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Visceral leishmaniasis (VL) is an opportunistic disease in immunosuppressed individuals, who may present severe clinical conditions, such as the ones described in this patient. She lived in an endemic region for VL, and was possibly infected with L. (L.) infantum chagasi through the bite of a contaminated sand fly. This initial infection has triggered a pemphigus vulgaris condition by immunogenic proteins present in the mosquito's saliva. The immunosuppression caused by the use of high doses of corticosteroids to control the disease promoted a severe VL condition, with hepatosplenomegaly, thrombocytopenia and hemorrhages, requiring hospitalization and the onset of a subsequent SARS-CoV-2 infection. Due to the intensity of clinical manifestations related to VL, aggravated by COVID-19, she died two days after admission to the Clinical Hospital of Marilia Medical School (HC–Famema).

In this chapter, the immense contribution of nucleic acid discovery to the diagnosis and molecular epidemiology of pathogenic microorganisms and its relevance for veterinary and human health will be discussed. The development of nucleic acid detection, amplification, and sequencing techniques, principally after the introduction of polymerase chain reaction (PCR), allowed the improvement of different strategies to diagnose and to quantify infectious microbiological agents in a variety of organisms and biological samples. Pos-PCR associated techniques such as fragment enzyme restriction and sequence analysis permit the determination of nucleic acid sequence diversity to detect drug resistance, to associate pathogen genetic markers with disease outcome, and to predict temporal and spatial distribution of microorganisms which can be used to prevent and treat infectious diseases efficiently.

Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Dias da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, São Bernado do Campo, 2020. As monooxigenases liticas de polissacarideos (do ingles lytic polysaccharide monooxygenase - LPMOs) sao uma classe de enzimas dependentes de cobre que vem despertando interesse devido ao seu envolvimento na degradacao de diversos polissacarideos. Sao conhecidas sete familias de LPMOs: AA9, AA10, AA11, AA13, AA14, AA15 e AA16. As LPMOs possuem em comum uma estrutura ¿À-sanduiche, uma superficie plana de ligacao ao substrato, um gbraco de histidinah com dois residuos de histidina amino-terminais conservados relacionados a coordenacao do ion cobre e a necessidade de um doador de eletrons essencial para sua atividade. As LPMOs agem diretamente na estrutura cristalina dos polissacarideos, como a celulose e a quitina, facilitando a acao de outros tipos de enzimas, o que indica um potencial para utilizacao em industrias de biocombustiveis e tambem como alternativas para uso como bioinseticida e antifungico. A maioria das LPMOs identificadas ate o momento sao provenientes de microrganismos e pouco se sabe sobre LPMOs produzidas por outros organismos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo principal ampliar o conhecimento sobre essa classe de enzimas, atraves do estudo de uma enzima com similaridade a LPMO (denominada neste trabalho como NvLPMO-1), cuja sequencia genica foi obtida por meio de estudos de prospeccao de genes da anemona-do-mar Nematostella vectensis. Por analise filogenetica e estudos de modelagem estrutural da enzima, e possivel inferir que NvLPMO-1 pertence a familia AA15 de LPMOs, com diversas semelhancas estruturais com as duas unicas enzimas caracterizadas desta familia. Os modelos obtidos indicam que a enzima possui residuos de cisteina envolvidos na formacao de tres pontes dissulfeto, alem de aminoacidos que provavelmente formam uma estrutura em forma de lingua bem proxima ao sitio ativo e que e sinapomorfia de LPMOs AA15. Em paralelo aos estudos teoricos, tres construcoes genicas foram utilizadas para expressao recombinante da enzima em bacterias Escherichia coli BL21DE3 Origami B e Escherichia coli BL21 Rosetta 2 plys, utilizando-se para isso os vetores pET22b(+) e pET26b(+). Porem, o baixo rendimento da forma recombinante da enzima a partir das construcoes em plasmideos bacterianos nao permitiu a realizacao de analises estruturais e ensaios de atividade. Como perspectiva fica a utilizacao de sistemas alternativos de expressao, como por exemplo, leveduras ou celulas de inseto, a fim de validar os modelos teoricos obtidos Lytic polysaccharide monooxygenases are a class of copper-dependent enzymes that have been attracting interest due to their involvement in the degradation of various polysaccharides. Seven families of LPMOs are known: AA9, AA10, AA11, AA13, AA14, AA15 and AA16. LPMOs have in common a â-sandwich structure, a flat substrate-binding surface, a "histidine arm" with two conserved amino-terminal histidine residues related to copper ion coordination and the need for an essential electron donor for your activity. LPMOs act directly on the crystalline structure of polysaccharides, such as cellulose and chitin, facilitating the action of other types of enzymes, which indicates a potential for use in biofuel industries and also as alternatives for use as a bioinsecticide and antifungal. Most of the LPMOs identified so far are from microorganisms and little is known about LPMOs produced by other organisms. Thus, this work had as main objective to expand the knowledge about this class of enzymes, through the study of an enzyme similar to LPMO (called in this work as NvLPMO-1), whose gene sequence was obtained through prospecting studies of genes of the sea anemone Nematostella vectensis. By phylogenetic analysis and structural modeling studies of the enzyme, it is possible to infer that NvLPMO-1 belongs to the AA15 family of LPMOs, with several structural similarities with the only two enzymes characterized in this family. The models obtained indicate that the enzyme has cysteine residues involved in the formation of three disulfide bridges, in addition to amino acids that probably form a tongue-shaped structure very close to the active site and which is synapomorphic of AA15 LPMOs. In parallel to theoretical studies, three gene constructs were used for recombinant expression of the enzyme in bacteria Escherichia coli BL21DE3 Origami B and Escherichia coli BL21 Rosetta 2 plys, using the vectors pET22b (+) and pET26b (+) for this. However, the low yield of the recombinant form of the enzyme from the constructions in bacterial plasmids did not allow structural analyzes and activity tests to be carried out. As a perspective, the use of alternative expression systems, such as yeast or insect cells, in order to validate the theoretical models obtained.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Luiz Oliveira Rodrigues Cunha Coorientador: Prof. Dr. Alexandre Budu Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2019. A malária acomete milhões de pessoas todos os anos em todo o mundo. Segundo a Organização Mundial da Saúde, em 2015, a malária afetou cerca de 212 milhões de pessoas e aproximadamente 429 mil casos foram fatais. No Brasil, desde 2017, o número de casos de malária tem aumentado significativamente, atraindo assim uma crescente atenção das autoridades para o controle da doença. Baixa eficácia, alta toxicidade e o aumento de cepas resistentes são fatores que determinam a necessidade de desenvolvimento de novos candidatos a drogas. Dentre os alvos considerados atrativos para o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos, as enzimas proteolíticas recebem crescente destaque devido a seu papel crítico no ciclo de vida dos parasitas, já que durante o estágio eritrocítico da infecção, as proteases do Plasmodium sp. processam a hemoglobina do hospedeiro e também facilitam a invasão e a evasão dos parasitas nos eritrócitos. Sendo assim, a funcionalização de compostos contendo núcleos farmacofóricos privilegiados (como núcleos 4-amino-quinolínicos e heterocíclicos) com calcogênios é uma estratégia atrativa para contornar os mecanismos de resistência a drogas do parasita. Os compostos orgânicos de selênio (Se) e telúrio (Te) possuem várias aplicações promissoras, incluindo seu potencial como inibidores seletivos de cisteíno proteases, alta atividade com toxicidades agudas ou negligenciáveis em modelos in vitro e in vivo de doenças como câncer e leishmaniose. Assim, a funcionalização desses núcleos com calcogênios deve combinar o tropismo das organelas ácidas com a reatividade seletiva desses elementos frente a tióis, levando a bioatividades melhoradas. Dessa forma, foram avaliados os efeitos antimaláricos de compostos isoquinolínicos, quinolínicos e outros núcleos heterocíclicos funcionalizados com Se ou Te, utilizando as cepas de Plasmodium falciparum sensível (3D7) e resistente (W2) a cloroquina. Também foram avaliadas as atividades hemolíticas, a capacidade de inibição da atividade proteolítica intracelular e a citotoxicidade destes compostos em células humanas saudáveis (HUVEC). De modo geral, observou-se significativa atividade antiplasmodial, moderada atividade hemolítica e citotóxica, e índices de seletividade maiores que 100. Os candidatos mais promissores apresentaram EC50

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Evolução e Diversidade, Santo André, 2019. As arboviroses estão distribuídas mundialmente, com mais de 390 milhões de casos humanos por ano. Especialmente em regiões tropicais e subtropicais, onde a presença de seus vetores está consolidada devido ao clima favorável, os arbovírus são responsáveis por grandes desafios para a saúde pública dos países afetados, como o Brasil. O gênero Flavivirus compreende os arbovírus mais prevalentes, dentre eles os vírus da dengue, da Zika e da febre amarela. De acordo com o Ministério da Saúde, entre 2016 e 2017, ocorreram 1.732.679 casos de dengue, com 864 óbitos; 233.800 casos de febre Zika, com 08 mortes; e 1.908 casos de febre amarela, com 548 mortes. Além da perda de vidas humanas, há grandes impactos econômicos e sociais envolvidos. O monitoramento das ocorrências de flavivírus durante períodos interepidêmicos pode ajudar as instituições de saúde a desenvolver estratégias de controle preventivo. Assim, o objetivo deste estudo foi detectar a ocorrência de flavivírus diretamente em insetos hematófagos coletados em ambientes naturais, de forma a preservar o espécime, permitindo sua identificação para estudos filogenéticos e ecológicos. Nesta pesquisa, foram processados 102 insetos hematófagos coletados na cidade de Marília, estado de São Paulo. Os insetos foram incubados em um tampão de lise com proteinase K, para liberação de ácidos nucleicos e em seguida o RNA foi purificado. A detecção dos flavivírus foi realizada por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase, utilizando os oligonucleotídeos cFD2 e MAMD, complementares à proteína não-estrutural 5 (NS5) do gênero Flavivirus. O fragmento de 220-250 pb foi obtido em 19 amostras de mosquitos, e a análise por "Basic Local Alignment Search Tool - BLAST" dos dados de sequenciamento dessas dezenove amostras apresentou similaridade de 94-96% com Culex Flavivirus. Sabendo que os mosquitos vetores podem se alimentar de sangue infectado e que podem transmitir vírus durante todo o seu ciclo de vida, esses mosquitos podem ser usados como indicadores epidemiológicos (sentinelas) da circulação de arbovírus em uma determinada área. Arboviruses are distributed worldwide, with more than 390 million human cases per year. Especially in tropical and subtropical regions, where the presence of their vectors is consolidated due to the favorable climate, arboviruses are responsible for major public health challenges in affected countries, such as Brazil. The genus Flavivirus comprises the most prevalent arboviruses, among them the dengue virus, Zika virus and yellow fever virus. According to the Ministry of Health, between 2016 and 2017, there were 1,732,679 cases of dengue, with 864 deaths; 233,800 cases of Zika fever, with 8 deaths; and 1,908 cases of yellow fever, with 548 deaths. In addition to the loss of human lives, there are major economic and social impacts involved. Monitoring of occurrences of flaviviruses during interepidemic periods may help health institutions develop preventive control strategies. Thus, the objective of this study was to detect the occurrence of flavivirus directly in hematophagous insects collected in natural environments, in order to preserve the specimen, allowing its identification for phylogenetic and ecological studies. In this research, 102 hematophagous insects were collected in the city of Marília, state of São Paulo. The insects were incubated in a lysate buffer with proteinase K, to release nucleic acids and then the obtained RNA was purified. The detection of flavivirus was performed by reverse transcription and polymerase chain reaction, using the cFD2 and MAMD oligonucleotides, complementary to the nonstructural protein 5 (NS5) of the genus Flavivirus. The 220-250 bp fragment was obtained from 19 mosquito samples, and the Basic Local Alignment Search Tool - BLAST analysis of the sequencing data from these nineteen samples showed 94-96% similarity with Culex Flavivirus. Knowing that vector mosquitoes can feed on infected blood and can transmit viruses throughout their life cycle, these mosquitoes can be used as epidemiological indicators (sentinels) of the arbovirus circulation in a given area.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2018. A leishmaniose compreende um grupo de doenças zoonóticas causadas por protozoários da família Trypanosoma e do gênero Leishmania, sendo transmitida por vetores flebotomíneos. O género Leishmania compreende 30 espécies, incluindo 20 espécies capazes de causar doença em humanos, com diferentes manifestações clínicas, que vão desde lesões assintomáticas, cutânea e mucocutânea, até a forma visceral grave, que é letal se não tratada. No continente americano, a leishmaniose visceral (LV) é causada por Leishmania infantum chagasi e o Brasil concentra 90% dos casos registrados na América Latina. O diagnóstico da LV na América apresenta dificuldades devido a reações cruzadas com outras tripanossomíases endêmicas. Além disso, os sinais clínicos e as alterações hematológias da LV são encontrados em outras doenças infecciosas e em alterações malignas hematológicas. Com o intuito de buscar ferramentas e estratégias para o diagnóstico diferencial da LV, neste trabalho foram desenvolvidos métodos de isolamento e detecção molecular de L. infantum chagasi, além da busca por características demográficas específicas e avaliação do diagnóstico diferencial da LV em aspirados de medula óssea de pacientes com sintomas de doença hematológica da região de Marília-SP, no período de 2010 a 2017. O método de isolamento de L. infantum chagasi foi realizado a partir de amostras de medula óssea e sangue periférico de indivíduos sintomáticos. O diagnóstico molecular por reação em cadeia da polimerase, convencional, foi desenvolvido utilizando como alvo o gene de cópia única que codifica a enzima quitinase de L. infantum, o qual permite o diagnóstico específico e direto a partir de diferentes amostras clínicas. Os testes apresentaram elevada especificidade e mostraram sensibilidade aumentada quando comparados com métodos utilizados rotineiramente nos serviços de saúde. Os resultados da análise demográfica e do diagnóstico diferencial a partir de aspirados de medula óssea de pacientes com suspeita de doenças hematológicas indicaram que 19,4% apresentaram LV, e que a população com maior risco possui menos de 20 anos. O estudo realizado demonstra que a investigação de LV em pacientes com alterações hematológicas é fundamental não só para identificar casos de LV, mas também para tratar corretamente os casos de doenças infecciosas e hematológicas associadas. Leishmaniasis covers a group of zoonotic diseases caused by protozoa parasites of the Trypanosoma Family and the genus Leishmania, being transmitted by phlebotomine insect vectors. The genus Leishmania comprises 30 species, including 20 species capable of causing disease in humans, with different clinical manifestations, ranging from asymptomatic, cutaneous and mucocutaneous lesions, to severe visceral form, which is lethal if untreated. In the American continent, visceral leishmaniasis (VL) is caused by Leishmania infantum chagasi and Brazil accounts for 90% of the Latin America registered cases. The diagnosis of VL in America presents difficulties due to cross-reactions with other endemic trypanosomiasis. In addition, clinical signs and VL hematological alterations are found in other infectious diseases and hematological malignancies. In order to search for tools and strategies for the differential VL diagnosis, in this work we have developed methods of isolation and molecular detection of L. infantum chagasi, as well as the search for specific demographic characteristics and evaluation of the differential diagnosis of VL in bone marrow biopsies of patients with symptoms of haematological diseases in the region of Marília-SP, from 2010 to 2017. The method of L. infantum chagasi isolation was performed from samples of bone marrow and peripheral blood of symptomatic individuals. Conventional polymerase chain reaction (PCR) was developed using the single copy gene encoding the chitinase enzyme of L. infantum, which allows specific and direct diagnosis from different clinical samples. Both diagnostic tests showed high specificity and increased sensitivity when compared with routinely used methods in health services. The results of the demographic analysis and the differential diagnosis from bone marrow biopsy of patients with supposed hematological diseases indicated that 19.4% had VL, and that the population with the highest risk is less than 20 years old. The present study demonstrates that the investigation of VL in patients with hematological alterations is fundamental not only to identify cases of VL but also to correctly treat cases of VL associated infectious and hematological diseases.

Orientadora: Profª. Drª. Diana Sarita Hamburger Coorientadora. Profª. Drª. Andrea de Oliveira Cardoso Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Ambiental, Santo André, 2018. A dengue aumentou em 30 vezes sua incidência nos últimos 50 anos, com a expansão geográfica para novos países e de áreas urbanas para as rurais, além do surgimento de surtos mais graves. A relação entre a dengue e variáveis meteorológicas tem sido amplamente estudada em todo o mundo com o intuito de identificar os fatores que podem ser usados para prever epidemias. Este trabalho busca verificar qual o papel do clima, dentre os fatores que contribuem para a ocorrência de casos de dengue nos municípios do Estado de São Paulo, especificamente precipitação e temperatura. Para tanto, foram realizadas análises de correlação simples, defasadas em até 3 meses, entre os dados de anomalias mensais padronizadas de taxa de incidência de dengue e das variáveis de temperatura máxima absoluta, temperatura mínima absoluta, temperatura máxima, temperatura mínima e precipitação, para o período entre janeiro de 2004 e dezembro de 2016. O teste de hipótese ?? de Student foi utilizado para verificar se a correlação é significativa. Além disso, foi analisada a distribuição espacial e temporal dos casos de dengue e taxa de incidência, além de dados sobre a Infestação Predial do mosquito transmissor em municípios do Estado de São Paulo. Através da análise da distribuição espacial dos casos de dengue foi possível identificar que houve aumento na intensidade das epidemias e nas áreas afetadas. A faixa transversal ao formato do Estado, de oeste para leste concentra um grande número de casos de dengue. A distribuição da taxa de incidência de dengue demonstrou que houve aumento no impacto das epidemias de dengue nos municípios, principalmente nas regiões norte, noroeste e litoral do Estado, inclusive em anos interepidêmicos, a partir de 2010. Foi possível identificar que a infestação pelo mosquito da dengue ocorreu no sentido interior - litoral e não esteve diretamente associada à presença de casos da doença nos municípios. De um modo geral, as variáveis de temperatura apresentam maior influência na faixa leste do Estado, com correlações positivas, enquanto que a precipitação acumulada influencia mais fortemente nas faixas oeste, e central do Estado. Dengue fever has increased by 30 times its incidence in the last 50 years, with geographical expansion to new countries and from urban to rural areas, in addition to the emergence of more severe outbreaks. The relationship between dengue and meteorological variables has been widely studied worldwide in order to identify the factors that can be used to predict epidemics. This work seeks to verify the role of climate, among the factors that contribute to the occurrence of dengue cases in the municipalities of the State of São Paulo, specifically precipitation and temperature. For this purpose, simple correlation analyzes were performed between the data of standard monthly anomalies of the dengue incidence rate and the variables of absolute maximum temperature, absolute minimum temperature, maximum temperature, minimum temperature and precipitation. the period between January 2004 and December 2016. The Student's hypothesis test was used to verify if the correlation is significant. In addition, we analyzed the spatial and temporal distribution of dengue cases and incidence rates, as well as data on the Predial Infestation of the transmitting mosquito in municipalities of the State of São Paulo. Through the analysis of the spatial distribution of dengue cases, it was possible to identify that there was an increase in the intensity of the epidemics and in the affected areas. The cross-border range of the state, from west to east, concentrates a large number of cases of dengue. The distribution of the dengue incidence rate showed that there was an increase in the impact of dengue epidemics in the municipalities, especially in the north, northwest and coastal regions of the State, including in interepidemic years, from 2010. It was possible to identify that mosquito infestation of dengue occurred in the interior - coastal direction and was not directly associated with the presence of cases of the disease in the municipalities. In general, the temperature variables present a greater influence in the eastern range of the State, with positive correlations, while the accumulated precipitation influences more strongly in the west and central bands of the State.

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2018. A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença caracterizada por progressiva limitação do fluxo aéreo e suas principais manifestações são a bronquite crônica e o enfisema pulmonar. O quadro é geralmente irreversível e engloba uma série de processos que incluem a resposta inflamatória anormal dos pulmões com participação ativa de macrófagos, neutrófilos e linfócitos, a falha na reparação de células anormais, a apoptose precoce e a destruição da matriz extracelular ocasionada pelo desequilíbrio entre proteases e antiproteases, sendo esse desequilíbrio apontado como um dos principais mecanismos que levam à instalação da doença. O tabagismo é a principal causa atribuída ao seu aparecimento, seguida por fatores genéticos e ambientais. Algumas enzimas estão relacionadas ao processo de patogênese da DPOC como a elastase de neutrófilos humana e as metaloproteinases 9 e 12. Em trabalhos anteriores o uso do inibidor de serinoproteases rBmTI-A, inibidor do tipo Kunitz-BPTI, resultou na prevenção do enfisema pulmonar por meio do controle da resposta inflamatória comumente observada, além de redução da atividade proteolítica presente no lavado broncoalveolar. Nesse trabalho, o objetivo inicial foi dar prosseguimento à pesquisa com rBmTI-A, com a caracterização da expressão gênica diferencial no modelo de enfisema animal utilizando camundongos, indução realizada com a administração de elastase pancreática porcina (PPE); para isso foi utilizado o ensaio de micro arranjo de DNA (Microarray). Os ensaios de Microarray resultaram na identificação de genes que respondem ao tratamento nos animais induzidos ao enfisema e que receberam o tratamento com rBmTI-A, dentre estes genes estão: genes do sistema imune e inflamação, genes da contração muscular, genes da tradução em mitocôndria e genes de outras funções celulares. Na segunda parte do trabalho, o inibidor de serinoproteases rBmTI-6-D1, inibidor Kunitz-BPTI, foi aplicado no modelo de enfisema pulmonar em camundongos, resultados obtidos previamente já haviam mostrado que rBmTI-6 também apresenta a capacidade de prevenir o desenvolvimento do enfisema induzido por PPE, neste trabalho mostramos que o tratamento utilizando rBmTI-6-D1 evita a perda do recolhimento elástico dos pulmões dos animais induzidos ao enfisema, bem como também evita a degradação alveolar, e o aumento do número de macrófagos e linfócitos nos lavados broncoalveolares dos animais que receberam tratamento em comparação com os que não receberam. Também foi demonstrado que rBmTI-6 evita o aumento de atividade proteolítica (calicreínas e elastase de neutrófilos) no lavado broncoalveolar de animais tratados com o inibidor e induzidos ao enfisema em comparação aos controles. Na terceira parte do trabalho, foram realizados ensaios em cultura de células A549 para investigar o potencial anti-inflamatório dos inibidores rBmTI-A, rBmTI-6-D1 e rBmTI-6-D2/3, a aplicação dos inibidores nestas células mostrou um aparente papel antiinflamatório por meio da diminuição da secreção das citocinas IL-6 e IL-8, no tratamento utilizando rBmTI-6-D1 e rBmTI-6-D2/3. Concluímos que os inibidores rBmTI-A e rBmTI-6 apresentam atividade que previne o desenvolvimento do enfisema induzido por PPE, devido às atividades antiproteases destes inibidores e por interferirem na resposta inflamatória. Chronic obstructive pulmonary disease is characterized by progressive airflow limitation and its main manifestations are chronic bronchitis and pulmonary emphysema. It is generally irreversible and encompasses a series of processes that include the abnormal inflammatory response of the lungs with active involvement of macrophages, neutrophils and lymphocytes, failure to repair abnormal cells, early apoptosis, and destruction of the extracellular matrix caused by the imbalance between proteases and antiproteases, and this imbalance is one of the main mechanisms that lead to the establishment of the disease. Smoking is the main cause attributed to its onset, followed by genetic and environmental factors. Some enzymes are related to the pathogenesis of COPD such as human neutrophil elastase and metalloproteinases 9 and 12. In previous studies, the use of the serine proteinase inhibitor, rBmTI-A, a Kunitz- BPTI inhibitor type, resulted in the prevention of pulmonary emphysema by controlling of the inflammatory response commonly observed, as well as reducing the proteolytic activity present in bronchoalveolar lavage. In this work, the initial objective was to continue the research with rBmTI-A, with the characterization of differential gene expression in the emphysema model using mice, induced to emphysema by porcine pancreatic elastase (PPE) instillation; to reach this aim a microarray assay was performed. The microarray results in the identification of some genes which are affected by the treatment using rBmTI-A in animals that received PPE instillation previously. Among these genes were identified immune and inflammatory related genes, muscular contraction related genes, translation in mitochondria related genes and genes of other cellular functions. In the second part of this work, the serine proteinase inhibitor rBmTI-6-D1, other Kunitz-BPTI inhibitor type, was applied in the emphysema model using mice; previous results had shown that rBmTI-6 also presented the ability to avoid the emphysema development in the PPE instillation model. The present work we showed that the rBmTI-6-D1 treatment was sufficient to avoid the loss of elastic recoil, an effective decrease in alveolar enlargement and in the number of macrophages and lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid. Proteolytic analysis showed a significant increase in elastase activity in induced emphysema group that is controlled by rBmTI-6-D1. Kallikrein activity was decreased in the induced emphysema and inhibitor treated group when compared to induced emphysema group without treatment. In the third part of this work, assays using A549 cells were performed to investigate the anti-inflammatory potential of rBmTI-A, rBmTI- 6-D1 and rBmTI-6-D2/3 inhibitors. These inhibitors presented an apparent antiinflammatory role, due the reduced levels of IL-6 and IL-8 that were secreted by A549 cell when treated with rBmTI-6-D1 and rBmTI-6-D2/3. We concluded that rBmTI-A and rBmTI-6 inhibitors prevent the emphysema development induced by PPE, due the anti-proteinases activities of these inhibitors and by its interference in inflammatory response.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança Coorientadora: Profa. Dra. Arlei Marcili Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Evolução e Diversidade, Santo André, 2018. A filogenética molecular moderna vai além de simples análises de sequências. O contexto genômico surge como uma ferramenta cada vez mais relevante na inferência e compreensão de relações evolutivas e funcionais entre genes. Aqui propomos um simples software online para identificação de loci de interesse em sequências genômicas anotadas e geração de imagens prontas para publicação. O programa foi testado com um caso único, uma análise filogenética de uma enzima de tripanossomatídeos que foi transferida horizontalmente de bactérias no ancestral comum do grupo, que não ocorre em outros eucariotos extantes e é relevante para a virulência do parasita. Modern molecular phylogenetic research goes beyond simply analyzing sequence data. Genomic context is increasingly relevant as a tool to infer and understand evolutionary and functional relationships between genes. Here we propose a simple web-based software program for labelling loci of interest in annotated genomic sequences and generating ready-for-publication imagery. The program was tested with a unique use case, a phylogenetic analysis of a trypanosomatid enzyme that was laterally transferred from bacteria in the group¿s common ancestor, occurs in no other extant eukaryotes and is very important to the parasite¿s virulence.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Aparecida Sperança Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. A dengue, causada por quatro diferentes sorotipos do vírus (DENV1-4), é a arbovirose de maior prevalência em humanos no mundo. Estudos moleculares são necessários para melhor entendimento de doenças causadas por diferentes sorotipos e variantes genéticas. Em relação á sua origem e história evolucionária, análises filogenéticas e epidemiológicas sugerem que genótipos mais virulentos estão substituindo os de menor virulência. Este trabalho teve como objetivo a caracterização da dinâmica de transmissão e epidemiologia molecular dos DENV circulantes na cidade de médio porte do Estado de São Paulo, Marília, com 233.639 habitantes, durante uma epidemia de dengue ocorrida no ano de 2007. Para tanto foram obtidas amostras de pacientes com diagnóstico clínico e epidemiológico (sem confirmação laboratorial) durante ocorrência de epidemia de dengue. O estudo comparativo de características hematológicas e demográficas dos pacientes com a presença de antígeno NS1 de DENV nas amostras revelou associação significante com leucopenia e plaquetopenia (medianas: DENV+= 3.715 células/mL e DENV- = 6.760 células/mL; e medianas: DENV+ = 134.896 células/mL e DENV- = 223.872 células/mL, respectivamente), e aumento de linfócitos atípicos. Esse padrão hematológico foi mantido durante o longo período da epidemia, permitindo que, com a determinação do padrão conservado nas primeiras fases de uma epidemia, este possa ser usado para implementar medidas de diagnóstico de novos casos, bem como no controle e tratamento dos doentes em todo o restante do período. A detecção e identificação do sorotipo viral, por PCR e Nested-PCR, respectivamente, utilizando como alvo o gene que codifica a junção das proteínas estruturais do capsídeo e pré-membrana (C/prM), confirmou a co-circulação de DENV1 (33%) e DENV3 (67%) em 2007. A partir das sequências obtidas da junção C/prM dos DENV1 e DENV3 dessas amostras, foi feita a reconstrução filogenética. Os resultados indicaram que a população de DENV1 provavelmente se originou da região norte do Brasil, por apresentar pouca variabilidade genética e alta similaridade com amostras de DENV1 de pacientes de Belém do Pará isoladas no mesmo ano. A população de DENV3 apresentou variabilidade genética, provavelmente, devido à microevolução na própria região, visto que as amostras de Marília-SP apresentaram alta similaridade com amostras de vírus isoladas de pacientes da Venezuela, em 2001. Os dois sorotipos mostraram padrões hematológicos distintos, nos quais, com o aumento de linfócitos atípicos houve uma significante maior leucopenia na população de DENV3 e uma tendência a maior diminuição de plaquetas em DENV1. Os estudos realizados demonstram que a dengue é uma doença com características regionais específicas. Portanto, a implementação das atividades de manejo das epidemias dependem da caracterização das variantes genéticas dos DENV e sua relação com a população acometida. Dengue, caused by four different serotypes of the virus (DENV1-4), is the most prevalent arbovirose in humans in the world. Molecular studies are needed to better understand diseases caused by different serotypes and genetic variants. In relation to its origin and evolutionary history, phylogenetic and epidemiological analyzes suggest that more virulent genotypes are replacing those of less virulence. This work aimed to characterize the transmission dynamics and molecular epidemiology of DENV circulating in the medium-sized city of the State of São Paulo, Marília, with 233,639 inhabitants, during a dengue epidemic occurred in 2007. For this purpose, samples were obtained of patients with clinical and epidemiological diagnosis (without laboratory confirmation) during the occurrence of a dengue epidemic. The comparative study of the hematological and demographic characteristics of patients with the presence of DENV NS1 antigen in the samples revealed a significant association with leukopenia and thrombocytopenia (median: DENV + = 3,715 cells / mL and DENV- = 6,760 cells / mL; 134,896 cells / mL and DENV- = 223,872 cells / mL, respectively), and increase of atypical lymphocytes. This hematological pattern was maintained during the long period of the epidemic, allowing the determination of the pattern preserved in the first stages of an epidemic, to be used to implement measures for the diagnosis of new cases, as well as for the control and treatment of patients in the remainder of the period. Detection and identification of the viral serotype by PCR and Nested-PCR, respectively, targeting the gene coding for the junction of the capsid and premembrane (C / prM) structural proteins, confirmed the co-circulation of DENV1 (33 %) and DENV3 (67%) in 2007. From the sequences obtained from the C / prM junction of the DENV1 and DENV3 of these samples, the phylogenetic reconstruction was performed. The results indicated that the DENV1 population probably originated from the northern region of Brazil, as it presents little genetic variability and high similarity with DENV1 samples from patients from Belém do Pará isolated in the same year. The DENV3 population showed genetic variability, probably due to the microevolution in the region itself, since the Marília-SP samples presented high similarity with virus samples isolated from patients from Venezuela in 2001. The two serotypes showed different hematological patterns in the which, with the increase of atypical lymphocytes, there was a significant greater leucopenia in the DENV3 population and a tendency to a greater decrease of platelets in DENV1. Preliminary data from another epidemic were obtained in 2015, from which we tested 100 positive samples to date, with 87% belonging to serotype 1 by means of molecular typing using the gene coding for the C / prM junction. Studies show that dengue is a disease with specific regional characteristics. Therefore, the the implementation of epidemic management activities depend on the characterization of genetic variants of DENV and its relationship with the affected population.

Orientadora: Profª Drª Márcia Aparecida Sperança Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. A leishmaniose visceral, causada pelos parasitas das espécies Leishmania infantum e Leishmania donovani, do Velho Mundo, e pela Leishmania infantum chagasi, do Novo Mundo, é uma doença infecciosa e letal se não for tratada. O número de casos desta doença está aumentando no Estado de São Paulo. Uma vez diagnosticada, o tratamento para a leishmaniose visceral tem efeitos colaterais importantes, além da ocorrência de parasitas resistentes aos medicamentos disponíveis. Sabe-se que algumas peptidases desempenham um papel importante na fisiologia e doença causada por parasitas do género Leishmania. A inibição específica destas enzimas pode constituir uma importante estratégia para a produção de potentes agentes antiparasitários. Em bactérias E. coli, inibidores de serino peptidases (ISPs) denominados ecotinas, têm sido descritos, sendo também identificados em espécies de Leishmania. A caracterização funcional da ISP1 e ISP2 de L. major mostrou o seu papel na formação de flagelo de promastigotas e na inibição da elastase de neutrófilos de hospedeiro vertebrado, respectivamente. Portanto, os objetivos deste projeto são a expressão e a purificação das proteínas ISP1 e ISP2 de L. i. chagasi (LcISP1 e LcISP2) recombinantes. A amplificação das sequências que codificam as LcISP1 e LcISP2 foi realizada por PCR a partir do DNA genômico, de L. i. chagasi extraído de uma estirpe de referência cedida pelo Laboratório Nacional de Referência de Espécies de Leishmania da Fiocruz, Rio de Janeiro. Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor de expressão bacteriano pET28a e as proteínas recombinantes LcISP2 e LcISP1 foram obtidas na fração solúvel do extrato proteico bacteriano. Após expressão das proteínas recombinantes, elas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel. Visceral leishmaniasis, caused by the Old World parasites species Leishmania infantum and Leishmania donovani, and by the New World Leishmania infantum chagasi, is an infectious and lethal disease, if untreated. The number of cases of this disease is increasing in the State of São Paulo. Once diagnosed, treatment for visceral leishmaniasis has important side effects, besides occurrence of parasites resistant to the available drugs. It is known that some peptidases play an important role in physiology and disease caused by parasites of the genus Leishmania. The specific inhibition of these enzymes may constitute an important strategy for producing potent antiparasitic agents. In bacteria E. coli, inhibitors of serine peptidases (ISPs) called ecotins, have been described, being also identified in Leishmania species. Characterization of genes encoding ISP1 and ISP2 of L. major, showed its role in the promastigote flagellum formation and in the inhibition of vertebrate host neutrophil elastase, respectively. Therefore, the aims of this project are to produce L. i. chagasi ISP1 (LcISP1) and ISP2 (LcISP2) recombinant forms and to evaluate the its biochemical activity. Amplification of the LcISP1 and LcISP2 encoding sequences were performed by PCR from L. i. chagasi DNA extracted from a reference strain obtained from the Leishmania collection of the Leishmania National Reference Laboratory of the Instituto Oswaldo Cruz. PCR fragments were cloned into the pET28a bacterial expression vector and the recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins were present in soluble bacterial extract fraction. After purification by niquel affinity chromatography, recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins e were tested for biochemical activity.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. A família Bunyaviridae agrupa virus de RNA trissegmentados de cadeia negativa e inclui mais de 350 isolados classificados em cinco gêneros, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus e Tospovirus. Juntos, esses bunyavirus infectam uma grande variedade de animais e plantas, e determinados vírus têm a capacidade de causar doenças graves em seus respectivos hospedeiros. Depois da febre da Dengue, a doença viral transmitida por artrópodes com maior prevalência no Brasil corresponde à febre do Oropouche (FO), cujo agente etiológico é o arbovírus Oropouche (OROV) da família Bunyarviridae, gênero Orthobunyavírus, grupo sorológico Simbu. Nos últimos anos, OROV tem sido responsável por mais de 500.000 casos humanos em extensas e explosivas epidemias na Região Amazônica e no Planalto Central. Com o intuito de buscar novas ferramentas para o diagnóstico específico e tratamento da febre do Oropouche, este projeto teve por objetivo investigar a forma recombinante da proteína do Nucleocapsídeo (N) por meio de estudos estruturais. A proteína N dos bunyavirus é essencial para o processo de replicação, apresentando mecanismo específico de encapsidação do genoma de RNA. O gene que codifica a proteína N de OROV foi subclonada no vetor de expressão bacteriano pET28a (+), com subseqüente expressão em bactéria E. coli da linhagem BL21 (DE3), em diferentes condições de temperatura. Desenvolveram-se estudos estruturais com a análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS), Dicroísmo circular (CD), e de espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). Os resultados indicaram que o monômero da proteína N de OROV produzida em bactérias apresenta 28kDa com cauda de histidina, e após purificação em condições nativas, apresentou alta massa molecular com tamanho entre 400-660 kDa, sugerindo a formação de multímero associado inespecificamente à molécula de RNA com tamanho menor de 100 bases. The Bunyaviridae family groups trissegmented RNA virus of negative strand and includes more than 350 isolates classified into five genders, Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus and Tospovirus. Together, these bunyavirus infect a variety of animals and plants, and certain viruses have the ability to cause severe disease in their hosts. After Dengue fever, the viral disease transmitted by arthropods with a higher prevalence in Brazil corresponds to Oropouche fever (OF), whose etiologic agent is the Oropouche virus (OROV) of Bunyarviridae family, Orthobunyavirus genus, and serologic group Simbu. In recent years, OROV has been responsible for more than 500,000 human cases in extensive and explosive epidemics in the Amazon region and in the Central Highlands. In order to search for new tools for specific diagnosis and treatment of OF, this project aimed to investigate the recombinant form of the nucleocapsid (N) protein by means of structural studies. The N protein of bunyavirus is essential for the replication process, and present a specific mechanism for encapsidation of the virus RNA genome. The gene encoding the OROV N protein was subcloned into the bacterial expression vector pET28a (+) with subsequent expression in E. coli strain BL21 (DE3) under different temperature conditions. Structural studies have been developed with the dynamic light scattering analysis (DLS), circular dichroism (CD), and X-ray scattering at low angles (SAXS). The results indicated that the monomer OROV N protein with six histidine tag, produced in bacteria, has 28kDa, and after purification under native conditions, showed high molecular mass size between 400-660 kDa, suggesting multimer formation associated nonspecifically to RNA molecules with a length less than 100 bases.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. O arbovírus Mayaro (MAYV), pertence ao gênero Alphavirus, família Togaviridae e grupo sorológico A. Como parte do projeto de pesquisa sobre "Arboviroses Emergentes na Amazônia Ocidental", foi isolada uma estirpe de um alphavirus Mayaro a partir de um indivíduo febril de Acrelândia, Acre. O MAYV ocorre no ambiente silvestre ou rural em áreas próximas a florestas e seu ciclo de transmissão envolve a participação de primatas não humanos, aves e mosquito Haemagogus ssp. As características patogênicas do vírus MAY em humanos são pouco compreendidas e o potencial de dispersão desses vírus e a possibilidade de participação de espécies de mosquitos do gênero Aedes em seu ciclo de transmissão fazem desse vírus um importante organismo para estudos biológicos e epidemiológicos. Devido à natureza não específica dos sinais e sintomas de doenças febris agudas causadas por MAYV, o diagnóstico clínico é difícil e pode ser confundido com outras doenças febris, como: a febre da dengue, febre do chikungunya, febre amarela e a malária. Já o diagnóstico laboratorial por isolamento viral é laborioso e depende de infraestrutura e pessoal especializado, disponível em poucos laboratórios brasileiros. O diagnóstico imunoenzimático possui limitações quanto à utilização de partículas virais infecciosas e também por produzirem reações cruzadas com vírus da mesma família. Sendo assim, com o intuito de obter antígeno recombinante específico para detecção de MAYV, este projeto teve por objetivo expressar a glicoproteína E2 do vírus em células de insetos utilizando baculovírus recombinante como vetor. A glicoproteína E2 dos alphavirus tem a função de se ligar a receptores presentes na membrana plasmática da célula alvo para a entrada do vírus através de uma vesícula endossomal. Como resultado, foi obtido o baculovírus recombinante para a glicoproteína E2 de MAYV, e a mesma foi expressa pela primeira vez em células de inseto High-FiveTM. Apesar de utilizar vetor com sinal de exportação da proteína recombinante para o meio extracelular, a glicoproteína recombinante E2 de MAYV não foi exportada, permanecendo na fração celular da cultura. Análises da estrutura tridimensional da E2 homóloga de alphavirus indicaram que esta glicoproteína apresenta um domínio transmembrana, o que justifica sua permanência na bicamada fosfolípidica da célula hospedeira. The arbovirus Mayaro (MAYV), belongs to the genus Alphavirus, family Togaviridae and serological group A. As part of the research project on "Emerging Arboviroses in the Western Amazon", a strain of Mayaro alphavirus was isolated from a febrile individual of Acrelândia, Acre. MAYV occurs in the wild or rural environment, in areas near to forests and its life cycle includes the participation of non-human primates, birds and mosquito Haemagogus ssp. The pathogenic characteristics of MAYV in humans are poorly understood and the dispersal potential of these viruses and the possibility of participation of species of Aedes mosquitos in its transmission cycle make this virus an important organism for biological and epidemiological studies. Because of the nonspecific nature of the signs and symptoms of acute febrile illness caused by MAYV, clinical diagnosis is difficult and can be confused with other infectious diseases, such as dengue fever, chikungunya fever, yellow fever and malaria. Moreover laboratory diagnosis by viral isolation is laborious and depends on infrastructure and trained personnel available in a few Brazilian laboratories. The enzyme immunoassay diagnosis has limitations on the use of infectious viral particles and also for producing cross-reactions with other virus from the same group. Thus, in order to obtain recombinant antigen for specific detection of MAYV, this project aimed to express the MAYV E2 glycoprotein in insect cells using recombinant baculovirus as vector. The E2 glycoprotein of the alphaviruses has the function of binding to receptors in the plasma membrane of the target cell for viral entry through an endosomal vesicle. The recombinant baculovirus was obtained for the MAYV E2 glycoprotein, and this protein was expressed for the first time in High- FiveTM insect cells. Despite using a vector with signal to exportation of the recombinant protein to the extracellular medium, the MAYV E2 glycoprotein was not exported, remaining in the cell fraction of the culture. Structural analyses of alphavirus E2 homologous protein indicated that the glycoprotein has a transmembrane domain, which justifies its permanence in the host cell phospholipid bilayer.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Aparecida Sperança Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2016. O arbovírus Mayaro (MAYV), encontrado nas regiões próximas a florestas e áreas rurais da América do Sul, é membro da família Togaviridae, gênero Alphavirus. Este gênero é distribuído amplamente, tendo dois grupos principais: Alphavirus do Velho Mundo (Chikungunya, Sindbis, O¿nyong-nyong, Ross River, Semliki Forest) e do Novo Mundo (Encefalite Equina Venezuelana, Encefalite Equina Ocidental), de acordo com a região na qual foram isolados originalmente. O mosquito Haemagogus spp. é o principal vetor do MAYV que também já foi isolado de mosquitos do gênero Aedes spp. Considerando a semelhança do MAYV com o vírus Chikungunya, recentemente inserido no Brasil, e transmitido por Ae. aegypti, há risco de que o MAYV possa ser transmitido em áreas urbanas. Cabe ressaltar que no Brasil já foram registrados casos de co-circulação de MAYV durante surtos epidêmicos de dengue. A infecção por MAYV causa sintomas semelhantes a outras doenças febris, como a febre da dengue, a febre do Chikungunya, e a malária, dificultando o diagnóstico preciso dos casos. O genoma de MAYV, com cerca de 11,7 kb, é organizado em duas principais regiões: domínio não estrutural (extremidade 5¿ do RNA), contendo os genes que codificam as proteínas não estruturais (nsP1-4); e domínio estrutural, contendo os genes que codificam as proteínas estruturais. As proteínas não estruturais dos Alphavirus são necessárias para o processamento da poliproteína e para síntese do RNA viral. Dentre as proteínas não estruturais, as proteases virais podem ser imunogênicas além de se constituírem em excelentes alvos terapêuticos. O estudo comparativo do genoma dos Alphavirus indica que a proteína nsP2 de MAYV possui diversas atividades enzimáticas, incluindo a atividade de cisteíno protease em sua região C-terminal. Portanto, com o intuito de obter um método de diagnóstico sorológico específico para MAYV, utilizando sistema de expressão recombinante em células de insetos, foi realizada a construção de três baculovírus recombinantes para a nsP2 de MAYV, para obtenção da proteína completa (nsP2FL), do domínio de cisteíno protease da porção C-terminal (Pro38), e do domínio N-terminal (NT51) como controle negativo da atividade proteolítica. A expressão de cada uma das formas recombinantes da nsP2 foi realizada em célula de inseto High Five¿. Os resultados foram analisados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) e Western blotting. Apenas a construção NT51 da nsP2 de MAYV foi detectada na fração celular da cultura de High Five¿ por Western blotting. A análise de RNA das células High Five¿ e Sf-9 infectadas com os baculovírus recombinantes para nsP2FL e Pro38, revelou a presença de transcritos das proteínas recombinantes, indicando que a ausência dos produtos proteicos poderia ser devido a perda da cauda de histidina presente nas construções por atividade de proteólise na extremidade Cterminal. Esta hipótese foi confirmada após expressão das proteínas nsP2FL e Pro38, em célula High Five¿ infectada com baculovírus recombinantes para os genes que codificam as respectivas proteínas, com cauda de histidina na porção N-terminal. The arbovirus Mayaro (MAYV), found in regions close to forests and rural areas of South America, is a member of the family Togaviridae, genus Alphavirus. This genus is distributed widely, in two main groups, according to the region in which they were originally isolated: the Old World (Chikungunya, Sindbis, O'nyong-Nyong, Ross River, Semliki Forest) and the New World Alphavirus (Venezuelan Equine Encephalitis, Western Equine Encephalitis). The mosquito Haemagogus spp. is the main vector of MAYV which has also been isolated from mosquitoes of the genus Aedes spp. Considering the similarity of MAYV with Chikungunya virus, recently introduced in Brazil, and transmitted by Ae. aegypti, there is risk of MAYV urban transmission. Indeed, in Brazil, co-circulation of MAYV during dengue outbreaks have been related. Symptoms of MAYV fever are similar to other febrile diseases, such as dengue fever, Chikungunya fever, and malaria, making an accurate diagnosis, difficult. MAYV 11.7 kb genome is divided in two regions: non-structural domain (5'- RNA) containing the genes encoding the nonstructural proteins (nsP1-4); and structural domain containing genes encoding structural proteins. The Alphavirus nonstructural proteins are required for processing of the polyprotein and for viral RNA synthesis. Among the non-structural proteins, viral proteases may be immunogenic besides being excellent therapeutic targets. Genome comparative studies of Alphavirus indicates that the MAYV nsP2 protein has diverse enzymatic activities including a cysteine protease activity in its C-terminal region. Thus, with the objective to obtain a specific diagnostic method for MAYV, using a recombinant expression system in insect cells, a construction of three MAYV nsP2 recombinant baculoviruses to obtain the complete protein (nsP2FL), the C-terminal cysteine protease domain (Pro38), and the N-terminal (NT51) domain as a proteolysis activity negative control. The expression of each nsP2 construction was performed on Sf-9 and High Five¿ insect cells and the results were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE) and Western blotting. Only the nsP2 NT51 construction was detected in the cellular fraction of Sf-9 and High Five¿ cultures by Western blotting. RNA analysis of Sf-9 cells infected with nsP2FL and Pro38 recombinant baculoviruses revealed the presence of transcripts, suggesting that the absence of the corresponding protein products occurred due the proteolysis of the C-terminal portion of the protein, resulting in histidine tail elimination. This hypothesis was confirmed by expression of nsP2FL e Pro38, proteins in Sf-9 and High Five¿ cells infected with recombinant baculoviruses for the genes encoding the respective proteins with histidine tail at the N-terminal portion.

Orientadora: Profa. Dra. Iseli Lourenço Nantes Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2014. Citocromo c é uma proteína formada por uma única cadeia polipeptídica, e em humanos, possui 104 resíduos de aminoácidos, estando associada à membrana interna mitocondrial, sintetizada no citosol como uma apoproteina. Os principais papeis biológicos de citocromo c são, atuação na cadeia de transporte de elétrons, papel oxidante e contribuição na apoptose, quando liberado no citosol. O citocromo c esta sujeito a modificações pós-traducionais que podem estar relacionados à sinalização, como, fosforilação ou agentes pró-oxidantes como é o caso da nitração. O SIN-1 é o principio ativo da Molsidomine (SIN-10), uma droga vasodiladora, estudos demonstraram que a incubação de SIN-1 com citocromo c produz uma espécie modificada de citocromo c. O superóxido reage com o óxido nítrico produzindo peroxinitrito, podendo, portanto, mimetizar essas condições. Os objetivos do trabalho foram investigar melhor essas espécies modificadas e caracterizar sua atividade através de técnicas espectroscópicas. Nas condições estudadas no presente trabalho é possível inferir que a presença da histidina 26 é fundamental para a formação da espécie modificada. A fosforilação das tirosinas 48 e 97 podem ter contribuído para a proteção contra o estresse nitroativo. Houve o desaparecimento da banda de absorção em 695 nm, o que pode indicar que o átomo de Fe perdeu a sexta coordenação com a metionina 80. Estudos posteriores devem ser realizados com o objetivo de avaliar a atividades biológicas dessas espécies modificadas.