substances capable of modulating the replication of an influenza virus in a host cell comprising the step consisting of identifying a substance that modulates the specific interaction of a host cell protein with a viral protein required for viral replication as depicted in table 1 or identifying a substance that modulates the specific interaction of a first host cell protein as depicted in table 1 with a second host cell protein present in cellular network of the first host cell protein or identifying a substance that modulates the expression of a host cell protein as depicted in table 1, or identifying a substance that modulates the activity of a host cell protein as depicted in table 1, info:eu-repo/semantics/published

Using global approaches and high-throughput technologies in virology brings a new vision of the infections physiology and allows the identification of cellular factors, mandatory for viral life cycle, that could be targeted by original therapeutic agents. It opens perspectives for the treatment of viral infections by acting on cellular pathways that the virus must use for its own replication. Combining these new molecules with classical antiviral drugs and immunomodulators diversifies and enlarges the antiviral arsenal and contributes to fight drug resistance.Our laboratory and others are constructing virus-human interactomes to propose a comprehensive analysis of viral infection at the cellular level. Studying these infection maps, where the viral infection can be visualized as perturbation of the human protein-protein interaction network, and identifying the biological functions that are impaired by these perturbations may lead to discovery of new therapeutic targets. These virus-human interaction maps are constructed in a stringent yeast two-hybrid system by screening human cDNA libraries with viral proteins as bait and integrating interactions mined from literature and public databases., Journal Article, info:eu-repo/semantics/published

Comparative interactomics is a strategy for inferring potential interactions among orthologous proteins or "interologs". Herein we focus, in contrast to standard homology-based inference, on the divergence of protein interaction profiles among closely related organisms, showing that the approach can correlate specific traits to phenotypic differences. As a model, this new comparative interactomic approach was applied at a large scale to human papillomaviruses (HPVs) proteins. The oncogenic potential of HPVs is mainly determined by the E6 and E7 early proteins. We have mapped and overlapped the virus-host protein interaction networks of E6 and E7 proteins from 11 distinct HPV genotypes, selected for their different tropisms and pathologies. We generated robust and comprehensive datasets by combining two orthogonal protein interaction assays: yeast two-hybrid (Y2H), and our recently described "high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay" (HT-GPCA). HT-GPCA detects protein interaction by measuring the interaction-mediated reconstitution of activity of a split G. princeps luciferase. Hierarchical clustering of interaction profiles recapitulated HPV phylogeny and was used to correlate specific virus-host interaction profiles with pathological traits, reflecting the distinct carcinogenic potentials of different HPVs. This comparative interactomics constitutes a reliable and powerful strategy to decipher molecular relationships in virtually any combination of microorganism-host interactions., JOURNAL ARTICLE, info:eu-repo/semantics/published

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The influenza virus transcribes and replicates its genome inside the nucleus of infected cells. Both activities are performed by the viral RNA-dependent RNA polymerase that is composed of the three subunits PA, PB1, and PB2, and recent studies have shown that it requires host cell factors to transcribe and replicate the viral genome. To identify these cellular partners, we generated a comprehensive physical interaction map between each polymerase subunit and the host cellular proteome. A total of 109 human interactors were identified by yeast two-hybrid screens, whereas 90 were retrieved by literature mining. We built the FluPol interactome network composed of the influenza virus polymerase (PA, PB1, and PB2) and the nucleoprotein NP and 234 human proteins that are connected through 279 viral-cellular protein interactions. Analysis of this interactome map revealed enriched cellular functions associated with the influenza virus polymerase, including host factors involved in RNA polymerase II-dependent transcription and mRNA processing. We confirmed that eight influenza virus polymerase-interacting proteins are required for virus replication and transcriptional activity of the viral polymerase. These are involved in cellular transcription (C14orf166, COPS5, MNAT1, NMI, and POLR2A), translation (EIF3S6IP), nuclear transport (NUP54), and DNA repair (FANCG). Conversely, we identified PRKRA, which acts as an inhibitor of the viral polymerase transcriptional activity and thus is required for the cellular antiviral response., Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, info:eu-repo/semantics/published

Large collections of protein-encoding open reading frames (ORFs) established in a versatile recombination-based cloning system have been instrumental to study protein functions in high-throughput assays. Such 'ORFeome' resources have been developed for several organisms but in virology, plasmid collections covering a significant fraction of the virosphere are still needed. In this perspective, we present ViralORFeome 1.0 (http://www.viralorfeome.com), an open-access database and management system that provides an integrated set of bioinformatic tools to clone viral ORFs in the Gateway(R) system. ViralORFeome provides a convenient interface to navigate through virus genome sequences, to design ORF-specific cloning primers, to validate the sequence of generated constructs and to browse established collections of virus ORFs. Most importantly, ViralORFeome has been designed to manage all possible variants or mutants of a given ORF so that the cloning procedure can be applied to any emerging virus strain. A subset of plasmid constructs generated with ViralORFeome platform has been tested with success for heterologous protein expression in different expression systems at proteome scale. ViralORFeome should provide our community with a framework to establish a large collection of virus ORF clones, an instrumental resource to determine functions, activities and binding partners of viral proteins., Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, info:eu-repo/semantics/published

High-throughput screening of protein-protein interactions opens new systems biology perspectives for the comprehensive understanding of cell physiology in normal and pathological conditions. In this context, yeast two-hybrid system appears as a promising approach to efficiently reconstruct protein interaction networks at the proteome-wide scale. This protein interaction screening method generates a large amount of raw sequence data, i.e. the ISTs (Interaction Sequence Tags), which urgently need appropriate tools for their systematic and standardised analysis., Journal Article, info:eu-repo/semantics/published

Oral presentation- Le virus de l’hépatite C détourne des mécanismes cellulaires à son propre avantage pour assurer sa réplication et sa survie mais les mécanismes fondamentaux de la réplication virale, la sensibilité au traitements et la pathogénie demeurent encore en grande partie inconnus. Dans le but d’obtenir une vision globale d’une infection par HCV, nous avons cartographié les interactions potentielles entre les protéines du virus et le protéome cellulaire humain. Cet interactome inter-spécifique a été généré en réalisant des cribles double-hybride en levure, en utilisant comme appâts les protéines virales complètes mais aussi des fragments. 314 interactions protéiques potentielles ont ainsi été découvertes. De plus, nous avons extrait de la littérature 170 interactions entre des protéines de HCV et des protéines cellulaires. Ce jeu de données a été intégré dans un interactome humain composé de 9500 protéines et 45000 interactions binaires (généré à partir de données d’interactions protéiques binaires présentes dans différentes bases de données). L'analyse topologique de ce réseau montre que les protéines cellulaires touchées par HCV sont enrichies en protéines fortement connectées ou « hubs », ainsi qu’en protéines avec une forte mesure de centralité, indiquant que le virus de l’hépatite C cible préférentiellement les protéines avec une fonction essentielle. Une analyse globale des annotations fonctionnelles des protéines cellulaires interagissant avec HCV montre un enrichissement significatif pour plusieurs fonctions cellulaires majeures. En particulier, la voie des adhésions focales apparaît comme étant fonctionnellement perturbée par les protéines NS3 et NS5A. Des pathologies métaboliques affectant les patients infectés chroniquement par HCV impliquent notamment la voie de l’insuline et les voies de signalisation de JAK-STAT et du TGFβ. La construction du réseau d’interactions de ces voies montre que ces trois modules fonctionnels peuvent être interconne, info:eu-repo/semantics/nonPublished

Oral presentation- Replication of Hepatitis C virus (HCV) relies on multiple interactions with host factors but how these interactions determine infection, pathogenesis and sensitivity to treatment remains largely undefined. To provide a comprehensive view of a HCV mediated cellular infection, we present here a proteome-wide mapping of interactions between HCV and human cellular proteins. A total of 314 protein-protein interactions between HCV and human proteins was identified by yeast two-hybrid, and 170 by literature mining. The dataset was integrated into a reconstructed human interactome and topological analysis of this network showed that cellular proteins interacting with HCV are enriched in highly central and interconnected proteins. The global analysis of these proteins based on functional annotation revealed the enrichment of cellular pathways targeted by HCV. A network comprised of proteins associated with frequent clinical disorders of chronically infected patients was constructed by connecting the insulin, Jak/STAT and TGFb pathways with cellular proteins targeted by HCV. CORE protein appeared as a major perturbator of this network. Focal adhesion was also identified as a new function affected by the virus, mainly by NS3 and NS5A proteins., info:eu-repo/semantics/nonPublished

A proteome-wide mapping of interactions between hepatitis C virus (HCV) and human proteins was performed to provide a comprehensive view of the cellular infection. A total of 314 protein-protein interactions between HCV and human proteins was identified by yeast two-hybrid and 170 by literature mining. Integration of this data set into a reconstructed human interactome showed that cellular proteins interacting with HCV are enriched in highly central and interconnected proteins. A global analysis on the basis of functional annotation highlighted the enrichment of cellular pathways targeted by HCV. A network of proteins associated with frequent clinical disorders of chronically infected patients was constructed by connecting the insulin, Jak/STAT and TGFbeta pathways with cellular proteins targeted by HCV. CORE protein appeared as a major perturbator of this network. Focal adhesion was identified as a new function affected by HCV, mainly by NS3 and NS5A proteins., Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, info:eu-repo/semantics/published

La protéine à F-box est une sous-unité du SCF, une ubiquitine ligase (ou enzyme E3) multimérique. Il est composée d’au moins 4 sous-unités :Skp1, une culline, Rbx1 et une protéine à F-box. Cette dernière est le composant variable du complexe et sa fonction est de recruter le substrat à polyubiquitiner en vue de sa dégradation par le protéasome 26S. Skp1 établit le lien entre la protéine à F-box et le couple culline-Rbx1, le coeur catalytique du complexe. Le SCF médie le transfert d’une ubiquitine depuis l’enzyme E2, ou « ubiquitin-conjugating enzyme », vers le substrat à étiqueter en vue de sa protéolyse. Certaines protéines à F-box forment également un complexe avec Skp1, mais cette fois indépendamment d’un SCF. Ces derniers complexes ne sont pas impliqués dans l’ubiquitination et la protéolyse. Dans le but de découvrir de nouvelles fonctions du SCF, nous avons recherché des protéines à F-box chez la levure Schizosaccharomyces pombe par un crible double-hybride avec Skp1 en appât. Nous avons isolé cinq protéines à F-box, dont quatre nouveaux membres de cette famille :Pof6, Pof7, Pof10 et Pof14 (pour S. pombe F-box). La famille des protéines à Fbox compte actuellement 18 membres chez cette levure. Nous avons montré que la protéine à F-box Pof6 exerce un rôle essentiel pour la séparation des cellules-filles après la mitose. Une souche délétée de pof6 est non-viable et l’observation du phénotype terminal des cellules montre qu’elles sont bloquées en cytocinèse. Pof6 forme un complexe non-SCF avec Skp1 et est localisée notamment au septum. La protéine à F-box Pof14 forme un complexe SCF. En effet elle interagit in vivo avec Skp1 et Pcu1 (S. pombe culline-1). Nous avons identifié par double-hybride que Pof14 interagit avec Erg9, une enzyme de la voie de biosynthèse de l’ergostérol. Les deux protéines montrent une colocalisation subcellulaire. La délétion de pof14 entraine une sensibilité accrue à un stress oxydatif et l’expression de pof14 est induite lors d’un choc oxy, info:eu-repo/semantics/published

The ease of construction of multiple mutant strains in Schizosaccharomyces pombe is limited by the number of available genetic markers. We describe here three new cassettes for PCR-mediated gene disruption that can be used in combination with commonly used fission yeast markers to make multiple gene deletions. The natMX6, hphMX6 and bleMX6 markers give rise to resistance towards the antibiotics nourseothricin (NAT), hygromycin B and phleomycin, respectively. The cassettes are composed of exogenous sequences to increase the frequency of integration at targeted loci, and have a structure similar to the commonly used pFA6a-kanMX6 modular plasmid system. This allows a simple exchange of the kanMX6 marker in existing strains with any of the three new cassettes. Alternatively, oligonucleotide primers designed for the modular kanMX6 cassettes can be used to make the transforming PCR fragments for gene disruption. We illustrate the construction of a mutant strain with six independent gene disruptions, using the novel antibiotic cassettes in combination with existing genetic markers., Evaluation Studies, Journal Article, Research Support, Non-U.S. Gov't, FLWIN, info:eu-repo/semantics/published