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A produção de leite apresenta importante papel na economia do Brasil, sendo afetada pela presença de mastite nos rebanhos - clínica ou subclínica, acarretando perdas aos produtores. Este trabalho objetivou diagnosticar a mastite subclínica e caracterizar seus agentes etiológicos em propriedades na região Norte Central do Paraná, Atalaia (A) e Presidente Castelo Branco (B). Ambas propriedades apresentam vacas da raça holandesa, girolanda e mestiças em sistema de ordenha semi-mecanizada em fosso. Foi aplicado um questionário epidemiológico voltado à investigação do manejo do gado leiteiro. Foram selecionadas 46 vacas de A e 110 de B que não apresentavam mastite clínica (negativas para teste do caneco de fundo telado). Após a realização da antissepsia dos tetos (álcool iodado 3%), amostras de leite foram coletadas e submetidas ao teste do CMT (California Mastitis Test). Quando positivas para um dos tetos, realizou-se nova coleta em pool dos quatro tetos, em frascos estéreis e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da Clínica Veterinária da UNINGÁ. Para cultivo e identificação bacteriana foram utilizados meio de cultura e testes convencionais, e as colônias que cresceram foram identificadas através de características morfotintoriais e bioquímicas. Após identificação foi realizada a análise estatística descritiva. Observou-se que 15 (32,6%) e 24 (21,8%) animais foram positivos para o teste CMT nas propriedades A e B, respectivamente. Foram obtidos 91 isolados, dos quais identificou-se: Staphylococcus sp. coagulase negativo (SCN) (20,9%), Corynebacterium sp. (18,7%), Staphylococcus aureus (17,6%), Bacillus sp. (14,3%), Serratia rubidaea (11%) e Enterobacter agllomerans (4,4%). Em A foi observado elevada prevalência de SCN (30%), Serratia rubidaea (20%), Bacillus sp. (12,5%), Corynebacterium sp. (7,5%) e 5% para Serratia sp., Staphylococcus aureus e Streptococcus sp. Em B, observou-se Corynebacterium sp. e Staphylococcus aureus com percentuais de 27,5%, Bacillus sp. (15,7%), SCN (13,7%) e Enterobacter agllomerans (5,9%). Em ambas propriedades, verificou-se a presença de outros agentes (inferior a 5%). Diversidade de agentes etiológicos foi observado nas diferentes propriedades, fato este, que pode ser associado ao manejo adotado. Assim, verifica-se a importância da caracterização etiológica e do manejo correto do rebanho, para o controle da mastite subclínica nesta microrregião do Paraná.