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DFG - SFB894: A16 Calciumsignale im Hypothalamus; DFG - SB894: A17 Mechanismen Rezeptor-vermittelter Calciumsignale in Pheromon-detektierenden Sinneszellen; DFG - TRR152: P09 Funktionelle Rolle von TRP-Kanälen in neuroendokrinen Zellen des Gehirns; DFG - TRR152: P10 Neue TRP-Kanal Funktionen im olfaktorischen System; Volkswagenstiftung: Lichtenberg-Professur von Prof. Dr. Trese Leinders-Zufall

Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig. Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte., The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca2+ component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca2+ signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β.

For voltage-gated ion channels, detailed models have been elaborated in order to elucidate the molecular basis of channel gating. In contrast, present understanding is limited regarding the gating mechanisms of sensory channels initiated by chemical stimuli such as ligands and by physical stimuli such as mechanical force. Therefore, the major objective of this work is to extend knowledge about molecular mechanisms involved in voltage-independent gating of transient receptor potential (TRP) channels, particularly of TRPM2 compared with TRPM8, and of TRPA1. In particular, three experimental approaches were pursued: 1. The closest relative of TRPM2 within the TRP family of cation channels is TRPM8, which, however, is gated by completely different stimuli. TRPM2 is activated in a voltage-independent way by binding of ADPR to the intracellular NUDT9-homology (NUDT9-H) domain at the C-terminus of the channel. TRPM8 is a voltage-dependent channel and cold receptor. All basic amino acid residues within the putative voltage-sensing S4-S5-region of TRPM8 are conserved in TRPM2. The transmembrane segments S5 and S6 of TRPM2 and TRPM8 have a higher sequence homology than the intervening pore regions. Therefore, the apparent insensitivity to voltage in TRPM2 may result from differences in the pore region from S5 to S6 rather than in the voltage-sensing region. In order to elucidate the role of the pore in single-channel gating, chimerical channels were studied in which the S5-pore-S6 segment was reciprocally exchanged between TRPM2 and TRPM8. For TRPM2, characteristic single-channel properties such as open time, open probability and conductance were conserved after pore exchange. However, at strongly hyperpolarized membrane potentials, pore chimera M2M8P (TRPM2 with the pore region of TRPM8) showed a stabilization of the closed state, reminiscent of voltage-dependent gating behavior seen with TRPM8. TRPM8 activity was drastically impaired after pore exchange. In conclusion, interaction of the putative voltage sensors with specific structures in the pore is indispensable for channel function of TRPM8. In contrast, processes outside of the pore determine voltage-independent channel gating of TRPM2 initiated by ADPR. 2. A role of TRPA1 in mammalian mechanosensitivity has been suggested in behavioral studies and from experiments with sensory neurons. Therefore, voltage-independent gating of human TRPA1 was studied by means of mechanical activation in an expression model (HEK293 cells) and in native non-neuronal cells (WI-38 fibroblasts). In the cell-attached configuration, the weak initial stimulation of TRPA1 by membrane deformation was strongly increased in the presence of extracellular Ca2+. However, in inside-out configuration, when the constraining effect of the cytoskeleton was absent, mechanical activation of TRPA1 occurred without Ca2+ and faster than in cell-attached experiments. Pore dilation of TRPA1 and of channel mutant D915A with reduced Ca2+ permeability demonstrated that mechanical stress is the primary stimulus to gate TRPA1, allowing for subsequent Ca2+ influx and signal amplification. In conclusion, these results establish human TRPA1 as a mechanosensor channel that acts cooperatively with Ca2+ and this way integrates painful mechanical stimuli with other noxious signals. 3. Single-channel analysis relies on the unambiguous identification of protein-related current events against background leakage. In protein-free lipid membranes, large increases in permeability result from the facilitated formation of lipid pores during the chain-melting transition of the lipid bilayer. TRP channels and lipid pores are influenced by changes in intensive thermodynamical variables such as temperature, voltage, pressure, and the chemical potentials of ions. In order to distinguish voltage-independent gating of TRP channels from bilayer-related leak currents, single-channel recordings from TRPM2, TRPM8 and TRPA1 were compared with current recordings from synthetic lipid bilayers formed on the tip of glass pipettes. Protein-free lipid membranes driven into the melting transition by application of voltage displayed a wide spectrum of ion channel-like events, including current steps, bursts, spikes, flickering, and multi-step openings. In contrast, voltage-independent gating of TRP channels was characterized by “fingerprint” openings of typical conductance and lifetime which were absent under control conditions. In conclusion, on the basis of short current traces, no easy decision can be made whether quantized currents originate from a channel protein or from a pure lipid membrane. Taken together, these findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated with voltage-independent gating of TRP channels. This paves the way for elucidating TRP channel regulation in normal cell functioning and under pathophysiological conditions, thereby leading to the development of novel therapeutic options.

Der Mechanismus der Chemotaxis umfasst innerhalb der Zelle einen Signalkomplex, der den Zellen ermöglicht, das Signal von Chemoattraktanzien über spezifische Oberflächenrezeptoren innerhalb der Zelle zu verstärken und über Signalkaskaden unter anderem eine gerichtete Bewegung der Zelle einzuleiten. Ein Schlüsselelement innerhalb dieses Signalkomplexes bildet Ca2+. Die molekulare Identität der an der Chemotaxis beteiligten Ca2+-Ionenkanäle konnte aber bisher nur unvollständig geklärt werden und so sollte mit dieser Arbeit die Rolle von zwei TRPC- Kanälen, dem TRPC1 und dem TRPC6, innerhalb der Chemotaxis neutrophiler Granulozyten untersucht werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte mithilfe von in vitro Chemotaxisstudien die Abhängigkeit von zwei Chemoattraktanz-Rezeptor-Signalwegen von diesen beiden TRPC-Kanälen bei der Chemotaxis muriner neutrophiler Granulozyten nachgewiesen werden.

The vascular endothelium induces hyperpolarization and in consequence relaxation of vascular smooth muscle cells via the generation of endothelium-derived-hyperpolarzing factor (EDHF). Although the structural identity of EDHF has not yet been unequivocally clarified, there is agreement that the generation of EDHF is initiated by the activation of calcium regulated potassium channels (KCa) in endothelial cells. The local increases of calcium required to activate KCa can be brought by several signaling pathways. One among these is the activation of calcium permeable TRP-channels in the plasma membrane of endothelial cells. Based on preliminary evidence found in the literature this work aimed to define the roles of TRPM8 and of TRPA1 channels for endothelium mediated vasodilatation by means of pharmacology and electrophysiology. It was found that the established TRPM8 channel activators menthol and icilin and the TRPA1 channel activator AITC all caused dose-dependent vasodilations of isolated perfused mouse carotid arteries. The vasodilatory effects of these drugs, however, were maintained even after mechanical removal of the endothelium, suggesting that the observed vasodilatations were not mediated by the endothelium. Moreover, the before mentioned channel activators did not induce TRP-like currents in endothelial cells isolated from mouse carotid arteries, again suggesting that TRPM8 and TRPA1 do not play major functional roles in endothelial cells. Menthol, however, induced a prominent cation current in isolated endothelial cells. Additionally menthol almost completely blocked an L-type channel like current in cultured vascular smooth muscle cells (A7R5). The latter effect likely explains the endothelium independent vasodilatation induced by menthol. In summary, the present work does not support a role of endothelial TRPM8 und TRPA1 channels for the regulation of vessel diameter and in consequence of vascular resistance., Über den endothelabhängigen Hyperpolarisation-Faktor (EDHF) induziert das Gefäßendothel eine Hyperpolarisation der direkt benachbarten Gefäßmuskelzellen und bewirkt so deren Relaxation. Gleichwohl die chemische Idendität des EDHF noch nicht geklärt ist, geht man davon aus, dass die EDHF Wirkung zunächst durch eine Aktivierung calciumregulierter Kaliumkanäle (KCa) im Endothel initiiert wird. Der hierfür erforderliche Anstieg der lokalen Calciumkonzentration in der Umgebung von KCa Kanälen kann über verschiedene Signalwege induziert werden. Ein bedeutsamer Weg dabei ist die Aktivierung von plasmalemmalen Kationenkanälen aus der Transient-Rezeptor-Potential (TRP)- Kanalfamilie, welche einen lokalen transmembranären Calciumeinstrom ermöglichen. Aufgrund präliminärer Literaturhinweise auf eine mögliche bedeutsame Rolle von TRPM8 und TRPA1 Kanälen für die endothelvermittelte Gefäßdilatation wurde in dieser Arbeit die Funktion dieser Kanäle als potentielle EDHF Induktoren pharmakologisch und elektrophysiologisch charakterisiert. Dazu wurde zunächst die Wirkung etablierter TRMP8 Aktivatoren (Menthol und Icilin) und eines TRPA1 Aktivators (AITC) auf den Gefäßwiderstand isoliert perfundierter Ateriae carotides der Maus untersucht. Alle genannten Substanzen induzierten konzentrationsabhängig Dilatationen, in unterschiedlichem Ausmaß, wobei die stärkste Dilatation mit Icilin zu beobachten war. Die gefäßdilatierende Wirkung dieser Substanzen blieb allerdings auch nach mechanischer Endotheldenudierung erhalten, was für eine endothelunabhängige Dilatation spricht. In Einklang damit konnten mit den genannten TRP-Kanalaktivatoren auch keine TRP-charakteristischen Transmembranströme in isolierten Endothelzellen aus den Arteriae carotides induziert werden, was gegen eine wesentliche funktionelle Rolle von TRMP8 und TRPA1 Kanälen in Endothelzellen spricht. Beobachtet wurde die Aktivierung eines kräftigen Kationenausstromes durch Menthol in isolierten Endothelzellen, sowie eine nahezu komplette Hemmung eines Kationeneinstromes (wahrscheinlich L-Typ Calciumkanäle) durch Menthol in kultivierten glatten Gefäßmuskelzellen (A7R5 Zellen). Die Hemmung der L-Typ Calciumkanäle durch Menthol könnte eine Erklärung für endothelunabhängige vasodilatierende Wirkung von Menthol bieten. Eine Beteiligung endothelialer TRPM8 und TRPA1 Kanäle bei der Regulation des Gefäßtonus konnte allerdings im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden.

Einen wesentlichen Anteil an der Regulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration haben Kationenkanäle aus der Familie der TRP-Proteine. Vermutlich 4 TRP-Proteine bilden homo- und heterooligomere Kanalkomplexe. TRPM3 ist das zuletzt identifizierte Mitglied der TRPM-Subfamilie mit größter Homologie zu TRPM1. Das TRPM3-Gen codiert eine Vielzahl von Spleissvarianten, welche Unterschiede hinsichtlich ihrer Permeabilität für divalente Kationen und ihrer Aktivierbarkeit durch das Steroid Pregnenolonsulfat aufweisen. Ich habe gezeigt, dass TRPM3 vor allem im Plexus choroideus, in ß-Zellen und in der Hypophyse exprimiert wird. Aus Ins-1- und GH3-Zellen sowie aus dem Hirn der Ratte habe ich neben bekannten TRPM3-Varianten 9 bislang unbekannte kloniert. FURA-2 Messungen zeigten, dass Pregnenolonsulfat in Ins-1- und GH3-Zellen einen Ca2+-Einstrom auslöst. Eine Hemmung von TRPM3 mit Hilfe von RNA-Interferenz ebenso wie eine Überexpression von TRPM1 und TRPM31 führte in diesen Zellen zu einer deutlichen Abnahme des Steroid-induzierten Ca2+-Einstroms, was stark darauf hindeutet, dass TRPM3-Kanäle für den Ca2+-Einstrom verantwortlich sind. Um die biologische Funktion von TRPM3 zu untersuchen, habe ich eine TRPM3-defiziente Mauslinie hergestellt. Dabei wurde Exon 24 deletiert, da es die ionenleitende Pore des Kanals codiert. Die angewandte Strategie erlaubt zudem eine zeit- oder gewebespezifische Inaktivierung des TRPM3-Gens sowie die Identifizierung TRPM3-exprimierender Zellen anhand ihrer grünen Fluoreszenz. Cation channels of the TRP family play a substantial role in the regulation of the cytosolic Ca2+ homeostasis. Presumably, TRP channel subunits assemble into homo- or heterotetrameric channel complexes. TRPM3 is the most recent identified member of the TRPM subfamily and shows highest homology to TRPM1. The TRPM3 gene encodes a variaty of splice variants. These variants differ in their permeability for divalent cations and their activation by the steroid pregnenolonesulfate. In this work I showed that TRPM3 is strongly expressed in the choroid plexus, in pancreatic ß-cells and in the pituitary gland. I cloned several variants of TRPM3 from Ins-1 cells, GH3 cells and rat brain. Nine new splice variants were identified. Pregnenolonesulfate induces Ca2+ entry in GH3 and Ins-1 cells as measured with the calciumindicatordye FURA-2. Inhibition of TRPM3 using a RNA interference approach and overexpression of TRPM1 and TRPM31 led to a significant reduction of the steroid induced Ca2+ influx in these cells. These data strongly suggest that TRPM3 channels are responsible for the steroid induced Ca2+ entry in endocrine cells. To analyze the biological functions of TRPM3 channels, I generated a TRPM3 deficient mouse line. Thereby exon 24 was deleted since it encodes the ion conducting pore of the channel. Furthermore, the applied strategy allows a time- or tissue-specific inactivation of the TRPM3 gene and in addition the identification of TRPM3 expressing cells by their green fluorescence

It has been proposed that transient receptor potential channels (TRP-channels) participate in ligand gated Ca^(2+) entry in non-excitable cells. To analyze the physiological relevance of TRP-channels human neutrophile granulocyte were chosen as a model for non-excitable cells. The activation of neutrophiles is accompanied by membrane depolarisation and by a rise of the [Ca^(2+)]i. Until now the identity of the proteins which initiate the activation of neutrophile granulocytes is not known. Among the TRP-channels, the LTRPC2 is predominantly expressed by neutrophile granulocytes. To investigate the relevance of LTRPC2 for the function of neutrophile granulocytes, LTRPC2 was cloned by the RT-PCR technique and was then heterologously transfected in CHO- and in HEK 293 cells for functional characterisation. Two splice variants of the LTRPC2 were identified in human neutrophile granulocytes. These splice forms were used to construct four alternative variants with deletions at the N-terminal and/or C-terminal domain (LTRPC2; LTRPC2-deltaC; LTRPC2-deltaN; LTRPC2-deltaN-deltaC) using an appropriate cloning strategy. Fluorometric measurments of the [Ca^(2+)]i and measurment of ionic currents of heterologously transfected cells with patch clamp revealed no activation of the LTRPC2 variants in dependence of an intracellular Ca^(2+) store depletion. This stands in contrast to the classical TRP-proteins. Since NAD^(+) and its metabolite ADP-ribose have recently been reported to activate LTRPC2, I analysed the response of LTRPC2 variants to NAD^(+) and ADP-ribose. Whereas no activation by NAD^(+) was observed in any LTRPC2 variant, ADP-ribose exerted a stimulating effect exclusively on the full-lenght LTRPC2. Since ADP-ribose can be formed from NAD^(+), and NAD^(+) is elevated during oxidative stress, it was tested wether the various LTRPC2 channel variants mediate cation influx in response to an oxidant. Therefore ion currents and the [Ca^(2+)]i were measured after stimulating transfected cells with H2O2 as a model of oxidative stress. A stimulation with H2O2 could be observed in cells transfected with full-length LTRPC2 or transfected with the variant LTRPC2-deltaC. Thus the activation of LTRPC2 by H2O2 is independent of ADP-ribose because the splice variant LTRPC2-deltaC was exclusively activated by H2O2, while full-length LTRPC2 could be activated by ADP-ribose as well. Since intracellular application of the antioxidant mannitol prevented a stimulation of LTRPC2 and LTRPC2-deltaC by H2O2, it can be concluded that H2O2 does not act directly on the channel but by intracellular oxidation reactions. It is possible that the activation of LTRPC2 plays a role for the stimulation of neutrophile granulocytes during inflammation, when neutrophiles become activated by H2O2.