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Ammonium is a ubiquitous key nutrient in agricultural soils and the preferred nitrogen source for plants. However, excessive ammonium accumulation represses plant growth and development. Ammonium is taken up by plant cells via high-affinity ammonium transporters (AMTs). Six AMT genes were identified in Arabidopsis, which are separated in two distinct clades, five AMT1s and one AMT2. In the plasma membrane, AMT proteins form homo- and heterotrimers with extra-cytoplasmic N-termini and cytoplasmic C-termini. In addition to transcriptional and post-transcriptional control of AMTs by ammonium, phosphorylation in the C-terminus serves as a rapid allosteric switch of the AMT activity and prevents further internal ammonium accumulation. In a physiological screen, a kinase (CIPK23) was identified, which directly regulates ammonium transport activity under high-NH4+ conditions. Interestingly, CIPK23 is already known to regulate nitrate and potassium uptake in roots. Lesion of the CIPK23 gene significantly increased ammonium uptake, but caused growth inhibition. As expected, cipk23 plants were also limited in potassium accumulation, but high potassium availability failed to rescue the cipk23 phenotype. Furthermore, cipk23 plants were more susceptible to methylammonium (MeA), a non-metabolizable analogue of ammonium. The sensitivity to MeA was lost upon genetic suppression of AMT1 genes in the cipk23 background. The data suggest that CIPK23 directly phosphorylates AMT1s in a complex with CBL1 (calcineurin B-like protein) and thereby regulates transport activity. The expression of the CIPK23 and the CBL1 genes were ammonium-dependent and increased when N-starved plants were resupplied with ammonium. Furthermore, cbl1 mutants had enhanced NH4+ accumulation; this phenocopies the larger ammonium uptake in the cipk23 loss-of-function mutant. In vivo experiments demonstrated bimolecular interaction between CIPK23, AMT1;1, and AMT1;2, but not with AMT2;1, suggesting direct phosphorylation of AMT1-type ammonium transporters by CIPK23. However, Western blot analysis with the cipk23 mutant suggested that the loss of the kinase was not sufficient to completely abolish AMT1;1 and AMT1;2 phosphorylation, indicating several independent pathways to regulate ammonium transport activity in AMT trimers. The data identify complex post-translational regulation of ammonium transporters via the CBL1–CIPK23 pathway, which ensures reduction of AMT1 activity and suppression of ammonium uptake under high external NH4+ concentrations. Ammonium ist ein ubiquitäres Schlüsselelement in landwirtschaftlichen Böden und ist die bevorzugte Stickstoffquelle von Pflanzen. Exzessive Stickstoffakkumulation hemmt allerdings Pflanzenwachstum und -entwicklung. Pflanzen nehmen Ammonium mittels hoch-affiner Ammonium Transporter (AMTs) auf. In Arabidopsis wurden sechs AMT Gene identifiziert, die in zwei verschiedene Gruppen eingeteilt wurden, fünf AMT1 und ein AMT2. AMT-Proteine formen Homo- und Heterotrimere in der Plasmamembran mit extracytoplasmatischen N-termini und cytoplasmatischen C-termini. Zusätzlich zu transkriptioneller und post-translationaler Kontrolle der AMTs durch Ammonium, dient eine Phosphorylierung am C-terminus als ein schneller allosterischer Schalter der AMT-Aktivität und verhindert eine weitere interne Ammoniumakkumulation. In einem physiologischen Test wurde eine Kinase (CIPK23) identifiziert, welche die Aktivität der AMTs bei hohen externen Ammoniumkonzentrationen direkt reguliert. Interessanterweise ist schon bekannt, dass CIPK23 auch die Aufnahme von Nitrat und Kalium reguliert. Ein defektes CIPK23 Gen erhöhte den Transport von Ammonium signifikant, aber die Pflanzen waren in ihrem Wachstum gehemmt. Wie erwartet waren cipk23 Mutanten auch in ihrer Kaliumaufnahme limitiert, aber ein hohes Kaliumangebot konnte diesen Phänotyp nicht vollständig komplementieren. Weiterhin waren cipk23 Pflanzen sensitiver für Methylammonium (MeA), ein toxisches Ammoniumanalog. Wenn die Expression der AMT1 Gene unterdrückt wurde, reagierten die cipk23 Mutanten weniger empfindlich auf MeA. Die Daten deuten darauf hin, dass CIPK23 in einem Komplex mit CBL1 (Calcineurin B-like protein) die AMT1 Proteine direkt phosphoryliert und dadurch ihre Transportaktivität reguliert. Die Expression der CIPK23 und CBL1 Gene war abhängig vom Ammoniumangebot und steigerte sich, wenn Stickstoff limitierte Pflanzen mit Ammonium wiederversorgt wurden. Weiterhin hatten cbl1 Pflanzen eine erhöhte Ammoniumakkumulation und ahmten damit den Effekt eines cipk23 Funktionsverlusts nach. In vivo Experimente demonstrierten eine bimolekulare Interaktion zwischen CIPK23, AMT1;1 und AMT1;2, aber nicht mit AMT2;1, was auf eine direkte Phosphorylierung der AMT1s durch CIPK23 hinweist. Allerdings verhinderte der Verlust der Kinase nicht komplett die Phosphorylierung von AMT1;1 und AMT1;2, was mehrere unabhängige Wege zur Regulation der Aktivität der AMT-Trimere nahelegt. Die Daten legen eine vielschichtige post-transkriptionelle Regulation der Ammoniumtransporter via dem CBL1-CIPK23-Komplex nahe, die sicherstellt, dass die Aktivität der AMT1s reduziert und die Ammoniumaufnahme bei hohen externen Ammoniumkonzentrationen verhindert wird.