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Ni,Fe‐haltige Kohlenmonoxid‐Dehydrogenasen (CODHs) katalysieren die reversible Reduktion von CO2 zu CO. Mehrere anaerobe Mikroorganismen enthalten mehrere CODHs in ihrem Genom, von denen einigen, obwohl sie als CODHs annotiert sind, ein Cystein des kanonischen Bindungsmotivs für den Ni,Fe‐Cluster im aktiven Zentrum fehlt. Hier berichten wir über die Struktur und Reaktivität eines solchen abweichenden Enzyms, das als CooS‐VCh bezeichnet wird. Seine Struktur weist das typische CODH‐Gerüst auf, enthält aber einen Eisen‐Schwefel‐Oxo‐Hybrid‐Cluster. Obwohl es eng mit den echten CODHs verwandt ist, katalysiert CooS‐VCh weder die CO‐Oxidation noch die CO2‐Reduktion. Das aktive Zentrum der CooS‐VCh durchläuft eine redoxabhängige Umstrukturierung zwischen einem reduzierten [4Fe‐3S]‐Cluster und einem oxidierten [4Fe‐2S‐S*‐2O‐2(H2O)]‐Cluster. Hydroxylamin, ein langsam reagierendes Substrat von CooS‐VCh, oxidiert den Hybrid‐Cluster in zwei strukturell unterscheidbaren Schritten. Insgesamt reichen geringfügige Änderungen in CODHs aus, um einen Fe/S/O‐Cluster anstelle des Ni,Fe‐Heterokuban‐Clusters der CODHs unterzubringen. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The abnormality of the plasma membrane (PM) is an important biomarker for cell status and many diseases. Hence, visualizing the PM, especially in complex systems, is an emerging field in the life sciences, especially in low‐resource settings. Herein, we developed a water‐soluble PM‐specific probe utilizing electrostatic and hydrophobic interaction strategies with aggregation‐induced emission as the signal output. The probe could image the PM with many advanced features (wash‐free, ultrafast staining process, excellent PM specificity, and good biocompatibility), which were demonstrated by the PM imaging of neurons. The probe allowed for the first time the imaging of erythrocytes in the complex brain environment through a fluorescence‐based method. Moreover, the PM of the epidermal and partial view of the eyeball structure of live zebrafish are also revealed. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Many iron–sulfur proteins involved in cluster trafficking form [2Fe–2S]‐cluster‐bridged complexes that are often challenging to characterize because of the inherent instability of the cluster at the interface. Herein, we illustrate the use of fast, online buffer exchange coupled to a native mass spectrometry (OBE nMS) method to characterize [2Fe–2S]‐cluster‐bridged proteins and their transient cluster‐transfer intermediates. The use of this mechanistic and protein‐characterization tool is demonstrated with holo glutaredoxin 5 (GLRX5) homodimer and holo GLRX5:BolA‐like protein 3 (BOLA3) heterodimer. Using the OBE nMS method, cluster‐transfer reactions between the holo‐dimers and apo‐ferredoxin (FDX2) are monitored, and intermediate [2Fe–2S] species, such as (FDX2:GLRX5:[2Fe–2S]:GSH) and (FDX2:BOLA3:GLRX5:[2Fe–2S]:GSH) are detected. The OBE nMS method is a robust technique for characterizing iron–sulfur‐cluster‐bridged protein complexes and transient iron–sulfur‐cluster transfer intermediates. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Structure‐based drug development is often hampered by the lack of in vivo activity of promising compounds screened in vitro, due to low membrane permeability or poor intracellular binding selectivity. Herein, we show that ligand screening can be performed in living human cells by "intracellular protein‐observed" NMR spectroscopy, without requiring enzymatic activity measurements or other cellular assays. Quantitative binding information is obtained by fast, inexpensive 1H NMR experiments, providing intracellular dose‐ and time‐dependent ligand binding curves, from which kinetic and thermodynamic parameters linked to cell permeability and binding affinity and selectivity are obtained. The approach was applied to carbonic anhydrase and, in principle, can be extended to any NMR‐observable intracellular target. The results obtained are directly related to the potency of candidate drugs, that is, the required dose. The application of this approach at an early stage of the drug design pipeline could greatly increase the low success rate of modern drug development. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The lipopolysaccharide (LPS) O‐antigen structure of the plant pathogen Rhizobium radiobacter strain TT9 and its possible role in a plant‐microbe interaction was investigated. The analyses disclosed the presence of two O‐antigens, named Poly1 and Poly2. The repetitive unit of Poly2 constitutes a 4‐α‐l‐rhamnose linked to a 3‐α‐d‐fucose residue. Surprisingly, Poly1 turned out to be a novel type of biopolymer in which the repeating unit is formed by a monosaccharide and an amino‐acid derivative, so that the polymer has alternating glycosidic and amidic bonds joining the two units: 4‐amino‐4‐deoxy‐3‐O‐methyl‐d‐fucose and (2′R,3′R,4′S)‐N‐methyl‐3′,4′‐dihydroxy‐3′‐methyl‐5′‐oxoproline). Differently from the O‐antigens of LPSs from other pathogenic Gram‐negative bacteria, these two O‐antigens do not activate the oxidative burst, an early innate immune response in the model plant Arabidopsis thaliana, explaining at least in part the ability of this R. radiobacter strain to avoid host defenses during a plant infection process. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Heterocycles, a class of molecules that includes oxazoles, constitute one of the most common building blocks in current pharmaceuticals and are common in medicinally important natural products. The antitumor natural product nataxazole is a model for a large class of benzoxazole‐containing molecules that are made by a pathway that is not characterized. We report structural, biochemical, and chemical evidence that benzoxazole biosynthesis proceeds through an ester generated by an ATP‐dependent adenylating enzyme. The ester rearranges via a tetrahedral hemiorthoamide to yield an amide, which is a shunt product and not, as previously thought, an intermediate in the pathway. A second zinc‐dependent enzyme catalyzes the formation of hemiorthoamide from the ester but, by shuttling protons, the enzyme eliminates water, a reverse hydrolysis reaction, to yield the benzoxazole and avoids the amide. These insights have allowed us to harness the pathway to synthesize a series of novel halogenated benzoxazoles. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Spectroscopic and biophysical methods for structural determination at atomic resolution are fundamental in studies of biological function. Here we introduce an approach to measure molecular distances in bio‐macromolecules using 19F nuclear spins and nitroxide radicals in combination with high‐frequency (94 GHz/3.4 T) electron–nuclear double resonance (ENDOR). The small size and large gyromagnetic ratio of the 19F label enables to access distances up to about 1.5 nm with an accuracy of 0.1–1 Å. The experiment is not limited by the size of the bio‐macromolecule. Performance is illustrated on synthesized fluorinated model compounds as well as spin‐labelled RNA duplexes. The results demonstrate that our simple but strategic spin‐labelling procedure combined with state‐of‐the‐art spectroscopy accesses a distance range crucial to elucidate active sites of nucleic acids or proteins in the solution state. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Adenylation (A) domains act as the gatekeepers of non‐ribosomal peptide synthetases (NRPSs), ensuring the activation and thioesterification of the correct amino acid/aryl acid building blocks. Aryl acid building blocks are most commonly observed in iron‐chelating siderophores, but are not limited to them. Very little is known about the reprogramming of aryl acid A‐domains. We show that a single asparagine‐to‐glycine mutation in an aryl acid A‐domain leads to an enzyme that tolerates a wide range of non‐native aryl acids. The engineered catalyst is capable of activating non‐native aryl acids functionalized with nitro, cyano, bromo, and iodo groups, even though no enzymatic activity of wild‐type enzyme was observed toward these substrates. Co‐crystal structures with non‐hydrolysable aryl‐AMP analogues revealed the origins of this expansion of substrate promiscuity, highlighting an enlargement of the substrate binding pocket of the enzyme. Our findings may be exploited to produce diversified aryl acid containing natural products and serve as a template for further directed evolution in combinatorial biosynthesis. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Heterochromatin protein 1α (HP1α) undergoes liquid–liquid phase separation (LLPS) and forms liquid droplets and gels in vitro, properties that also appear to be central to its biological function in heterochromatin compaction and regulation. Here we use solid‐state NMR spectroscopy to track the conformational dynamics of phosphorylated HP1α during its transformation from the liquid to the gel state. Using experiments designed to probe distinct dynamic modes, we identify regions with varying mobilities within HP1α molecules and show that specific serine residues uniquely contribute to gel formation. The addition of chromatin disturbs the gelation process while preserving the conformational dynamics within individual bulk HP1α molecules. Our study provides a glimpse into the dynamic architecture of dense HP1α phases and showcases the potential of solid‐state NMR to detect an elusive biophysical regime of phase separating biomolecules. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Das De‐novo‐Design neuer Wirkstoffmoleküle ist nach wie vor eine anspruchsvolle Aufgabe bei der Suche nach wirksamen und selektiven Modulatoren für therapeutisch relevante Zielproteine. Hier berichten wir über die unerwartete Entdeckung eines peptidischen Liganden 1 durch Röntgenkristallographie, der vom therapeutischen Zielprotein MMP‐13 durch partiellen Selbstabbau generiert wurde, und die anschließende strukturbasierte Optimierung dieses Peptids zu einem hochwirksamen und selektiven β‐Faltblatt‐Peptidmimetikum der endogenen Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs). Der Einbau von nicht‐proteinogenen Aminosäuren in Kombination mit einer Zyklisierungsstrategie erwies sich als entscheidend für das De‐novo‐Design der TIMP‐Peptidmimetika. Das optimierte zyklische Peptid 4 (ZHAWOC7726) ist membrangängig, hat einen IC50‐Wert von 21 nm für MMP‐13 und ein vielversprechendes Selektivitätsprofil bezüglich eines polypharmakologischen Ansatzes mit den Anti‐Krebs‐Zielproteinen MMP‐2 (IC50: 170 nm) und MMP‐9 (IC50: 140 nm). Den Kreis schließen: Die kristallographische Entdeckung eines Peptids, das durch partiellen Selbstabbau des therapeutischen Ziels erzeugt wurde, ebnet den Weg für die De‐novo‐Erzeugung eines potenten und selektiven zyklischen Peptidmimetikums der endogenen Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs). [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Dipolar recoupling in solid‐state NMR is an essential method for establishing correlations between nuclei that are close in space. In applications on protein samples, the traditional experiments like ramped and adiabatic DCP suffer from the fact that dipolar recoupling occurs only within a limited volume of the sample. This selection is dictated by the radiofrequency (rf) field inhomogeneity profile of the excitation solenoidal coil. We employ optimal control strategies to design dipolar recoupling sequences with substantially larger responsive volume and increased sensitivity. We show that it is essential to compensate for additional temporal modulations induced by sample rotation in a spatially inhomogeneous rf field. Such modulations interfere with the pulse sequence and decrease its performance. Using large‐scale optimizations we developed pulse schemes for magnetization transfer from amide nitrogen to carbonyl (NCO) as well as aliphatic carbons (NCA). Our experiments yield a signal intensity increased by a factor of 1.5 and 2.0 for NCA and NCO transfers, respectively, compared to conventional ramped DCP sequences. Consistent results were obtained using several biological samples and NMR instruments. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Abstract: The mini fungal lectin PhoSL was recombinantly produced and characterized. Despite a length of only 40 amino acids, PhoSL exclusively recognizes N‐glycans with α1,6‐linked fucose. Core fucosylation influences the intrinsic properties and bioactivities of mammalian N‐glycoproteins and its level is linked to various cancers. Thus, PhoSL serves as a promising tool for glycoprofiling. Without structural precedence, the crystal structure was solved using the zinc anomalous signal, and revealed an interlaced trimer creating a novel protein fold termed β‐prism III. Three biantennary core‐fucosylated N‐glycan azides of 8 to 12 sugars were cocrystallized with PhoSL. The resulting highly resolved structures gave a detailed view on how the exclusive recognition of α1,6‐fucosylated N‐glycans by such a small protein occurs. This work also provided a protein consensus motif for the observed specificity as well as a glimpse into N‐glycan flexibility upon binding. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Abstract: Die Behandlung des nicht‐kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) erfährt derzeit eine Revolution. Innerhalb der letzten Dekade führten die gewonnenen Erkenntnisse über die biologische Bedeutung von Biomarkern und deren prädiktiver Charakter zur Entwicklung von Tyrosinkinase‐Inhibitoren, die eine Alternative zur Chemotherapie darstellen. Die Verwendung dieser innovativen Therapeutika verbessert die Lebensqualität und erhöht das Überleben betroffener Patienten. Das detaillierte Verständnis der Biologie der Zielproteine gepaart mit innovativen chemischen Ansätzen zu deren Modulation, ermutigten weitere Forschungen auf diesem Gebiet. Vor diesem Hintergrund präsentieren wir einen Rückblick auf ausgewählte molekulare Aspekte der Zielproteine und geben einen Überblick über aktuelle Fragestellungen und Herausforderungen bei der rationalen Wirkstoffentwicklung zur Behandlung von NSCLC. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Abstract: C‐rich DNA has the capacity to form a tetra‐stranded structure known as an i‐motif. The i‐motifs within genomic DNA have been proposed to contribute to the regulation of DNA transcription. However, direct experimental evidence for the existence of these structures in vivo has been missing. Whether i‐motif structures form in complex environment of living cells is not currently known. Herein, using state‐of‐the‐art in‐cell NMR spectroscopy, we evaluate the stabilities of i‐motif structures in the complex cellular environment. We show that i‐motifs formed from naturally occurring C‐rich sequences in the human genome are stable and persist in the nuclei of living human cells. Our data show that i‐motif stabilities in vivo are generally distinct from those in vitro. Our results are the first to interlink the stability of DNA i‐motifs in vitro with their stability in vivo and provide essential information for the design and development of i‐motif‐based DNA biosensors for intracellular applications. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The interplay between membrane proteins and the lipids of the membrane is important for cellular function, however, tools enabling the interrogation of protein dynamics within native lipid environments are scarce and often invasive. We show that the styrene-maleic acid lipid particle (SMALP) technology can be coupled with hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) to investigate membrane protein conformational dynamics within native lipid bilayers. We demonstrate changes in accessibility and dynamics of the rhomboid protease GlpG, captured within three different native lipid compositions, and identify protein regions sensitive to changes in the native lipid environment. Our results illuminate the value of this approach for distinguishing the putative role(s) of the native lipid composition in modulating membrane protein conformational dynamics. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Zielgerichtete kovalente Inhibitoren haben in der Wirkstoffentwicklung breite Beachtung gefunden, da sie in der Onkologie eine validierte Methode zur Verhinderung erworbener Resistenzen bieten. Dabei werden die Kristallstrukturen der Komplexe von Proteinen mit niedermolekularen Verbindungen verwendet, um fest bindende Liganden mit passend positionierten elektrophilen Gefechtsköpfen (“warheads”) zu entwickeln. Der Schwerpunkt liegt zwar auf Cysteinresten als Bindungsstellen, aber auch nukleophile Lysinreste können einen Zugang zu irreversibler Inhibierung bieten. Allerdings sind mit dieser Methode wegen der Basizität der ϵ‐Aminogruppe in Lysin eine Reihe spezifischer Herausforderungen verbunden. Wir besprechen hier die wichtigen Grundlagen für die Inhibitorplanung, geben historische Beispiele und stellen neue Entwicklungen vor, die das Potenzial von Lysin als Konjugationsstelle in der Wirkstoff‐Forschung belegen. Ziel erreicht: Zielgerichtete kovalente Inhibitoren haben in der Wirkstoff‐Forschung breite Beachtung gefunden. Dabei kommen vor allem Cysteinreste als Bindungsstellen in Betracht, aber auch ein Zugang über nukleophile Lysinreste kann realisierbar sein. Dieser Kurzaufsatz fasst die Grundlagen dieser Strategie zusammen, weist auf besondere Herausforderungen hin, nennt historische Beispiele und stellt neue Entwicklungen vor. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Glycosyltransferases (GTs) are a key family of enzymes that catalyze the synthesis of glycosidic bonds in all living organisms. The reaction involves the transfer of a glycosyl moiety and can proceed with retention or inversion of the anomeric configuration. To date, the catalytic mechanism of retaining GTs is a topic of great controversy, particularly for those enzymes containing a putative nucleophilic residue in the active site, for which the occurrence of a double-displacement mechanism has been suggested. We report native ternary complexes of the retaining glycosyltransferase α-1,3-galactosyltransferase (α3GalT) from Bos taurus, which contains such a nucleophile in the active site, in a productive mode for catalysis in the presence of its sugar donor UDP-Gal, the acceptor substrate lactose, and the divalent cation cofactor. This new experimental evidence supports the occurrence of a front-side substrate-assisted SNi-type reaction for α3GalT, and suggests a conserved common catalytic mechanism among retaining GTs. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Carbohydrate-based vaccines are among the safest and most effective vaccines and represent potent tools for prevention of life-threatening bacterial infectious diseases, like meningitis and pneumonia. The chemical conjugation of a weak antigen to protein as a source of T-cell epitopes generates a glycoconjugate vaccine that results more immunogenic. Several methods have been used so far to characterize the resulting polysaccharide-protein conjugates. However, a reduced number of methodologies has been proposed for measuring the degree of saccharide conjugation at the possible protein sites. Here we show that detailed information on large proteins conjugated with large polysaccharides can be achieved by a combination of solution and solid-state NMR spectroscopy. As a test case, a large protein assembly, l-asparaginase II, has been conjugated with Neisseria meningitidis serogroup C capsular polysaccharide and the pattern and degree of conjugation were determined. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The uridyl peptide antibiotics (UPAs), of which pacidamycin is a member, have a clinically unexploited mode of action and an unusual assembly. Perhaps the most striking feature of these molecules is the biosynthetically unique 3′-deoxyuridine that they share. This moiety is generated by an unusual, small and monomeric dehydratase, Pac13, which catalyses the dehydration of uridine-5′-aldehyde. Here we report the structural characterisation of Pac13 with a series of ligands, and gain insight into the enzyme's mechanism demonstrating that H42 is critical to the enzyme's activity and that the reaction is likely to proceed via an E1cB mechanism. The resemblance of the 3′-deoxy pacidamycin moiety with the synthetic anti-retrovirals, presents a potential opportunity for the utilisation of Pac13 in the biocatalytic generation of antiviral compounds. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Isovaleryl ‐ Coenzym A (IV ‐ CoA) ist eine wichtige Vorstufe für Isofettsäuren und Lipide, die in Myxobakterien essentiell für die Entwicklung sind. Myxobakterien können IV ‐ CoA aus Acetyl ‐ CoA über eine alternative IV ‐ CoA ‐ Biosynthese (aib) herstellen. Die zentrale Reaktion in aib wird durch die kofaktorfreie Decarboxylase AibA/AibB katalysiert. Wir entwickelten ein effizientes Expressionssystem für AibA/AibB, das die Bestimmung hochaufgelöster Kristallstrukturen im Komplex mit verschiedenen Liganden ermöglichte. Durch Mutation zeigen wir, dass ein Cystein, das als katalytisch wichtig beschrieben wurde, für die enzymatische Aktivität nicht benötigt wird. Stattdessen scheint AibA/AibB eine intramolekulare Decarboxylierung zu induzieren, indem es das Substrat in eine gebogene Konformation in der hydrophoben Tasche zwingt. Da AibA/AibB in der Produktion von Isobuten, einem Vorläufer für Biotreibstoff, eingesetzt werden könnte, eröffnet unsere Arbeit neue Wege in der synthetischen Biologie. Kraftstoff durch Enzyme? Für die Decarboxylase AibA/AibB wird anhand von Strukturstudien und biochemischen Analysen ein von der Geometrie und dem hydrophoben Charakter des aktiven Zentrums abhängiger, intramolekularer Decarboxylierungsmechanismus postuliert. Die Ergebnisse eröffnen Möglichkeiten für die synthetische Biologie, da AibA/AibB für die bakterielle Produktion von Isobuten, einem Vorläufer von erneuerbarem Biokraftstoff, geeignet ist. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Bacteria possess cytosolic proteins (Csp3s) capable of binding large quantities of copper and preventing toxicity. Crystal structures of a Csp3 plus increasing amounts of CuI provide atomic-level information about how a storage protein loads with metal ions. Many more sites are occupied than CuI equiv added, with binding by twelve central sites dominating. These can form [Cu4(S-Cys)4] intermediates leading to [Cu4(S-Cys)5]−, [Cu4(S-Cys)6]2−, and [Cu4(S-Cys)5(O-Asn)]− clusters. Construction of the five CuI sites at the opening of the bundle lags behind the main core, and the two least accessible sites at the opposite end of the bundle are occupied last. Facile CuI cluster formation, reminiscent of that for inorganic complexes with organothiolate ligands, is largely avoided in biology but is used by proteins that store copper in the cytosol of prokaryotes and eukaryotes, where this reactivity is also key to toxicity. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The stress-inducible molecular chaperone, HSP72, is an important therapeutic target in oncology, but inhibiting this protein with small molecules has proven particularly challenging. Validating HSP72 inhibitors in cells is difficult owing to competition with the high affinity and abundance of its endogenous nucleotide substrates. We hypothesized this could be overcome using a cysteine-targeted irreversible inhibitor. Using rational design, we adapted a validated 8- N-benzyladenosine ligand for covalent bond formation and confirmed targeted irreversible inhibition. However, no cysteine in the protein was modified; instead, we demonstrate that lysine-56 is the key nucleophilic residue. Targeting this lysine could lead to a new design paradigm for HSP72 chemical probes and drugs. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Über Jahrzehnte hinweg waren die Röntgenkristallographie und NMR ‐ Spektroskopie die wichtigsten Techniken, um atomare Strukturen von Makromolekülen zu erforschen. Aufgrund ihrer Größe, Instabilität, niedrigen Ausbeuten und anderen Faktoren sind jedoch viele Makromoleküle schwer zu kristallisieren oder nicht geeignet für NMR ‐ Studien. Die Kryo ‐ Elektronenmikroskopie (Kryo ‐ EM) benötigt keine Kristalle und ist deshalb oft die Methode der Wahl für makromolekulare Komplexe, die nicht kristallisiert werden können. Die Methode litt aber bisher unter der Einschränkung, dass selten atomare Auflösung erreicht wurde. Eine neue Generation von Detektoren, die in der Lage sind, einfallende Elektronen direkt zu messen, hat aber das Gebiet in den vergangenen drei Jahren revolutioniert. Mit dieser Technik gelingt es nun routinemäßig, die Strukturen von Makromolekülen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen. In diesem Aufsatz stellen wir einige der jüngsten Beispiele für hochaufgelöste Kryo ‐ EM ‐ Strukturen vor. Wir legen den Schwerpunkt auf Proteine mit pharmakologischer Relevanz, deren Strukturen mittels klassischer Kristallographie bisher nicht lösbar waren. Des Weiteren diskutieren wir Beispiele, in denen die Wechselwirkungen von Proteinen mit kleinen Molekülen bei atomarer Auflösung charakterisiert wurden. Abschließend erörtern wir die derzeitigen Grenzen der Kryo ‐ EM sowie wichtige Aspekte bezüglich ihrer Anwendung als Routine ‐ Methode für die Wirkstoffentwicklung. Eine neue Generation von Detektoren hat die Kryo ‐ Elektronenmikroskopie revolutioniert. Dieser Aufsatz diskutiert die Anwendung der Kryo ‐ EM in Strukturstudien pharmakologisch relevanter Makromoleküle, die sich klassischen Techniken entzogen haben. In vielen dieser Fälle wurden wirkstoffartige Moleküle identifiziert, was den Nutzen der Kryo ‐ EM für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung aufzeigt. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Sirtuins are protein deacylases regulating metabolism and stress responses, and are implicated in aging-related diseases. Small molecule activators for the human sirtuins Sirt1-7 are sought as chemical tools and potential therapeutics, such as for cancer. Activators are available for Sirt1 and exploit its unique N-terminus, whereas drug-like activators for Sirt2-7 are lacking. We synthesized and screened pyrrolo[1,2-a]quinoxaline derivatives, yielding the first synthetic Sirt6 activators. Biochemical assays show direct, substrate-independent compound binding to the Sirt6 catalytic core and potent activation of Sirt6-dependent deacetylation of peptide substrates and complete nucleosomes. Crystal structures of Sirt6/activator complexes reveal that the compounds bind to a Sirt6-specific acyl channel pocket and identify key interactions. Our results establish potent Sirt6 activation with small molecules and provide a structural basis for further development of Sirt6 activators as tools and therapeutics. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

In allen lebenden Zellen bildet die Transkription den ersten Schritt der Expression genetischer Information. Ihrer Regulation unterliegen Zelldifferenzierung, Morphogenese sowie Antworten auf Umweltveränderungen. Während der Transkription verwendet das Enzym RNA‐Polymerase DNA als Vorlage, um eine komplementäre RNA‐Kopie von einem Gen herzustellen. Wir beschreiben die Entwicklungen in unserem strukturellen Verständnis der Transkription in Eukaryoten, die in den letzten 10 Jahren nach der Verleihung des Nobelpreises für Chemie an Roger Kornberg im Jahr 2006 erzielt wurden. Eine Aufklärung der Transkriptionsinitiation und ‐elongation zeichnet sich ab, wohingegen die Mechanismen der Transkriptionsregulation weitgehend unverstanden bleiben. In diesem Feld wurden strukturbiologische Hybridmethoden entwickelt, die verschiedene Techniken zur Bestimmung der dreidimensionalen Architektur von großen und transienten makromolekularen Komplexen kombinieren. Atomare Einblicke: In den 10 Jahren seit der Verleihung des Nobelpreises an Roger Kornberg für seine Studien zur molekularen Grundlage der Gentranskription konnte das strukturelle Verständnis vieler Aspekte der Transkription signifikant vertieft werden. Insbesondere die jüngsten Entwicklungen in der Kryo‐Elektronenmikroskopie ermöglichen nun das Studium großer molekularer Komplexe in hoher Auflösung. Der derzeitige Stand der Forschung wird in diesem Kurzaufsatz diskutiert. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Current distance measurements between spin-labels on multimeric protonated proteins using double electron-electron resonance (DEER) EPR spectroscopy are generally limited to the 15-60 Å range. Here we show how DEER experiments can be extended to dipolar evolution times of ca. 80 μs, permitting distances up to 170 Å to be accessed in multimeric proteins. The method relies on sparse spin-labeling, supplemented by deuteration of protein and solvent, to minimize the deleterious impact of multispin effects and substantially increase the apparent spin-label phase memory relaxation time, complemented by high sensitivity afforded by measurements at Q-band. We demonstrate the approach using the tetradecameric molecular machine GroEL as an example. Two engineered surface-exposed mutants, R268C and E315C, are used to measure pairwise distance distributions with mean values ranging from 20 to 100 Å and from 30 to 160 Å, respectively, both within and between the two heptameric rings of GroEL. The measured distance distributions are consistent with the known crystal structure of apo GroEL. The methodology presented here should significantly expand the use of DEER for the structural characterization of conformational changes in higher order oligomers. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

The thermodynamic properties of a ligand in the bound state affect its binding specificity. Strict binding specificity can be achieved by introducing multiple spatially defined interactions, such as hydrogen bonds and van der Waals interactions, into the ligand-receptor interface. These introduced interactions are characterized by restricted local dynamics and improved surface complementarity in the bound state. In this study, we experimentally evaluated the local dynamics and the surface complementarity of weak-affinity ligands in the receptor-bound state by forbidden coherence transfer analysis in free-bound exchange systems (Ex-FCT), using the interaction between a ligand, a myocyte-enhancer factor 2A (MEF2A) docking peptide, and a receptor, p38α, as a model system. The Ex-FCT analyses successfully provided information for the rational design of a ligand with higher affinity and preferable thermodynamic properties for p38α. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Programs of drug discovery generally exploit one enantiomer of a chiral compound for lead development following the principle that enantiomer recognition is central to biological specificity. However, chiral promiscuity has been identified for a number of enzyme families, which have shown that mirror-image packing can enable opposite enantiomers to be accommodated in an enzyme's active site. Reported here is a series of crystallographic studies of complexes between an enzyme and a potent experimental herbicide whose chiral center forms an essential part of the inhibitor pharmacophore. Initial studies with a racemate at 1.85 Å resolution failed to identify the chirality of the bound inhibitor, however, by extending the resolution to 1.1 Å and by analyzing high-resolution complexes with the enantiopure compounds, we determined that both enantiomers make equivalent pseudosymmetric interactions in the active site, thus mimicking an achiral reaction intermediate. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

An approach to the de novo structure prediction of proteins is described that relies on surface accessibility data from NMR paramagnetic relaxation enhancements by a soluble paramagnetic compound (sPRE). This method exploits the distance-to-surface information encoded in the sPRE data in the chemical shift-based CS-Rosetta de novo structure prediction framework to generate reliable structural models. For several proteins, it is demonstrated that surface accessibility data is an excellent measure of the correct protein fold in the early stages of the computational folding algorithm and significantly improves accuracy and convergence of the standard Rosetta structure prediction approach. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has the intrinsic capabilities to investigate proteins in native environments. In general, however, NMR relies on non-natural protein purity and concentration to increase the desired signal over the background. We here report on the efficient and specific hyperpolarization of low amounts of a target protein in a large isotope-labeled background by combining dynamic nuclear polarization (DNP) and the selectivity of protein interactions. Using a biradical-labeled ligand, we were able to direct the hyperpolarization to the protein of interest, maintaining comparable signal enhancement with about 400-fold less radicals than conventionally used. We could selectively filter out our target protein directly from crude cell lysate obtained from only 8 mL of fully isotope-enriched cell culture. Our approach offers effective means to study proteins with atomic resolution in increasingly native concentrations and environments. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

[NiFe]‐Hydrogenasen katalysieren die reversible heterolytische Spaltung von Wasserstoff in Protonen und Elektronen. Das tief im Protein liegende aktive Zentrum wird dabei von gasförmigen Substraten und Inhibitoren über Tunnel erreicht. Hier wird die Proteinstruktur der O2‐toleranten, membrangebundenen [NiFe]‐Hydrogenase von Ralstonia eutropha (ReMBH) anhand von Proteinkristallen beschrieben, die mit Krypton derivatisiert wurden. Die Positionen der Kryptonatome ermöglichen eine umfassende Beschreibung des Gastunnelnetzwerks. Eine detaillierte Übersicht von Größe, Länge und Route der Tunnel wurde mithilfe von Rechnungen erstellt. Vergleicht man die Tunneleigenschaften der ReMBH mit Kristallstrukturen anderer O2‐toleranter und O2‐sensitiver [NiFe]‐Hydrogenasen hinsichtlich der Größe und Anzahl der hydrophoben Gastunnel, ergeben sich wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Einige sind womöglich auf die bemerkenswerte Eigenschaft der Sauerstofftoleranz zurückzuführen. Blick in den Tunnel: In [NiFe]‐Hydrogenasen wird das tief im Protein liegende aktive Zentrum von gasförmigen Reaktanten über Tunnel erreicht. Nun gelang die Aufklärung der Proteinstruktur der O2‐toleranten, membrangebundenen [NiFe]‐Hydrogenase von Ralstonia eutropha anhand von Krypton‐derivatisierten Proteinkristallen. Die Positionen der Kryptonatome im Zusammenhang mit entsprechenden Rechnungen ermöglichen eine umfassende Beschreibung des Gastunnelnetzwerks innerhalb des Enzyms. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

RNA‐Schalter unterscheiden genau zwischen ihren eigentlichen Liganden und chemisch ähnlichen Molekülen. Ein bemerkenswertes Beispiel für eine sehr hohe Ligandenspezifität ist ein synthetischer auf Neomycin reagierender RNA‐Schalter. Paromomycin unterscheidet sich von Neomycin nur durch die Substitution einer Amino‐ durch eine Hydroxygruppe. Es bindet ebenfalls an den Neomycin‐RNA‐Schalter, schaltet ihn aber nicht. Hier zeigen wir, dass der Verlust einiger weniger wichtiger intermolekularer Wechselwirkungen an einer einzigen Position des Paromomycin‐Komplexes zu globalen Änderungen in der Konformationsdynamik der RNA führt. Außerdem identifizieren wir ein Netzwerk an intramolekularen Wechselwirkungen, über die der Verlust der lokalen intermolekularen Wechselwirkungen in entfernte Bereiche des Moleküls kommuniziert und in Änderungen der globalen Dynamik übersetzt wird. Daher beruht die Spezifität dieses RNA‐Schalters auf Unterschieden in der strukturellen Dynamik und nicht auf statischen Strukturunterschieden. Feinheiten: Ein synthetischer Neomycin‐RNA‐Schalter bindet auch Paromomycin, das sich von Neomycin nur durch die Substitution einer Amino‐ durch eine Hydroxygruppe unterscheidet, wird von diesem Liganden aber nicht geschaltet, da der Verlust einiger weniger wichtiger intermolekularer Wechselwirkungen an einer einzigen Position des Paromomycin‐Komplexes zu globalen Änderungen in der Konformationsdynamik der RNA führt. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

N-glycosylation is a fundamental modification of proteins and exists in the three domains of life and in some viruses, including the chloroviruses, for which a new type of core N-glycan is herein described. This N-glycan core structure, common to all chloroviruses, is a pentasaccharide with a b-glucose linked to an asparagine residue which is not located in the typical sequon N-X-T/S. The glucose is linked to a terminal xylose unit and a hyperbranched fucose, which is in turn substituted with a terminal galactose and a second xylose residue. The third position of the fucose unit is always linked to a rhamnose, which is a semiconserved element because its absolute configuration is virus-dependent. Additional decorations occur on this core N-glycan and represent a molecular signature for each chlorovirus. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Kalt erwischt: Der Nobelpreis für Chemie 2017 geht an Jacques Dubochet, Joachim Frank und Richard Henderson für die Entwicklung der Kryo‐Elektronenmikroskopie (Kryo‐EM) zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen in Lösung. Dieses Highlight beschreibt, wie sich die Methode der Kryo‐EM vom Bau des ersten Transmissionselektronenmikroskops im Jahr 1931 bis zur heutigen, ausgereiften Technik entwickelt hat (Beispiel: Struktur eines F‐Aktins). [ABSTRACT FROM AUTHOR]

MAS ‐ NMR ‐ Spektroskopie wurde verwendet, um die Struktur und Dynamik der Membrananker ‐ Domäne von YadA (YadA ‐ M) direkt in der bakteriellen Außenmembran zu untersuchen, in der das Protein exprimiert wurde. YadA ist ein Adhäsin des Pathogens Yersinia enterocolitica, das an Interaktionen mit Wirtszellen beteiligt ist und darüber hinaus auch als Modellprotein zu Studien des Autotransportprozesses dient. Mithilfe von 13C ‐ 13C ‐ DARR ‐ und PDSD ‐ Spektren bei unterschiedlichen Mischzeiten konnten wir existierende chemische Verschiebungen für einen weiten Bereich von YadA ‐ M in der Lipidmembran übertragen. Die chemischen Verschiebungen von YadA ‐ M waren in den meisten Regionen im Vergleich zu denen in mikrokristallinen Präparationen, auf deren Basis bereits eine Struktur gelöst wurde, unverändert. Das trifft insbesondere auf die ASSA ‐ Region zu, die vermutlich als Übergangszustand während des Transports der löslichen Domäne eine Haarnadelstruktur einnimmt. Vergleiche der Dynamik zwischen mikrokristallinen und in der Membran eingebetteten Proben zeigen eine höhere Flexibilität der ASSA ‐ Region in den Außenmembran ‐ Präparationen bei physiologischen Temperaturen. Diese Studie wird den Weg für die MAS ‐ NMR ‐ basierte Strukturberechnung von Membranproteinen und für ein besseres Verständnis der Funktion von dynamischen Proteinbereichen in nativen Membranen bereiten. In nativer Umgebung: Festkörper ‐ NMR ‐ Spektroskopie wurde genutzt, um die Struktur und Dynamik der Membrananker ‐ Domäne von YadA direkt in der Außenmembran von E. coli zu untersuchen, in der das Protein exprimiert wurde. YadA ist ein Adhäsin des Pathogens Yersinia enterocolitica und beteiligt an Interaktionen mit der Wirtszelle; es ist auch ein Modellprotein für Studien zum Autotransportprozess. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Raman optical activity (ROA) is an advanced technique capable of detecting structural deformations of light-absorbing molecules embedded in chromophoric proteins. Resonance Raman (RR) spectroscopy is widely used to enhance the band intensities. However, theoretical work has predicted that under resonance conditions the ROA spectrum resembles the shape of the RR spectrum. Herein, we use photoactive yellow protein (PYP) to measure the first experimental data on the effect of changing the excitation wavelength on the ROA spectra of a protein. We observe a close similarity between the shape of the RR spectrum and the resonance ROA spectrum of PYP. Furthermore, we experimentally verify the theoretical prediction concerning the ratio of the amplitudes of the ROA and Raman spectra. Our data demonstrate that selecting an appropriate excitation wavelength is a key factor for extracting structural information on a protein active site using ROA spectroscopy. [ABSTRACT FROM AUTHOR]