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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 DNA topoisomerases são enzimas que participam de diversos processos celulares tais como: replicação, transcrição, recombinação e segregação dos cromossomos. Atuando na clivagem transitória de uma fita (tipo I) ou ambas as fitas (tipo II) da molécula de DNA, as topoisomerases são alvos de agentes bactericidas e de drogas antitumorais e podem ser um importante alvo para quimioterapia de doenças causadas por parasitos. Neste estudo, descrevemos e caracterizamos os genes que codificam as topoisomerases tipo II de Trypanosoma rangeli (TrTop2). Os genes TrTop2 apresentaram um quadro aberto de leitura com 3.696 (TrTop2mt) e 4.368 pares de bases (TrTop2?), codificando polipeptídios preditos de 1.232 (138,8 kDa) e 1.456 (164,1 kDa) aminoácidos, respectivamente. Ambos os genes apresentaram uma alta similaridade da sequência protéica com topoisomerases ortólogas de outros tripanosomatídeos, sobretudo com T. cruzi (96% e 85%). Entre os dois genes a similaridade a nível de aminoácidos foi de 56%, sendo ambos de cópia única no genoma do T. rangeli. Anticorpos dirigidos a fragmentos protéicos de ambas as proteínas foram utilizados em ensaios de western blot e revelaram bandas de aproximadamente 130 kDa em extratos protéicos totais de T. rangeli. Embora com tamanho similar, foram identificadas proteínas distintas quando avaliadas por eletroforese 2D (pI 6,4 e 7,6). Através de géis de poliacrilamida em condições não desnaturantes foi possível determinar que ambas as proteínas nativas formam um complexo protéico de alto peso molecular indicando uma possível interação entre proteínas ou subunidades. Ensaios de imunolocalização com os distintos anticorpos contra DNA topoisomerases II apontaram diferentes padrões de localização celular, com reconhecimento no núcleo ou no cinetoplasto em formas epimastigotas e em alguns casos dispersa no citoplasma de formas tripomastigotas. A novobiocina, inibidor de topoisomerases tipo II procarióticas, foi ativo in vitro contra o T. rangeli. Acima de 300 ?g/ml observa-se uma redução no crescimento dos parasitos com alterações morfológicas e estruturais a nível nuclear e do cinetoplasto. Acima de 150 ?g/ml observa-se completa inibição da diferenciação celular in vitro. Utilizando as proteínas mtHSP70, DHLADH e a DNA topoisomerase II mitocondrial (TrTop2mt) como marcadores biológicos, foi observado redução da expressão das mesmas durante a diferenciação do T. rangeli, assim como nos tratamentos com novobiocina. Conclui-se que eventos relacionados as DNA topoisomerases II podem ser essenciais na redução do crescimento e da diferenciação celular do T. rangeli.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2022. As leishmanioses são consideradas doenças infecciosas antropozoonóticas, causadas por parasitos protozoários do gênero Leishmania. A forma mais grave da doença é a leishmaniose visceral (LV), causada pela Leishmania infantum, sendo uma doença potencialmente fatal e que afeta o sistema fagocítico mononuclear. O cão doméstico é o principal reservatório de L. infantum no ambiente urbano de transmissão. Até 2007, a região Sul do Brasil não era considerada endêmica para LV, entretanto surtos de leishmaniose visceral canina (LVC) ocorreram a partir de 2008, sendo seguidos da ocorrência de casos de LV em humanos. Além de ser uma área endêmica recente, um cenário epidemiológico diferenciado é observado em Florianópolis, SC, no qual, a presença do vetor clássico da LV, Lutzomyia longipalpis, não foi registrada até o momento. O uso do medicamento Milteforan® para o tratamento da LVC vem ocorrendo no Brasil desde 2016, mas poucos estudos investigaram a sua real eficácia em populações de cães naturalmente infectados. Portanto, o monitoramento clínico e da carga parasitária de cães tratados é de suma importância para avaliar a eficácia do medicamento e o prognóstico da infecção em cães submetidos ao tratamento. Sendo assim, este projeto teve como objetivo avaliar aspectos clínicos, parasitológicos e histopatológicos de cães naturalmente infectados por L. infantum, no município de Florianópolis, antes e após o tratamento com Milteforan®. No presente estudo, foram coletadas amostras de pele e linfonodo de 24 cães antes (T0) e depois do tratamento (T1- 31 dias após o início e T2 ? 6 meses após o fim do tratamento). Os cães apresentaram uma redução significativa no número de parasitos/mg de tecido (pele) após o tratamento com Milteforan®. Os resultados mostraram também uma diminuição nos valores de estadiamento clínico dos cães após tratamento. Este estudo demonstrou que valores de estadiamento clínico, quantidade de macrófagos contendo amastigotas de Leishmania spp. e do infiltrado inflamatório em derme e epiderme dos cães com LV variaram em função da carga parasitária. Além disso, os resultados demonstram que a carga parasitária na pele de cães que receberam esquema terapêutico 1 (Milteforan®+alopurinol+domperidona) foi menor do que a encontrada em animais que realizaram esquema terapêutico 2 (Milteforan® ou Milteforan®+alopurinol ou Milteforan®+imunoterapia) considerando o tempo de seis meses após o tratamento. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o tratamento com Milteforan® leva a uma diminuição da carga parasitária após o tratamento, assim como a melhora dos sinais clínicos, demonstrando a eficácia do tratamento a despeito de não haver cura parasitológica. Abstract: Leishmaniasis are considered anthropozoonotic infectious diseases caused by protozoa parasites of the genus Leishmania. The most severe form of the disease is the visceral leishmaniasis (VL), caused by Leishmania infantum, being a potentially fatal disease that affects the mononuclear phagocytic system. The domestic dog is the main reservoir of L. infantum in the urban transmission environment. Until 2007, the southern region of Brazil was not considered endemic for VL, however outbreaks of canine visceral leishmaniasis (CVL) occurred from 2008 onwards, being followed by the occurrence of VL cases in humans. In addition to being a recent endemic area, a different epidemiological scenario is observed in Florianópolis, SC, in which the presence of the classic VL vector, Lutzomyia longipalpis, has not been recorded so far. The use of the drug Milteforan®, for the treatment of CVL, has been happening in Brazil since 2016, but few studies have investigated its real effectiveness in populations of naturally infected dogs. In this way, the clinical and parasite load monitoring of treated dogs is important to assess the efficacy of the drug and the prognosis of infection in dogs undergoing treatment. Therefore, this project aimed to evaluate clinical, parasitological and histopathological aspects of dogs naturally infected with L. infantum, in the city of Florianópolis, before and after the treatment with Milteforan®. In the present study, skin and lymph node samples were collected from 24 dogs before (T0) and after treatment (T1- 31 days after initiation and T2 - 6 months after the end of treatment). Dogs showed a significant reduction in the number of parasites/mg tissue (skin) after treatment with Milteforan®. The results also showed a decrease in the clinical staging values of dogs after treatment. This study demonstrated that clinical staging values, amount of macrophages containing Leishmania spp. and the inflammatory infiltrate in the dermis and epidermis of dogs with VL varied according to the parasite load. In addition, the results demonstrate that the parasite load on the skin of dogs that received therapeutic regimen 1 (Milteforan®+alopurinol+domperidona) was lower than that found in animals that underwent therapeutic regimen 2 (Milteforan® or Milteforan®+alopurinol or Milteforan®+imunoterapia), considering the time of six months after treatment. Taken together, the results obtained in this work demonstrate that treatment with Milteforan® leads to a decrease in the parasite load after treatment, as well as an improvement in clinical signs, demonstrating the effectiveness of the treatment despite the lack of parasitological cure.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2020. Os tripanosomatídeos possuem uma estrutura celular particular, possuindo um único flagelo que emerge da bolsa flagelar sendo aderido ao corpo celular através da zona de adesão flagelar (FAZ). Esta região define o sítio de início da fenda de clivagem durante o processo de divisão celular e, dentre as proteínas envolvidas nestes processos, a FLA1BP e a CIF1 foram descritas em Trypanosoma brucei, sendo essenciais para a adesão flagelar (FLA1BP) e regulação da citocinese (CIF1). Como são escassos estudos comparando essas proteínas em outras espécies, o presente trabalho buscou investigar a diversificação destas proteínas em tripanosomatídeos, especialmente no gênero Trypanosoma. A análise de genômica comparativa de diferentes espécies revelou a ausência de conservação de sequências de CIF1, incluindo a ausência de domínios proteicos, assim como uma diversificação das proteínas que interagem com CIF1, podendo indicar que T. brucei passou por adaptações na via de ativação da citocinese. Em Trypanosoma rangeli, CIF1 não possui os domínios coiled-coil e zinc finger, sendo 28% idêntica à TbCIF1 e possuindo menos sítios de fosforilação quanto comparada à esta. Além disso, os níveis de transcrição e de expressão da TrCIF1 não são alterados durante a divisão celular, podendo sugerir uma função distinta desta proteína em T. rangeli. Quanto à FLA1BP, observou-se que os genes encontrados em T. rangeli e Trypanosoma cruzi estão presentes em cópia única no genoma e são sintênicos à TbFLA1BP e, apesar de divergências nas sequências, a localização e a função desta proteína parecem ser conservadas dentro do gênero Trypanosoma. Uma análise comparativa de sequências de FLA1BP de diferentes espécies, revelou uma sequência conservada de 12 aminoácidos polares e hidrofóbicos, os quais podem constituir um domínio de endereçamento ou ancoramento de FLA1BP na FAZ. Nossos resultados sugerem que a ativação da citocinese em T. brucei pode não ser conservada em relação aos demais tripanosomatídeos, porém a adesão flagelar dependente de FLA1BP é conservada. Abstract: Trypanosomatids possess a unique cell structure, containing a single flagellum emerging from the flagellar pocket which is attached along the cell body through the flagellar attachment zone (FAZ). The distal end of the FAZ defines the site for initiation of the cleavage furrow during cell division. Among several proteins involved in such processes, FLA1BP and CIF1 were described in Trypanosoma brucei and are essential for flagellar adhesion (FLA1BP) and cytokinesis regulation (CIF1). Due to the lack of comparative studies of these proteins in other trypanosomatids species, we aimed to investigate the presence and the variability of FLA1BP and CIF1 within the Trypanosoma genus. Comparative genome analysis shows the absence of domains and sequence conservation of T. brucei CIF1 and CIF1-interacting proteins in other species, suggesting adaptations of the cytokinesis activation in this taxon. The Trypanosoma rangeli CIF1 is 28% identical to TbCIF1, lacks the coiled-coil and zinc finger domains and contains fewer phosphorylation sites when compared to TbCIF1. Also, TrCIF1 transcription and expression levels are not related to cell division, might be indicating a distinct role of CIF1 in this species. The T. rangeli and Trypanosoma cruzi FLA1BP genes are single-copy genes syntenic to TbFLA1BP and, despite sequence divergencies, the localization and function of FLA1BP appear to be conserved within the Trypanosoma genus. Alignment of the FLA1BP sequence from different species revealed a conserved 12 amino acid sequence composed by polar and hydrophobic residues that may constitute the addressing or anchoring domain of FLA1BP on the FAZ. Our results indicate a conserved FLA1BP role in flagellar attachment among Trypanosomes and suggest that cytokinesis activation in T. brucei has diverged from other trypanosomatids.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. O Trypanosoma rangeli, é um protozoário de ciclo heteroxênico, e para que esta alternância de hospedeiros ocorra, o parasito possui uma regulação gênica em nível pós- transcricional, que permite rápida mudança nos padrões de expressão gênica, possibilitando uma adaptação do parasito a diferentes ambientes. As amastinas constituem uma família multigênica, subdividida em quatro grupos: a, ß, ? e d. Genes representativos de amastinas estão presentes no genoma do T. rangeli, mas o seu padrão de expressão, localização celular, envolvimento na interação com células do hospedeiro neste parasito ainda precisam ser investigados. Sendo assim, este estudo, têm como objetivo avaliar o ciclo celular do Trypanosoma rangeli com a finalidade de atribuir o possível papel das amastinas e tuzina na interação parasito/hospedeiro. Neste trabalho foram identificados 21 (sendo quatro genes truncados) genes pertencentes à família das amastinas, divididos em sete grupos, e um gene referente à tuzina e ambos com localização membranar. Através de uma análise filogenética, classificar esses genes de amastinas como pertencentes ao grupo das a, ß e d-amastinas. Analisamos dois genes de duas diferentes subfamílias TrAma7_1 (ß ?amastina) e TrAma4_1 (a-amastina) quanto a produção dos níveis de transcritos e de expressão proteica, observamos que ambos os genes produzem níveis de transcritos nas formas evolutivas epimastigotas e tripomastigotas com diferença entre as mesmas, mas, apenas para TrAma4_1 foi observada a expressão proteica no Western blot. Para Tuzina, observamos que as mesmas encontram-se intercaladas no genoma com as d-amastinas, e apresar de os níveis de transcritos serem diferentes entre diferentes formas evolutivas analisadas, os níveis de proteína expressa são iguais entre todas as formas, tanto para T. rangeli e T. cruzi. Com isso, observamos então que o nível de proteína expressa não é estágio dependendo como a produção dos níveis de transcritos, para ambos os genes. Parasitos da cepa Choachí de T. rangeli foram transfectados com amastinas de T. cruzi de duas diferentes subfamílias e com a TrAma4_1 de T. rangeli fusionadas com GFP, e com base nos resultados encontrados no estudo in vivo da infecção experimental com essas cepas transfectadas em comparação com a cepa parental pudemos observar que não houveram diferenças significativas na evolução da infecção. Abstract : Trypanosoma rangeli is a protozoan of heteroxenic cycle and for this host alternation to occur the parasite has a post-transcriptional level of gene regulation that allows a rapid change in the gene expression patterns, allowing an adaptation of the parasite to different environments. The amastins constitute a multigenic family, subdivided into four groups: a, ß, ? and d. Representative amastin genes are present in the T. rangeli genome, but their pattern of expression, cell localization, involvement with host cells interaction in this parasite still needs to be investigated. Thus, this study aims to evaluate the cell cycle of Trypanosoma rangeli in order to attribute the possible role of amastines and tuzin in the parasite/host interaction. In this work 21 genes (those: four are truncated genes) were identified belonging to the amastine family, divided into seven groups, and one gene related to the tuzin and both of them with membrane localization. Through a phylogenetic analysis, these amastine genes were classify belonging to the a, ß and d-amastins group. We analyzed two different genes from two different amastin subfamilies: TrAma7_1 (ß-amastine) and TrAma4_1 (a -amastine) for the production of transcript levels and protein expression, and we observed that both genes produce levels of transcripts in epimastigote and trypomastigote evolutionary forms with difference between thenselves but only for TrAma4_1 was observed protein expression in the Western blot. For Tuzin, we observed that they are intercalated in the genome with the d-amastines, and the transcript levels are different between different evolutionary forms analyzed, expressed protein levels are equal between all forms, both for T. rangeli and T. cruzi. So, until now we observed that the protein expression levels are not stage specific, diferent os the transcriptions levels. Parasites of T. rangeli strain Choachi were transfected with four different T. cruzi amastins from two different subfamilies and with T. rangeli TrAma4_1 and fused with GFP, and based on the results found in the in vivo study of the experimental infection with these strains transfected into comparison with the parental strain showed that there were no significant differences in the evolution of the infection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2019. Trypanosoma rangeli é um parasito da família Trypanosomatidae, e tem como hospedeiros diferentes espécies de mamíferos e triatomíneos em comum com o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas. Esses parasitos possuem grande semelhança gênica e proteica, o que pode dificultar o diagnóstico da Doença de Chagas e gerar resultados falso-positivos. Entre as proteínas com alta similaridade compartilhadas entre esses parasitos está a GP63, uma metaloprotease pertencente ao grupo das metzincinas encontrada predominantemente na superfície dos parasitos. A GP63 de T. rangeli pode ser classificada em três grupos, que possuem diferenças principalmente na região do sítio catalítico, sugerindo diferenças na atividade desta enzima. Para melhor entender essas diferenças o objetivo deste trabalho foi caracterizar os diferentes grupos de GP63 de T. rangeli. Para isto foi realizada uma busca dos membros de GP63 no genoma de T. rangeli, por três diferentes abordagens, encontrando-se 131 sequências completas, sendo 109 de GP63_1, 18 de GP63_2 e 4 de GP63_3. Realizando uma análise filogenética das sequências observou-se que os membros de GP63_2 são agrupados em um mesmo clado, bem como para GP63_3. De modo esperado, a análise de conservação dos resíduos de aminoácidos relacionados ao motivo mostrou que os membros da GP63_1 são mais divergentes. Foi realizada a predição da localização celular e observou-se que 30 destas provavelmente possuem endereçamento para localização na superfície do parasito. A análise do transcritoma de T. rangeli mostrou que membros de GP63 possuem transcrição diferencial, dependendo da forma evolutiva em que o parasito se encontra. Além disso, os três diferentes grupos de GP63 foram encontradas no secretoma de formas de cultura de epi e tripomastigotas de T. rangeli. Foi realizado também a modelagem tridimensional de um membro de cada grupo, observando que as diferenças no motivo podem resultar em diferenças na atividade catalítica destas proteínas. Por fim, foram realizadas clonagens em vetor de expressão e transfecção de parasitos para melhor entender a função dos diferentes grupos de GP63 de Trypanosoma rangeli. Abstract : Trypanosoma rangeli is a parasite that belongs to the Trypanosomatidae family. Its hosts are different species of mammals and triatomines in common with Trypanosoma cruzi, etiological agent of Chagas Disease. These parasites share high genic and protein resemblance and it can complicate the Chagas Disease diagnostic with false-positives results. Among the high similar protein, it is the GP63, a metalloprotease that belongs to the metzincin group, found mainly in the parasites surface. The T. rangeli GP63 can be classified into three groups, which have differences mainly on the catalytic site region, suggesting different enzyme activity. In order to better understand those differences, the goal of this study was to characterize the different GP63 groups of T. rangeli. To reach this goal, it was performed a search for GP63 members on the T. rangeli genome by three different approaches, finding 131 complete sequences, in which 109 are GP63_1, 18 are GP63_2 and 4 are GP63_3. By a phylogenetic analysis of the sequences it was seen that the members of GP63_2 are grouped in the same clade, as well as the GP63_3 members. As expected, an analysis of the conserved amino acids residues related to the motif showed that the GP63_1 members are the most divergent. By the cellular localization prediction, it was observed that 30 of the proteins have a probable surface localization. The transcriptome analysis of T. rangeli showed that different GP63 have a differential transcription, regarding the evolution form of the parasite. Besides, the three groups were found on the secretome of culture epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. It was done the tridimensional of one member of each group, observing that the differences on the motif can result in catalytic activity differences of these enzyme. Lastly, transfections of expression vectors cloned were done to better understand the function of the different groups of GP63 of Trypanosoma rangeli.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2018. Leishmanioses são doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania sp. (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), transmitidas pela da picada de flebotomíneos fêmeas. Três formas clínicas distintas são descritas para as leishmanioses: cutânea, mucocutânea e visceral. A leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave, de elevada mortalidade se não tratada,que possui a espécie Leishmania infantum como agente etiológico nas Américas. O vetor canônico de LV é Lutzomyia longipalpis e o cão doméstico é considerado o principal reservatório. Embora mais de 96% dos casos de LV nas Américas ocorram no Brasil, a região Sul era considerada uma área livre de LV até 2008. Atualmente, a LV canina (LVC) está se espalhando rapidamente em todos os estados do sul, havendo um consequente aumento no número de casos humanos com alta taxa de letalidade. Santa Catarina foi o último estado do país a diagnosticar casos de LV humana (LVH), sendo que o município de Florianópolis possui uma prevalência de 3,4% de LVC. Porém, o principal vetor, Lu. longipalpis, não é encontrado nessa região. Sendo SC uma das áreas endêmicas mais recentes de transmissão de LV no Brasil o objetivo deste trabalho foi estudar a introdução de L. infantum em Florianópolis a partir da análise da variabilidade genética de cepas locais e pesquisar as possíveis espécies de vetores nesta região. Dos casos positivos registrados no município entre 2010 e 2016, foram obtidas amostras de 58 cães e dois casos humanos. A confirmação da espécie L. infantum nessas amostras ocorreu via PCR dos marcadores kDNA e ITS-1. Além disso, foi possível isolar as cepas de 43 dessas amostras. Para tentar identificar a variabilidade genética dos isolados foi realizada a padronização de um painel de marcadores para análise de sequências multilocus (MLSA) de L. infantum. Após amplificação e sequenciamento de 10 desses marcadores de algumas cepas isoladas e a comparação com as sequências de cepas de outros estados do país não foi observado nenhum polimorfismo, indicando baixa variabilidade. Visto que em Florianópolis não há o vetor clássico de LV foram coletados mais de 1.000 flebotomíneos em um dos bairros de Florianópolis (Pantanal) com um grande número de cães diagnosticados com LV. A população de flebotomíneos foi maior nos meses mais quentes do ano e a espécie mais prevalente foi Pintomyia fischeri. Dos indivíduos coletados 365 tiveram o DNA extraído e 31 apresentaram PCR positivo para Leishmania spp., sendo estes das espécies Pi. fischeri, Migonemyia migonei e Nyssomyia neivai.Os resultados sugerem que estas espécies podem participar no ciclo de transmissão dessa parasitose, sendo necessário os estudos de comprovação da competência vetorial. Os dados apontam o rápido espalhamento da doença no município de Florianópolis, sendo que os resultados dos estudos sobre LV nesta região fornecem subsídios para medidas de controle dessa parasitose. Abstract : Leishmaniasis comprises a group of diseases caused by parasites of the genus Leishmania (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), that are transmitted by bite of infected female phlebotomine. Three major clinical forms of leishmaniasis are found: visceral (VL), cutaneous (CL) and mucocutaneous (ML). Visceral leishmaniasis is the most severe clinical form of the disease, caused by Leishmania infantum in Americas. The canonical vector is Lutzomyia longipalpis and the domestic dog is considered the main reservoir. More than 96% of the human cases of VL (HVL) in the Americas occur in Brazil. However, southern Brazil was a VL-free area up to 2008. Nowadays, canine VL (CVL) is spreading rapidly in all southern States, where the number of human cases is increasing, showing high lethality rates. Santa Catarina is the last state on the country to diagnose autochthonous HVL cases, and nowadays a serological survey in dogs from Florianópolis (SC) revealed a CVL prevalence of 3.4%. As the most recent established endemic area of VL transmission in Brazil, the goal of the present proposal was to study the introduction of L. infantum in Florianópolis, thought the genetic variability comparisons of local strains and determine the parasite vector(s).From positive cases registered in Florianópolis between 2010-2016, samples from 58 CVL cases and 2 HVL cases were obtained. All samples were diagnosed with L. infantum, confirmed by PCR (kDNA and ITS-1) and sequencing. Also, 43 L. infantum strains from VL cases have been isolated. The genetic variability of the strains was performed using the multilocus sequence analysis (MLSA). PCR amplification and sequencing were performed for 10 loci using four local strains. These sequences were compared with sequences from other Brazilian states, however no polymorphic site was found, suggesting low variability. Since Florianópolis is an area without Lu. Longipalpis, the capture of phlebotomine sandflies was initiated, and more than 1,000 individuals were collected in a locality of Florianópolis with CVL cases. The predominant specie was Pintomyia. fischeri and the phlebotomine population had a marked reduction during the winter (June-September). DNA was extracted for 365 female phlebotomines and 31 revealed positive PCR amplification for Leishmania spp., including specimens from Pi. fischeri, Migonemyia migonei e Nyssomyia neivai. The results suggest the possible participation of these three phlebotomine species in the parasite transmission, being necessary the study of their vectorial competence. Our data pointed out to the rapid spreading of VL in Florianópolis, and studies about LV in this region can improve the control strategies for this disease.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2017. A radiação UVB que atinge a superfície terrestre está intimamente associada à redução da camada de ozônio. Nos ambientes aquáticos, dependendo da profundidade e transparência da água, a radiação UVB pode penetrar e atingir os organismos que ali vivem. Por sua vez, os organismos podem apresentar diferentes estratégias para evitar, atenuar e reparar os danos causados pela alta incidência da radiação UVB, que incluem estratégias comportamentais, morfológicas e fisiológicas. Macrobrachium olfersii é um camarão de água doce que vive e se reproduz em águas rasas e transparentes e seus embriões estão expostos à radiação durante os estágios do desenvolvimento. O objetivo deste trabalho foi investigar a existência de genes da fotoliase e avaliar os seus níveis de transcritos em embriões M. olfersii, bem como investigar o mecanismo de fotorreparo mediado pela fotoliase aos danos de DNA induzidos pela radiação UVB. Nossos resultados mostraram que a radiação UVB provocou dano ao DNA das células embrionárias de M. olfersii, reconhecido pela formação de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPD). A primeira evidência de fotorreparo foi obtida quando os embriões mantidos em luz visível apresentaram redução do número CPD. O próximo passo foi investigar a existência do gene da fotoliase em embriões de M. olfersii, sendo identificadas duas sequências de fotoliases (phr 1 e phr 2), as quais pertencem ao grupo das fotoliases da classe II (CPDII fotoliase). Os transcritos dos genes phr 1 e phr 2 foram identificados em diferentes estágios do desenvolvimento. Os níveis de transcritos dos genes phr 1 e phr 2 em embriões expostos a dose de 558 J.cm-2 de radiação UVB não variaram em 3 h, 6 h e 12 h após à exposição. Embriões expostos à diferentes doses de radiação UVB não demonstraram modulação dose-dependente da transcrição de phr 1 e phr 2. Adicionalmente, embriões provenientes do ambiente e expostos à radiação solar natural foram avaliados e mostraram elevado nível de transcritos de phr 1, bem como a atividade de fotorreparo. Neste trabalho, descrevemos pela primeira vez duas fotoliases em embriões de M. olfersii e sua atividade no reparo de danos ao DNA. Esses resultados ampliam o conhecimento sobre as respostas celulares e os mecanismos de reparo frente ao insulto provocado pela radiação UVB. Abstract : The UVB radiation that reaches the Earth surface is closely associated with the reduction of the ozone layer. In aquatic environments, depending on the depth and transparency of water, UVB radiation can penetrate and compromise the organisms. On the other hand, the organisms can show distinct strategies to avoid, attenuate and repair damage caused by the high incidence of UVB radiation, including behavioral, morphological and physiological strategies. Macrobrachium olfersii is freshwater prawn that lives and reproduces in shallow and transparent waters, and their embryos are exposed to radiation during the developmental stages. The aim of this study was to investigate the existence of the photolyase gene and to evaluate its transcript levels in embryos of M. olfersii, as well as to investigate the mechanism of photolyase-mediated photorepair to DNA damage induced by UVB radiation. Our results showed that UVB radiation caused DNA damage in embryonic cells of M. olfersii, by cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) formation. The first evidence of photorepair was obtained when the embryos kept in visible light showed reduction on the number of CPD. The next step was to investigate the existence of the photolyase gene in M. olfersii embryos, having been identified two sequences of photolyases (phr 1 and phr 2), which belong to the class II photolyase group (CPDII photolyase). The transcripts of phr 1 and phr 2 were identified at different developmental stages. Transcript levels of phr 1 and phr 2, in embryos exposed to the dose of 558 J.cm-2 UVB radiation, did not change 3 h, 6 h and 12 h after exposure. Embryos exposed to different doses of UVB radiation did not show phr 1 and phr 2 dose-dependent transcription modulation. Additionally, embryos from both the environment and exposed to natural sun radiation were evaluated showing high levels of phr 1 transcripts, as well as photorepair activity. In this study, we identified for the first time two photolyases in M. olfersii embryos and also their activity on DNA damage repair. These results contribute to the knowledge regarding cellular responses and repair mechanisms against insults produced by the UVB radiation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada. Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito. Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015 O Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma rangeli são duas espécies de protozoários de ocorrência simpátrica entre as Américas do Sul e Central e que compartilham os mesmos hospedeiros invertebrados, hospedeiros mamíferos silvestres e domésticos, incluindo seres humanos. Uma vez que infecções mistas T. rangeli/T. cruzi já foram relatadas para diversos hospedeiros, buscamos gerar ferramentas para analisar a dinâmica da co-infecção, tendo gerado cepas de ambas as espécies que expressassem marcadores fluorescentes diferentes. Após a obtenção das cepas transfectadas, as mesmas foram clonadas e ensaios de PFGE confirmaram a integração dos plasmídeos pTREXmRFP/pTREXnGFP-Neo, pTREXmRFP-Hygro e pROCKGFP-Neo no genoma dos parasitos. Com estas ferramentas foi possível realizar um estudo quantitativo da cinética da infecção mista e das variações populacionais dos parasitos em ambos os hospedeiros mamífero e invertebrado. A avaliação do crescimento em diferentes proporções das duas espécies em co-cultivo axênico em meio LIT não revelou diferenças significativas se comparado ao cultivo isolado de cada cepa. Infecções de células THP-1 com os parasitos transfectados revelou uma diferença significativa no que diz respeito às cepas selvagens e transfectadas de T. cruzi, sendo caracterizada por um número menor de formas amastigotas por célula infectada em relação à cepa parental nos tempos de 2, 4, 8 e 24 h de infecção, porém ao comparar as taxas e tempos de multiplicação de cada uma das cepas, as diferenças não foram significativas. Ensaios preliminares in vitro da interação de hemócitos extraídos de Rhodnius prolixus com uma cepa de T. rangeli transfectada com o plasmídeo pTREXnGFP-Neo permitiram evidenciar uma rápida interação do parasito com estes tipos celulares, sendo registrada a internalização em várias situações, não sendo evidenciados sinais de multiplicação do T. rangeli nestes tipos celulares. Foram também realizados ensaios preliminares in vivo de co-infecção de Rhodnius prolixus por T. cruzi e T. rangeli, revelando uma resposta diferencial frente à infecção exclusiva pelo T. cruzi e T. rangeli em relação à co- infecção neste vetor. Em camundongos Balb/C a infecção prévia pelo T. rangeli não foi capaz de gerar uma proteção significativa contra a infecção subsequente pelo T. cruzi, porém é capaz de gerar uma redução da parasitemia causada pelo T. cruzi além de aumentar a sobrevida dos animais infectados.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. A família das trans-sialidases (TS) é a maior família gênica de Trypanosoma cruzi. O grupo II da superfamília TS reúne diversas glicoproteínas (entre elas, a gp82 e a gp85) presentes na superfície das formas tripomastigotas do T. cruzi. A gp82 está envolvida no processo de adesão do parasito à célula hospedeira e a gp85 na adesão e penetração. Embora sialidases estejam presentes no T. rangeli, a função destas proteínas no ciclo de vida deste parasito ainda não foi esclarecida. Em função disso, o objetivo deste estudo foi estudar os genes de T. rangeli relacionados à superfamília das TS e avaliar a expressão heteróloga da gp82 de T. cruzi por T. rangeli (T. rangeli-gp82). Inicialmente, foram identificadas no genoma do T. rangeli oito ORFs completas similares a gp82 e gp85 de T. cruzi. Por se tratar de várias cópias gênicas, diferentes sequências foram analisadas a partir de amplificação e clonagem destes genes em duas cepas de T. rangeli. As sequências avaliadas continham de um a dois motivos Asp, um motivo subterminal, sítio de ancoramento a GPI e um domínio que pertence a superfamília das glucanases/lectina tipo Concanavalina A. Após a obtenção da cepa recombinante T. rangeli-gp82, observou-se que a gp82 foi expressa na superfície dos parasitos de forma semelhante ao T. cruzi. Além disso, a expressão da gp82 não interferiu nos padrões de crescimento e de diferenciação in vitro do T. rangeli. Em ensaios de interação destes parasitos com células Vero, verificamos um maior número de parasitos da cepa T. rangeli-gp82 nas células hospedeiras em relação à cepa selvagem, além de um maior número de parasitos aderidos às células em relação as demais cepas analisadas. Tanto as formas epimastigotas quanto tripomastigotas de T. rangeli-gp82 foram capazes de mobilizar cálcio intracelular. Estes resultados diferem do observado na interação com células THP-1, onde não verificamos diferença significativa entre T. rangeli-gp82 e as demais cepas analisadas. Em triatomíneos, verificamos que a cepa T. rangeli-gp82 apresenta desenvolvimento semelhante à cepa selvagem, sendo capaz de colonizar a hemolinfa e invadir as glândulas salivares de R. prolixus. Em camundongos, tripomastigotas de todas as cepas de T. rangeli foram observados na corrente sanguínea de animais C57BL/6 infectados via intraperitoneal, porém não foi observada proliferação, sendo a cinética parasitêmica similar para todas as cepas do T. rangeli. Quando estes camundongos foram desafiados com T. cruzi, não observamos alteração na parasitemia deste parasito em relação à infecção controle, entretanto houve uma diminuição do parasitismo tecidual por este parasito nos animais pré-infectados com as três cepas de T. rangeli, principalmente T. rangeli-selvagem e GFP. Com estes resultados, podemos inferir que a proteína gp82 facilita a adesão e penetração do parasito a célula hospedeira, entretanto a expressão desta proteína pelo T. rangeli não promove uma proteção substancial contra a infecção por T. cruzi.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013 As trans-sialidades de Trypanosoma cruzi (TcTS) são capazes de clivar resíduos de ácidos siálicos da célula hospedeira e transferí-los à superfície do parasito, e portanto, fundamentais nessa interação. Já o Trypanosoma rangeli, considerado não patogênico para mamíferos e com ciclo desconhecido nestes hospedeiros, possui no seu genoma genes similares aos membros da família das Trans-sialidase (TS), embora sem nenhuma atividade catalítica. Uma vez que essa atividade está relacionada a pontos cruciais do ciclo do parasito patogênico e que, a ausência de atividade TS em T. rangeli é apontada como um dos motivos de sua incapacidade de infectar e sobreviver em células de mamíferos, o objetivo do presente trabalho foi estudar o envolvimento da TS a partir daexpressão heteróloga de uma TcTS ativa pelo T. rangeli. Após a transfecção e a confirmação da atividade de TS em T. rangeli transfectado (T. rangeli TcTS), ninfas de 4° e 5° estágio de Rhodnius prolixus (R. prolixus) foram infectadas por inoculação intracelômica com formas epimastigotas de T. rangeli selvagem e T. rangeli TcTS. Observamos uma diferença estatística no número de glândulas infectadas para T. rangeli selvagem (92%), e T. rangeli TcTS (16%), seis semanas p.i.. A infecção em camundongos BALB/c e C57BL/6 não revelou diferenças na de parasitemia entre parasitos selvagens e transfectados. Já nos ensaios de infecção in vitro utilizando-se células Vero, observou-se que o T.rangeli TcTS apresentou maior capacidade de infecção quando comparados ao T. rangeli selvagem, não sendo observado nenhum indício de divisão celular para esses parasitos após 120 horas de interação. Os resultados apontam que a expressão heteróloga da TcTS por T. rangeli embora não altere o tempo e o padrão da parasitemia experimental in vivo em camundongos, promoveu mudanças no comportamento da interação parasito-vetor e parasito-célula, reduzindo sua capacidade de penetração nas glândulas salivares de R. prolixus e facilitando a entrada do parasito em células in vitro. Abstract: The Trypanosoma cruzi trans-sialidases (TcTS) are able to cut and transfer sialic acid from the host cell to the parasite surface and are important molecules on this interaction. Trypanosoma rangeli is a non-pathogenic parasite to mammal, that posses an unknown life cicle in this host, and it has similar genes to TS family members in the genome, however, with no catalytic activity. Once TS are crucial molecules involved in parasite-host cell interaction in the pathogenic parasite, and the absence of TS activity is pointed as one of the reasons of its inability capacity of infecting and surviving in mammals cells, the aim of this work was to study the roll of TS in the host-parasite interaction using T. rangeli expressing an active TcTS (T. rangeli TcTS). After transfection and assessment of protein activity, 4° and 5° instar nymphs of Rhodnius prolixus were infected by intracelomic inoculation of T. rangeli wild type and T. rangeli TcTS epimastigote forms. A statistically significant difference was observed in the number of salivary gland infected for T. rangeli wild type (92%) and for T. rangeli TcTS (16%) at six weeks p.i.. Parasitemia of BALB/c mice and C57BL/6 infected by T. rangeli TcTS showed no difference from mice infected with non-transfected parasites. For in vitro infection assays with Vero cells, T. rangeli TcTS presented higher infection rates when compared with T. rangeli wild type, but no indication of intracellular division was detected for these parasites up to 120 hours. Despite not altering the parasitemia in mice, our results indicate that TcTS expressed by T. rangeli may be responsible for changes on the interaction between vector-parasite and cell-parasite by reducing the ability to penetrate on R. prolixus salivary glands and facilitating cell entry in vitro.