Search

Nanofibers biofunctionalized with enzymes are materials of interest in the biomedical field due to their potential application in wound healing. This work describes the production and characterisation of electrospun chitosan nanofibers biofunctionalized with a microbial collagenase. The morphology and microstructure of the chitosan nanofibers prepared with Nanospider technology were examined using a scanning electron microscope (SEM). Amino groups of a chitosan nanofiber were connected with the carboxylic acid groups of the collagenase using EDAC and sulfo-NHS methodology. Collagenase enzymatic activity was evaluated with a peptidic substrate (Pz-peptide, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg) in order to estimate the ability of this biomaterial to be used as an enzymatic debriding wound dressing. The characterisation of collagenase chitosan nanofibers in terms of measuring apparent Michaelis-Menten constants (KM(app) and vmax) revealed a higher enzyme to substrate affinity than with the soluble form of the collagenase. The resulting novel collagenase chitosan nanofibers exhibited excellent operational stability and long shelf life for at least 6 weeks. Therefore, the novel collagenase chitosan nanofibers are expected to be a potential scaffold for wound healing applications, such as e.g. enzymatic debridement.

The electrospun chitosan nanofibers provide excellent material for immobilized proteolytic enzymes, and are biocompatible, nontoxic and hydrophilic matrices with large specific area. This paper deals with an application of electrospun chitosan nanofibers and optimizing conditions for their biofunctionalization by model proteolytic enzyme trypsin. Nanofibers fromchitosan were prepared using Nanospider™ technology and covalent immobilization of trypsin followed. Three immobilization techniques preserving biocompatibility and utilizing amine and/or hydroxyl groups of chitosan were optimized and compared to simple adsorption to achieve maximum proteolytic activity per cm2 of the functionalized chitosan nanofibers (Tryp-NF). Significant differences were observed. Trypsin immobilized by the carbodiimide one-step protocol demonstrated the highest activity of the three procedures, ranging from 132 to 210 IU/cm2 (i.e., 548–874 IU/mg of nanofibers), depending on the initial amount of trypsin used. Long-term storage stability together with high reusability of Tryp-NF confirmed advantages of the immobilized enzyme. Tryp-NF showed no cytotoxicity toward growth of HeLa cells. The in vivo tests for irritation and skin sensitization demonstrated no undesirable skin reactions., Kovalentní biofunkcionalizace chitosanových nanovláken s trypsinem s vysokou enzymovou stabilitou. Elektrozvlákněná chitosanová nanovlákna slouží jako výborný materiál pro imobilizaci proteolytických enzymů, jsou biokompatibilní, netoxické a hydrofilní matricí s velkým specifickým povrchem.

The success of microfluidic immunocapture based on magnetic beads depends primarily on a sophisticated microscale separation system and on the quality of the magnetic immunosorbent. A microfluidic chip containing a magnetically stabilized fluidized bed (MSFB), developed for the capture and on-chip amplification of bacteria, was recently described by Pereiro etal.. The present work shows the thorough development of anti-Salmonella magnetic immunosorbents with the optimal capture efficiency and selectivity. Based on the corresponding ISO standards, these parameters have to be high enough to capture even a few cells of bacteria in a proper aliquot of sample, e.g. milk. The selection of specific anti-Salmonella IgG molecules and the conditions for covalent bonding were the key steps in preparing an immunosorbent of the desired quality. The protocol for immunocapturing was first thoroughly optimized and studied in a batchwise arrangement, and then the carrier was integrated into the MSFB chip. The combination of the unique design of the chip (guaranteeing the collision of cells with magnetic beads) with the advanced immunosorbent led to a Salmonella cell capture efficiency of up to 99%. These high values were achieved repeatedly even in samples of milk differing in fat content. The rate of nonspecific capture of Escherichia coli (i.e. the negative control) was only 2%., Účinnost vychytávání patogenních bakterií z mléka je silně závislá na kvalitě imunosorbentu, nosiči na bázi superparamagnetických částic, jejichž povrch je biofunkcionalizován specifickými protilátkami. MSFB systém - mikrofluidní separátor s integrovaným magnetem stabilizovaným fluidním ložem byl použit k izolaci a také k namnožení počtu patogenních bakterií pro další analýzu, např. PCR metodu pro průkaz bakteirální DNA. Selekttivita i specificita záchytu je klíčová pro praktické využití analyzátoru, je nutné dosáhnout parametrů, které vyžadují ISO standardy pro průkaz patogenů v potravinách. V práci je popsána biofunkcionalizace magnetických částic a jejich použití pro izolaci patogenů, buněk Salmonella sp. Sledovali jsme účinnost záchytu, výtěžnost, ale i specificitu záchytu, křížová reaktivita nebyla prokázána, míra nespecifické sorpce (směs Salmonella, E. coli) byla pouze 2%.

With the advent of micro- and nanotechnology, major advances and breakthroughs have taken place in many areas, such as biotechnology, medicine, pharmacy or material industry. Gold nanoparticles (AuNPs) with their unique optical and physical properties as well as biocompatibility have already proved themselves to be powerful tool in biological applications. In this work, AuNPs were selected as a potential electrochemically active label. With the aim to use them as an electrochemical active tag, two types of AuNPs were tested and suitable protocols for their functionalization were optimized. Non-functionalized AuNPs were modified with thiolated DNA oligonucleotides using Au-S bond. Such conjugates could be potentionally used as a DNA probe. Functionalized AuNPs containing carboxyl groups were also modified, but with specific antibodies. In this case, the goal was to optimize suitable protocol for effective modification performed with carbodiimide crosslinker enabling direct and covalent immobilization. Finally, quality of AuNPs-IgG was defined by experiments via detection of bacterial cells in model samples.

The purpose of the paper is to describe the production and characterization of electrospun chitosan nanofibers and chitosan/TPP nanoparticles as carriers for microbial collagenase. Thie eproteolytic highly active and stable carriers have potential of advanced bioactive wound dressings. The morphology and the microstructure of nanofibers and nanoparticles were examined using a scanning electron microscopy and dynamic light scattering. Low molecular weight chitosan/TPP nanoparticles prepared ratio 2:1 showed size range 130 – 142 nm. Specific collagenase activity 0.545 x 10-3 U/ mg for chitosan nanofibers and 0.684 x 10-3 U/mg of nanoparticles was quantified using the hydrolysis of a peptidic substrate (Pz-peptide) and is expressed per mass of chitosan biomaterial. Storage stability and reusability collagenase chitosan nanofibers and collagenase chitosan nanoparticles did not fall under 73% of original activity., Účelem této práce je příprava a charakterizace nanočástic z chitosanu, které sloužily jako nosič mikrobiální kolagenázy (EC 3.4.24.3) a jejich srovnání s chitosanovými nanovlákny s kolagenázou. Morfologie a mikrostruktura nanočástic a nanovláken byly sledovány pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu. Hydrodynamická velikost připravených nanočástic byla sledována měřením dynamického rozptylu světla s použitím nízkomolekulárního chitosanu a TPP v poměru 2: 1 byla v rozsahu 130 - 142 nm. Pro kvantifikaci specifické aktivity kolagenázy imobilizované na obou biomateriálech byla použita metoda hydrolýzy peptidového substrátu (Pz-peptidu). Stabilita při skladování a operační stabilita kolagenázy na chitosanových nanovláknech a chitosan/TPP nanočásticích neklesla pod 73% původní aktivity.

Tato disertační práce se zabývá biofunkcionalizací vybraných moderních materiálů (nanovlákna a magnetické částice) pro účely bioafinitních separací v mikrofluidním uspořádání nebo pro podporu hojení ran nosičem s imobilizovanými proteolytickými enzymy. V první části práce je popsána biofunkcionalizace nově připravených magnetických částic proteolytickým enzymem trypsinem. Vazba trypsinu byla optimalizována a byla stanovena skladovací i operační stabilita bioaktivního nosiče. Enzym trypsin v tomto případě sloužil jako modelový biokatalyticky aktivní ligand, jehož přítomnost a aktivitu lze snadno monitorovat pomocí reakce s nízkomolekulárním chromogenním substrátem. Dále byl enzym trypsin vázán na nanovlákna připravená metodou elektrospinningu, která se po biofunkcionalizaci stala výchozím materiálem pro nový typ bioaktivního krytu ran vhodného pro proteolytické štěpení nekrotické tkáně a debridementu v ráně. Druhá část práce se zabývala povrchovou modifikací magnetických mikročástic polymerem poly(ethylenglykolem) (PEG). Tento inertní polymer zvyšuje biokompatibilitu nosiče a snižuje nespecifickou adsorpci proteinů a buněk na jeho povrch, zároveň i snižuje adhezi částic na vnitřní stěny mikrofluidních čipů. Je-li navíc použit derivát poly(ethylenglykolu) s vhodnými terminálními skupinami, je možné ho využít jako tzv. ?raménko? pro imobilizaci bioaktivních látek. Magnetické částice byly PEGylovány a poté biofunkcionalizovány specifickými anti-EpCAM protilátkami. Tento nosič byl použit pro imunomagnetický záchyt EpCAM-pozitivních buněčných linií (modelový systém pro cirkulující nádorové buňky) v mikrofluidním uspořádání. Dosažená účinnost záchytu buněk byla porovnávána s analogickým komerčně dostupným nosičem. Poslední část práce byla směřována k vývoji specifického imunosorbentu pro mikrofluidní záchyt modelového mikroorganismu, Salmonella Typhimurium, v mléčných výrobcích. Pro přípravu nosiče byly vybrány vhodné magnetické částice i protilátky. Po vazbě protilátek by, This Ph.D. thesis deals with the biofunctionalization of selected modern materials (nanofibers and magnetic microspheres) for the purposes of bioaffinity separations in microfluidic systems or the promotion of wound healing using a carrier with immobilized proteolytic enzymes. In the first part of the thesis the magnetic microspheres were biofunctionalized with proteolytic enzyme trypsin. Method for trypsin immobilization was optimized, and storage as well as operational stabilities of the prepared bioactive carrier were monitored. Here the enzyme trypsin served as a model biocatalytic ligand whose presence and activity can be easily followed by reaction with a low molecular-weight chromogenic substrate. Enzyme trypsin was also immobilized on the electrospun nanofibers with the aim to prepare a new type of bioactive wound dressing for enhanced proteolytic cleavage of necrotic tissue, i.e. enzymatic wound debridement. The second part of the thesis deals with the surface modification of magnetic microspheres with the inert polymer poly(ethylene glycol) (PEG). Generally PEG increases the biocompatibility of carriers and decreases the nonspecific adsorption of proteins and cells. At the same time, it reduces the carrier´s adhesion on the inner walls of microfluidic chips. Moreover when a PEG derivative with suitable terminal groups is immobilized it can be also utilized as a spacer for subsequent binding of bioactive ligands. Here magnetic microspheres were PEGylated and biofunctionalized with specific anti-EpCAM antibodies. The carrier was applied for microfluidic immunomagnetic separation of EpCAM-positive cell lines (model system for circulating tumour cells). The capture efficiency of cells was compared with the results achieved with the analogous commercial carrier. The last part of this thesis was intended to the development of specific immunosorbent for microfluidic immunocapture of a model microorganism, Salmonella Typhimurium, in dairy products. Both magnetic p, Fakulta chemicko-technologická

Diplomová práce pojednává o zavedení a optimalizaci metody ELISA pro průkaz a kvantifikaci specifických anti-CAI protilátek v lidském séru. Test by měl sloužit pro vyšetření pacientů s hematoonkologickým onemocněním. Byla provedena optimalizace podmínek stanovení a tyto podmínky byly poté použity pro proměření pěti neznámých vzorků séra od pacientů s mnohočetným myelomem, kteří byli léčeni vysokodávkovým ozařováním s následnou transplantací kmenových buněk. Teoretická část shrnuje poznatky o jednotlivých druzích EIA metod, o indikátorech používaných pro imunoanalytické metody, o možnostech, jak zvýšit citlivost detekce. V závěrečné kapitole jsou zmíněny přístroje pro automatizaci imunoenzymatických metod., The thesis discusses the implementation and optimization of ELISA methods for the detection and quantification of specific anti-CAI antibodies in human serum. The test should be used for the evaluation of patients with hematooncological disease. The optimization of assay conditions was performed and these conditions were then used for the measurement of five unknown serum samples of multiple myeloma patients treated by high dose irradiation with subsequent stem cell transplantation. The theoretical part summarizes information on various types of EIA methods, the indicators used for immunoassays, ways how to increase the detection sensitivity. The final chapter describes devices for automation of immunoenzymatic methods, Fakulta chemicko-technologická

Bakalářské práce se zabývá rozvojem technik pro izolaci DNA, a to zejména izolaci s využitím magnetických částic. Popisuje vývoj od tradičních metod izolace DNA (např. fenol-chloroformové extrakce) k novějším postupům izolace DNA jako je adsorpce na silikátový povrch a membránu oxidu hlinitého, izolace pomocí cetyltrimetylamonium bromidu, centrifugace v hustotním gradientu a adsorpce na resin. Věnuje se magnetickým částicím jejich struktuře, výhodám jejich používání a přehledu oborů jejich uplatnění (např. biochemie, lékařství, mikrobiologie, ekologie). Jsou zde popsány jednotlivé principy vazby DNA na magnetické částice včetně způsobů s jejich manipulací., This bachelor work is focused on different methods which have been applied for DNA isolation e. g. phenol-chloroform extraction, adsorption to silica or resin, density gradient centrifugation, adsoprtion to alumina membrane, cetyltrimethylammonium bromide-based DNA isolation and magnetic particles-based DNA extraction. The work deals with the use of magnetic particles in different areas like biochemistry, medicine, microbiology, ecology and many others. Different approaches for magnetic beads-based extraction and described here., Katedra biologických a biochemických věd, 1. Prezentace výsledků bakalářské práce.2. Diskuze k posudku vedoucího bakalářské práce. 3. Studentka zodpovědela vaechny dotazy a připomínky k BP.

Salmonella je střevní patogen, který je všudypřítomný v životním prostředí a mimo jiné se vyskytuje i v potravinách; je původcem alimentárních nákaz. Tato práce je zaměřena na detekci salmonel ze vzorků potravin. Popisuje metody tradiční kultivační, imunologické i metody moderní molekulárně- biologické., Salmonella is a foodborne pathogen that is ubiquitous in the environment and among others is also found in foods. This text is focused on the detection of Salmonella from food. It describes culture, modern, imunological and molecular methods., Katedra biologických a biochemických věd, Prezentace výsledků bakalářské práce. Diskuze k posudku vedoucího bakalářské práce. Studentka zodpověděla všechny dotazy a připomínky k BP.