Search

Sugebėjimas daugintis yra būtina visų gyvų esybių savybė. Genetinės informacijos kopijavimą atlieka replikacijos baltymai. Laisvai gyvenantys ląsteliniai organizmai turi tuos pačius replikacijos baltymus nepriklausomai nuo genomo dydžio. O kaip yra virusuose, kurių genetinę informaciją kaip ir ląstelinių organizmų atveju taip pat koduoja dvigrandė (dg) DNR? DgDNR virusai pasižymi ne tik replikacijos baltymų įvairove, bet ir plačiu genomų dydžio spektru. Jų genomo dydis gali skirtis net 500 kartų (nuo 5 iki 2500 kbp). DNR replikacija gerai ištirta T7, T4 faguose ir herpes virusuose, tačiau kitų dg DNR virusų dauginimasis vis dar lieka paslaptimi. Ar mažiau žinomi virusai naudoja jau charakterizuotų replikacijos baltymų variacijas? O gal jiems būdingos dar nežinomos DNR replikacijos strategijos? Norint atsakyti į aukščiau pateiktus klausimus buvo atlikta pirma tokios plačios apimties analizė, kurioje tirti replikacijos baltymai visuose žinomuose bakterijų, archėjų ir eukariotų dgDNR virusuose. Naudojant pažangiausius kompiuterinius metodus buvo identifikuoti ir charakterizuoti virusų replikacijos baltymai bei nustatyti jų pasiskirstymo genomuose dėsningumai. Tyrimas vyko dviem etapais. Iš pradžių tirti replikazės baltymai (DNR polimerazės, procesyvumo veiksniai, žiedo užkėlimo kompleksai). Vėliau tyrimas papildytas kitais replikacijos baltymais (DNR praimazės, helikazės, viengrandę DNR surišantys baltymai, pradmens pašalinime dalyvaujančios nukleazės, DNR ligazės ir... [toliau žr. visą tekstą], Ability to replicate and evolve are two distinct features of all living entities. Duplication of genetic information is carried out by replication proteins. Composition of DNA replication machinery is similar in all free-living cellular organisms. In contrast, replication in double-stranded (ds) DNA viruses is very diverse. It is well studied in T7 and T4 phages, herpes, polyoma and papilloma viruses, however, these groups make up only about 10% of known dsDNA viruses. How do lesser known viruses replicate? Do they use variations of already known replication systems? Or perhaps, they use novel replication strategies? DsDNA viruses are not only diverse, but they also vary in genome size. For example, genomes of smallest dsDNA viruses (polyoma) are 500 times smaller than that of the largest Pandora viruses (genome size – 2500 kbp). Genome size in free-living cellular organisms also varies. For example, genome size difference between human and the smallest eukaryote (Ostreococcus tauri) is ~260-fold. However, they have the same components of replication machinery. Is this true for dsDNA viruses? Or maybe, the diversity and genomic distribution of viral DNA replication proteins depends on virus genome size? We attempted to answer questions mentioned above by performing the first large scale computational study of all replication proteins from dsDNA viruses. Using current state-of-the-art computational methods we identified and characterized replication proteins (DNA polymerases... [to full text]

Ability to replicate and evolve are two distinct features of all living entities. Duplication of genetic information is carried out by replication proteins. Composition of DNA replication machinery is similar in all free-living cellular organisms. In contrast, replication in double-stranded (ds) DNA viruses is very diverse. It is well studied in T7 and T4 phages, herpes, polyoma and papilloma viruses, however, these groups make up only about 10% of known dsDNA viruses. How do lesser known viruses replicate? Do they use variations of already known replication systems? Or perhaps, they use novel replication strategies? DsDNA viruses are not only diverse, but they also vary in genome size. For example, genomes of smallest dsDNA viruses (polyoma) are 500 times smaller than that of the largest Pandora viruses (genome size – 2500 kbp). Genome size in free-living cellular organisms also varies. For example, genome size difference between human and the smallest eukaryote (Ostreococcus tauri) is ~260-fold. However, they have the same components of replication machinery. Is this true for dsDNA viruses? Or maybe, the diversity and genomic distribution of viral DNA replication proteins depends on virus genome size? We attempted to answer questions mentioned above by performing the first large scale computational study of all replication proteins from dsDNA viruses. Using current state-of-the-art computational methods we identified and characterized replication proteins (DNA polymerases... [to full text], Sugebėjimas daugintis yra būtina visų gyvų esybių savybė. Genetinės informacijos kopijavimą atlieka replikacijos baltymai. Laisvai gyvenantys ląsteliniai organizmai turi tuos pačius replikacijos baltymus nepriklausomai nuo genomo dydžio. O kaip yra virusuose, kurių genetinę informaciją kaip ir ląstelinių organizmų atveju taip pat koduoja dvigrandė (dg) DNR? DgDNR virusai pasižymi ne tik replikacijos baltymų įvairove, bet ir plačiu genomų dydžio spektru. Jų genomo dydis gali skirtis net 500 kartų (nuo 5 iki 2500 kbp). DNR replikacija gerai ištirta T7, T4 faguose ir herpes virusuose, tačiau kitų dg DNR virusų dauginimasis vis dar lieka paslaptimi. Ar mažiau žinomi virusai naudoja jau charakterizuotų replikacijos baltymų variacijas? O gal jiems būdingos dar nežinomos DNR replikacijos strategijos? Norint atsakyti į aukščiau pateiktus klausimus buvo atlikta pirma tokios plačios apimties analizė, kurioje tirti replikacijos baltymai visuose žinomuose bakterijų, archėjų ir eukariotų dgDNR virusuose. Naudojant pažangiausius kompiuterinius metodus buvo identifikuoti ir charakterizuoti virusų replikacijos baltymai bei nustatyti jų pasiskirstymo genomuose dėsningumai. Tyrimas vyko dviem etapais. Iš pradžių tirti replikazės baltymai (DNR polimerazės, procesyvumo veiksniai, žiedo užkėlimo kompleksai). Vėliau tyrimas papildytas kitais replikacijos baltymais (DNR praimazės, helikazės, viengrandę DNR surišantys baltymai, pradmens pašalinime dalyvaujančios nukleazės, DNR ligazės ir... [toliau žr. visą tekstą]

Bakteriofagas T4 turi išvystęs sudėtingą ribonukleazių reguliavimo mechanizmą, kuris nėra ištirtas. Išskyrus endoribonukleazės RegB poveikį, jokių kitų Escherichia coli ar fago koduojamų baltymų poveikis ankstyviesiems fago T4 transkriptams nežinomas. Disertacijoje siekiama nustatyti kokios E. coli endoribonukleazės turi įtakos RegB hidrolizuotų ankstyvųjų fago T4 transkriptų brendimui ir degradacijai, patikrinti, ar bakterijos endoribonukleazės yra modifikuojamos faginės infekcijos metu ir ištirti, kokie fago T4 koduojami veiksniai gali turėti įtakos endoribonukleazių aktyvumui. Šio darbo metu buvo įrodyta, kad RNazės RegB kirptų ankstyvųjų fago transkriptų antrinę hidrolizę vykdo E. coli koduojamos endoribonukleazės E ir G. Pastaroji yra pagrindinė RegB kirptus transkriptus skelianti RNazė, o aptikti taikiniai yra pirmieji fago T4 transkriptuose identifikuoti RNazės G taikiniai. Tiriant RNazės G modifikavimo galimybę nustatyta, kad ji faginės infekcijos metu gali būti modifikuojama, tačiau tai neturi įtakos jos aktyvumui RegB kirptų transkriptų atžvilgiu. Nustatyta, kad bakteriofago T4K10 koduojamos polinukleotidkinazės (PNK) G14D aminorūgšties pakaita sutrikdo fermento 5' kinazinį aktyvumą ir tai lemia RegB kirptų transkriptų antrinių taikinių jautrumo sumažėjimą RNazei G. Darbo metu parodyta, kad fago T4 RNazės RegB ir PNK sąlygotas E. coli RNazių E ir G veikimas yra skirtas ankstyvųjų transkriptų degradacijai pagreitinti., Phage T4 has developed a complex mechanism of ribonucleases control, which needs yet to be investigated. Apart from the impact of endoribonuclease RegB, no other effects of Escherichia coli- or phage-encoded proteins are known to be involved in the degradation of early mRNAs. This study has aimed to identify E. coli endoribonucleases that are involved in secondary processing in RegB-cleaved T4 mRNAs and to determine what phage T4-encoded factors affect the activity of these enzymes. We have shown that the endonucleolytic events at secondary sites of RegB-processed transcripts involve RNases G and E. The RNase G appears to be the main ribonuclease that cleaves all known secondary targets. Moreover, the revealed targets are the first RNase G targets identified in the bacteriophage T4 mRNA. This study has revealed that RNase G can be covalently modified during the infection cycle of bacteriophage T4. However, such modifications do not affect its activity related to the origin of secondary cuts in RegB-processed T4 mRNA. Another important finding is that T4K10 phage encodes defective polynucleotidkinase (PNK). In this study, we have shown that the G14D mutation of phage T4K10 PNK impairs 5'-kinase activity in vivo, as well as in vitro, and leads to the diminished processing of RegB-cleaved transcripts. This study has revealed that both, the T4 RNase RegB- and PNK-mediated activity of the E. coli RNases E and G is designed to accelerate degradation of phage T4 early transcripts.

The prevalence and nature of elements responsible for antibiotic resistance-associated genes transmission among Gram negative bacteria in clinical and agricultural environments in Lithuania is largely unknown. Herein, molecular epidemiology study of 859 Gram negative bacterial isolates from Lithuanian hospitals and farms mostly focusing on the characteristics of antibiotic resistance-associated transferable elements – integrons and plasmids, is presented. Three novel gene cassette arrays of class 1 integron were elucidated, among them gene coding for a new OXA-type β-lactamase, OXA-205, was determined. Certain integron types between isolates from different sources suggested the possibility for horizontal transfer of antibiotic resistance genes. The analysis of genotyping results revealed that majority of A. baumannii isolates from all hospitals belonged to European clonal lineages I and II. Clonal spread of ECII strains with a newly observed plasmid pAB120 carrying two copies of OXA-72 carbapenemase coding gene was largely responsible for a dramatic increase in the rate of carbapenem resistant A. baumannii in the country tertiary care hospitals. The abundance of XerC/XerD recognition sites in pAB120 suggested that Xer recombination might play an important role in the rearrangement of plasmids via common genetic platforms. The genetic data obtained in this work could serve as a basis for the further monitoring of the dissemination of antibiotic resistance elements., Apie atsparumą antibiotikams lemiančių genetinių elementų paplitimą, įvairovę ir pernašą Lietuvoje paplitusiose patogeninėse Gram neigiamose bakterijose yra žinoma nedaug. Todėl šis darbas yra išsamus molekulinės epidemiologijos tyrimas, kuriame apibūdinti atsparumo antibiotikams pernašos genetiniai elementai iš 859 Gram neigiamų bakterijų padermių, išskirtų iš sergančių žmonių, sveikų ir sergančių gyvūnų. Darbe nustatyti trys nauji integronai ir ištirta jų genetinė struktūra. Viename iš integronų nustatytas genas, koduojantis naują D klasės β-laktamazę OXA-205. Enterobakterijų integronuose itin paplitę genai, lemiantys atsparumą trimetoprimui, liudija apie atsaką gydymui naudojamiems šios klasės antibiotikams. Bendros genų kasetės klinikinės ir gyvūninės kilmės Enterobacteriaceae šeimos bakterijų integronuose ir jų pernaša rodo, kad atsparumą antibiotikams lemiančios genetinės determinantės per zoonotinius mikroorganizmus gali būti pernešamos iš gyvūnų į žmogaus organizmą. Parodyta, kad Lietuvos ligoninėse cirkuliuoja A. baumannii bakterijų pandeminių klonų linijos ECI ir ECII, kurioms būdingi skirtingi plazmidžių replikonų tipai ir jų deriniai. Nustatyta nauja A. baumannii plazmidė pAB120, turinti atsparumo karbapenemams genus blaOXA-72 ir pasižyminti Xer rekombinacijos potencialu. Parodyta, kad šią plazmidę turinčios A. baumannii padermės yra išplitusios Lietuvos ligoninėse ir taip nulėmusios atsparumo karbapenemams šuolį šalyje.

Apie atsparumą antibiotikams lemiančių genetinių elementų paplitimą, įvairovę ir pernašą Lietuvoje paplitusiose patogeninėse Gram neigiamose bakterijose yra žinoma nedaug. Todėl šis darbas yra išsamus molekulinės epidemiologijos tyrimas, kuriame apibūdinti atsparumo antibiotikams pernašos genetiniai elementai iš 859 Gram neigiamų bakterijų padermių, išskirtų iš sergančių žmonių, sveikų ir sergančių gyvūnų. Darbe nustatyti trys nauji integronai ir ištirta jų genetinė struktūra. Viename iš integronų nustatytas genas, koduojantis naują D klasės β-laktamazę OXA-205. Enterobakterijų integronuose itin paplitę genai, lemiantys atsparumą trimetoprimui, liudija apie atsaką gydymui naudojamiems šios klasės antibiotikams. Bendros genų kasetės klinikinės ir gyvūninės kilmės Enterobacteriaceae šeimos bakterijų integronuose ir jų pernaša rodo, kad atsparumą antibiotikams lemiančios genetinės determinantės per zoonotinius mikroorganizmus gali būti pernešamos iš gyvūnų į žmogaus organizmą. Parodyta, kad Lietuvos ligoninėse cirkuliuoja A. baumannii bakterijų pandeminių klonų linijos ECI ir ECII, kurioms būdingi skirtingi plazmidžių replikonų tipai ir jų deriniai. Nustatyta nauja A. baumannii plazmidė pAB120, turinti atsparumo karbapenemams genus blaOXA-72 ir pasižyminti Xer rekombinacijos potencialu. Parodyta, kad šią plazmidę turinčios A. baumannii padermės yra išplitusios Lietuvos ligoninėse ir taip nulėmusios atsparumo karbapenemams šuolį šalyje., The prevalence and nature of elements responsible for antibiotic resistance-associated genes transmission among Gram negative bacteria in clinical and agricultural environments in Lithuania is largely unknown. Herein, molecular epidemiology study of 859 Gram negative bacterial isolates from Lithuanian hospitals and farms mostly focusing on the characteristics of antibiotic resistance-associated transferable elements – integrons and plasmids, is presented. Three novel gene cassette arrays of class 1 integron were elucidated, among them gene coding for a new OXA-type β-lactamase, OXA-205, was determined. Certain integron types between isolates from different sources suggested the possibility for horizontal transfer of antibiotic resistance genes. The analysis of genotyping results revealed that majority of A. baumannii isolates from all hospitals belonged to European clonal lineages I and II. Clonal spread of ECII strains with a newly observed plasmid pAB120 carrying two copies of OXA-72 carbapenemase coding gene was largely responsible for a dramatic increase in the rate of carbapenem resistant A. baumannii in the country tertiary care hospitals. The abundance of XerC/XerD recognition sites in pAB120 suggested that Xer recombination might play an important role in the rearrangement of plasmids via common genetic platforms. The genetic data obtained in this work could serve as a basis for the further monitoring of the dissemination of antibiotic resistance elements.

During this work large molecular weight plasmids from Arthrobacter sp. 68b, A. rhombi PRH1 and VP3 bacteria were investigated as well as small plasmids from both A. rhombi strains. It was determined that genes encoding degradation proteins of phthalic acid, 2 methylpyridine and pyridine are located on plasmid p2MP (113 kb) in Arthrobacter sp. 68b. The degradation of phthalate, pyridine and its derivative is inducible process. It was proved that cells pre-grown with phthalic acid are able to utilise quinolinic acid. Monooxygenase, that cleaves pyridine ring between C2, C3 atoms, is induced by pyridine and 2 methylpyridine. The degradation pathway of mentioned compounds was proposed. Succinate semialdehyde and succinic acid are formed during utilisation. Genes, encoding 2-hydroxypyridine degradation proteins, are located on large molecular weight plasmid. The phenotype of large A. rhombi VP3 plasmid was not determined. Small plasmids from both A. rhombi strains were sequenced, open reading frames were determined and identified. Using the minimal replicon of small A. rhombi PRH1 plasmid, hybrid vectors pRMU824, pRMU824Km and pRMU824Tc were constructed for functional gene screening in Arthrobacter spp. and Rhodococcus spp. bacteria., Šio darbo metu buvo tiriamos Arthrobacter sp. 68b, A. rhombi PRH1 ir VP3 bakterijų didelės molekulinės masės katabolinės plazmidės, taip pat A. rhombi kamienų mažosios (<10 kb) plazmidės. Nustatyta, kad Arthrobacter sp. 68b bakterijose genai, koduojantys ftalio rūgšties, 2 metilpiridino ir piridino skaidymo baltymus, yra susitelkę beveik 113 kb p2MP plazmidėje. Šiose bakterijose ftalato ir piridino bei jo darinio degradacija yra indukuojami procesai. Įrodyta, kad ląstelės, augintos su ftalio rūgštimi, gali panaudoti chinolino rūgštį. Nustatyta, kad ir 2 metilpiridinas, ir piridinas indukuoja hipotetinę monooksigenazę, kuri skelia piridino žiedą tarp antro ir trečio anglies atomų. Pasiūlytas minėtų substratų skaidymo kelias, kurio metu susidaro gintaro rūgšties pusiau aldehidas ir gintaro rūgštis. Nustatyta, kad A. rhombi PRH1 bakterijose genai, koduojantys 2 hidroksipiridino skaidymo baltymus, yra didelės molekulinės masės plazmidėje. A. rhombi VP3 didelės plazmidės lemiamas fenotipas nenustatytas. Tiriant abiejų kamienų bakterijų mažąsiąs plazmides, buvo nustatytos jų nukleotidų sekos, aptikti atviro skaitymo rėmeliai ir įvardyti jų koduojami baltymai. Panaudojant A. rhombi PRH1 mažos plazmidės minimalų replikoną, buvo sukonstruoti hibridiniai vektoriai pRMU824, pRMU824Km ir pRMU824Tc genų funkcijų tyrimams Arthrobacter spp. ir Rhodococcus spp. bakterijose.

Multidrug resistance (MDR) pumps are one of the major causes of resistance in opportunistic pathogens, such as Pseudomonas aeruginosa. Consequently, fast and reliable methods are needed to assay the efficiency of MDR pumps in these bacteria. However, direct efflux pump functions’ real-time assessment methods are missing. Such assays would improve the evaluation of MDR efflux pump activities and the search for potential inhibitors. The assay for monitoring of MDR efflux pumps, employing voltage (Δψ) indicator tetraphenylphosphonium (TPP+) and TPP+-selective electrodes was developed. The assay was applied to evaluate the activity of tetracycline specific efflux pump TetA(B) in E. coli. Competitive inhibition of TetA(B) activity was demonstrated. Moreover, it was shown that tetracycline-specific efflux pump TetA(B) has higher selectivity for TPP+ than tetracycline. The designed method can be used for real-time monitoring of MDR efflux pumps in P. aeruginosa. The main factors influencing the activities of MDR efflux pumps were addressed: outer membrane permeability, Δψ, aeration, temperature and cell growth stage. It was also shown that TPP+ in combination with the pump inhibitor phenylalanyl-arginyl-β-naphtylamide (PAβN) can be used to monitor the activity of RND-type efflux pumps in P. aeruginosa. By controlling the outer membrane permeability and Δψ, the real-time measurements of the RND pump activity were performed. It was shown that PAβN depolarizes plasma membrane of the... [to full text], Atsparumas antibiotikams yra viena didžiausių kliūčių, gydant bakterijų sukeltas infekcijas. Bakterijų atsparumą antibiotikams lemia kelių rūšių mechanizmai: taikinio pakeitimas, antibiotikų ardymas fermentais, mažas ląstelės apvalkalėlio laidumas bei aktyvus kenksmingų medžiagų išmetimas iš ląstelės. Pastarojo mechanizmo indėlis yra pats didžiausias. Šiame darbe buvo sukurtas metodas, leidžiantis tiesiogiai vertinti antibiotikus išmetančių pompų veiklą bei efektyvumą, nenaudojant radioaktyvių ar toksiškų junginių. Labai svarbus šio metodo privalumas yra tai, kad tiriama bakterijų suspensija yra aeruojama pastovioje, kontroliuojamoje temperatūroje. E. coli atsparumą tetraciklinui [TetA(B)] ir P. aeruginosa daugiavaistį atsparumą lemiančių pompų tiesioginiam aktyvumo vertinimui buvo pritaikyti tetrafenilfosfonio (TPP+) jonai ir jiems atrankūs elektrodai. Buvo atrinktos sąlygos P. aeruginosa daugiavaistį atsparumą lemiančių pompų veiklos registravimui. Taip pat buvo nustatyta, kad TetA(B) kaip substratą gali naudoti ne tik tetracikliną, bet ir TPP+. Naudojantis sukurtu metodu galima greitai ir efektyviai įvertinti pompų slopiklių efektyvumą bei jų sąveiką su ląstelėmis. Šis metodas taip pat gali būti naudojamas, siekiant nustatyti antibiotikus išmetančių pompų veiklos skirtumus klinikiniuose bakterijų izoliatuose.