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ContextSome reports suggest that acromegaly in elderly patients has a more benign clinical behavior and could have a better response to first-generation long-acting somatostatin receptor ligands (SRL). However, there is no specific therapeutic protocol for this special subgroup of patients.ObjectiveThis study aimed at identifying predictors of response to SRL in elderly patients.DesignMulticentric retrospective nationwide study of patients diagnosed with acromegaly at or over the age of 65 years.ResultsOne-hundred and eighteen patients (34 men, 84 women, mean age at diagnosis 71.7 ± 5.4 years old) were included. Basal insulin-like growth factor type 1 (IGF-1) above the upper limit of normal (ULN) and growth hormone (GH) levels (mean ± SD) were 2.7 ± 1.4 and 11.0 ± 11.9 ng/ml, respectively. The mean maximal tumor diameter was 12.3 ± 6.4 mm, and up to 68.6% were macroadenoma. Seventy-two out of 118 patients (61.0%) underwent surgery as primary treatment. One-third of patients required first-line medical treatment due to a rejection of surgical treatment or non-suitability because of high surgical risk. After first-line surgery, 45/72 (63.9%) were in disease remission, and 16/34 (46.7%) of those treated with SRL had controlled disease. Patients with basal GH at diagnosis ≤6 ng/ml had lower IGF-1 levels and had smaller tumors, and more patients in this group reached control with SRL (72.7% vs. 33.3%; p < 0.04) [OR: 21.3, IC: 95% (2.4–91.1)], while male patients had a worse response [OR: 0.09, IC 95% (0.01–0.75)]. The predictive model curve obtained for SRL response showed an AUC of 0.82 CI (0.71–0.94).ConclusionsThe most frequent phenotype in newly diagnosed acromegaly in the elderly includes small adenomas and moderately high IGF-1 levels. GH at diagnosis ≤6 ng/ml and female gender, but not age per se, were associated with a greater chance of response to SRL.

The work aims were to describe the histological and histochemical structure of the gastroesophageal tube of Iguana iguana and verify the occurrence and distribution of immunoreactive serotonin (5-HT) and somatostatin (SS) cells. Fragments of the gastrointestinal tract (GIT) of five iguanas were which underwent standard histological and immunohistochemistry technique. Immunoreactive cells for 5-HT and SS were quantified using the STEPanizer. The oesophagus has ciliated columnar pseudostratified epithelium with staining Alcian blue (AB) + and goblet cells highly reactive to periodic acid Schiff (PAS). In the cervical oesophagus, the numerical density of 5-HT cells per unit area (QA [5-HT cells]/µm2) was 4.6x10-2 ± 2.0 and celomatic oesophagus presented QA = 4.0x10-2 ± 1.0. The epithelium of the stomach is simple columnar, PAS and AB +. The cranial and middle regions of the stomach presented (QA [5-HT cells]/µm2) = 6.18x10-2 ± 3.2 and the caudal region, QA = 0.6x10-2 ± 0.2. The SS cells were only observed in the caudal stomach, with numerical density (QA [SS cells]/µm2) = 1.4x10-2 ± 0.9 In I. iguana, variation was observed in terms of the distribution of mucus secretions and the pattern of occurrence of serotonin and somatostatin-secreting enteroendocrine cells in the TGI, which possibly will result in an interspecific adaptive response. Resumo Os objetivos do trabalho foram descrever a estrutura histológica e histoquímica do tubo gastroesofágico da Iguana iguana e verificar a ocorrência e distribuição de células serotonina (5-HT) e somatostatina (SS) imunorreativas. Fragmentos do trato gastrointestinal (TGI) de cinco iguanas foram submetidos à técnica histológica e imunohistoquímica padrão. As células imunorreativas para 5-HT e SS foram quantificadas usando o STEPanizer. O esôfago apresenta epitélio pseudoestratificado colunar ciliado Alcian blue (AB) positivo, com células caliciformes altamente reativas ao ácido periódico de Schiff (PAS). No esôfago cervical, a densidade numérica de células 5-HT por unidade de área (QA [células 5-HT] / µm2) foi de 4.6x10-2 ± 2.0 e o esôfago celomático apresentou QA = 4.0x10-2 ± 1.0. O epitélio do estômago é colunar simples, PAS e AB positivo. As regiões cranial e média do estômago apresentaram (QA [células 5-HT] / µm2) = 6.18x10-2 ± 3.2 e a região caudal, QA = 0.6x10-2 ± 0.2. As células SS foram observadas apenas no estômago caudal, com densidade numérica (QA [células SS] / µm2) = 1.4x10-2 ± 0.9. Em I. iguana, foi observada variações em termos da distribuição das secreções de muco e padrão de ocorrência das células enteroendócrinas secretoras de serotonina e somatostatina no TGI, o que possivelmente reflete uma resposta adaptativa interespecifica.

Orientador: Celso Darío Ramos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Os tumores neuroendócrinos (TNE) representam um grupo bastante heterogêneo de tumores malignos raros. Têm como principal característica a expressão de receptores de somatostatina, aos quais se ligam o DOTATATO-68Gae o octreotídio-111In. A sensibilidade da cintilografia e SPECT/CT com esse último radiofármaco (RF) varia de 67% a 100% na detecção desses tumores. Em comparação com a cintilografia, o PET/CT com DOTATATO-68Ga tem uma resolução espacial de 2 a 3 vezes maior e, além disto, a afinidade desse RF por receptores da somatostatina é cerca de dez vezes superior à do octreotídio-111In, o que faz pressupor uma sensibilidade ainda maior do estudo com PET/CT.Objetivo. Comparar a sensibilidade e a especificidade de duas técnicas de imagem realizadas com análogos da somatostatina na detecção de TNE: SPECT/CT com octreotídio-111In e PET/CT com DOTATATO-68Ga. Foi também avaliada a ocorrência de possíveis reações adversas a esses radiofármacos fabricados no Brasil pelo Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN).Materiais e Métodos. Foram estudados 34 pacientes (25 mulheres e 9 homens, idades 21-77 anos, média 55,8 mais ou menos 12,3 anos) portadores de TNE comprovado por estudo anatomopatológico. Todos os pacientes foram submetidos a imagens de octreotídio-111In e DOTATATO-68Ga. Imagens planas e SPECT/CT de octreotídio-111In foram obtidas 24h após a injeção do RF, além de imagens adicionais de 48h. As imagens de PET/CT com DOTATATO-68Ga foram realizadas da cabeça até a raiz das coxas, 45 min após a injeção do RF. O intervalo entre os exames variou de 2 dias a 2,5 meses. Foram comparados o número e a localização das lesões identificadas pelos dois métodos, nas seguintes estruturas: estômago/intestinos (TGI), pâncreas, fígado, linfonodos, esqueleto e outras estruturas.Os pacientes foram cuidadosamente questionados quanto a ocorrência de reações adversas.Os pacientes foramacompanhados por um período mínimo de 2 anos através de exames clínicos, biópsias, exames laboratoriais eexames de imagem.Resultados. Dos 34 pacientes, 5(3 mulheres e 2 homens) apresentaram lesões neoplásicasdetectadas com DOTATATO-68Ga que não foram identificadas com octreotídio-111In (sensibilidades de 88,5% e 73%, e especificidades de 100% e 89%,respectivamente). Nos estudos com octreotídio-111In e DOTATATO-68Ga foram identificadas um total de 92 e 297 lesões neoplásicas, respectivamente, sendo: 7 e 15 no TGI, 58 e 182 no fígado, 11 e 58 em linfonodos, 14 e 36 no esqueleto. Nenhum paciente relatou a ocorrência de qualquer reação adversa com nenhum dos radiofármacos utilizados.Conclusões. As imagens obtidas com DOTATATO-68Ga apresentam sensibilidade superior às realizadas comoctreotídio-111In, tanto na análise por lesão como na análise por paciente, destacando-se a identificação de lesões menores. Esses radiofármacos produzidos e fornecidos pelo IPEN mostraram-se seguros e eficazes para uso clínico Abstract: Neuroendocrine tumors (NETs) represent a rather heterogeneous group of rare malignant tumors. Their main characteristic is the expression of somatostatin receptors to which 68Ga-DOTATATO and 111In-octreotide bind. The sensitivity of the scintigraphy and SPECT/CT with the latter radiopharmaceutical (RF) varies from 67% to 100% in the detection of these tumors. PET/CT with 68Ga-DOTATATO has a spatial resolution 2 to 3 times higher than that of 111In-octreotide scintigraphy, and in addition, the affinity of 68Ga-DOTATATOfor somatostatin receptors is about ten times higher than that of 111In-octreotide, which implies an even greater sensitivity of the PET/CT study.Objective:To compare the sensitivities and specificities of two imaging techniques performed with somatostatin analogues in the detection of TNE: SPECT/CT with 111In-octreotide and PET/CT with 68Ga-DOTATATO.The occurrence of possible adverse reactions to these RFs manufactured in Brazil by the Nuclear and Energy Research Institute (IPEN) was also evaluated.Materials and methods: Thirty-four patients (25 women and 9 men, ages 21-77 years, mean 55.8 +- 12.3 years)were studied. All patients hadNET confirmed by anatomopathological study. Planar and SPECT/CT images of 111In-octreotide were obtained 24h and 48h after injection. PET/CT images with 68Ga-DOTATATO were performed from head to thighs, 45 min after RF injection. The interval between examinations ranged from 2 days to 2.5 months. The number and location of the lesions identified by the two methods were compared in the following structures: stomach/intestines (GIT), pancreas, liver, lymph nodes, skeleton and other structures. Patients were carefully questioned about the occurrence of adverse reactions.Patients were followed up for a minimum of 2 years through clinical exams, biopsies, laboratory tests and imaging examinations.Results: Of the 34 patients, 5 (3 women and 2 men) presented neoplastic lesions detected with 68Ga-DOTATATO that were not identified with 111In-octreotide (sensitivities of 88.5% and 73%, and specificities of 100% and 89%, respectively). 111In-octreotide and 68Ga-DOTATATO studies identified a total of 92 and 297 neoplastic lesions, respectively: 7 and 15 in GIT, 58 and 182 in the liver, 11 and 58 in lymph nodes, 14 and 36 in the skeleton. It was also detected mild uptake in inflammatory processes in 5 and 63 structures with 111In-octreotide and 68Ga-DOTATATO, respectively.No patient reported the occurrence of any adverse reaction with any of the RFs.Conclusions: The images obtained with 68Ga-DOTATATO present higher sensitivity than those performed with 111In-octreotide, both in the patient-based analysisas in thelesion-based analysis, especially for the identification of small lesions. These radiopharmaceuticals produced and supplied by IPEN proved to be safe and effective for clinical use Mestrado Fisiopatologia Cirúrgica Mestra em Ciências

Orientador: Prof. Dr. Cesar Luiz Boguszewski Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 30/04/2021 Inclui referências Resumo: Introdução: Os ligantes do receptor da somatostatina (LRS) de primeira geração são medicações de primeira escolha no tratamento da acromegalia. Apresentam efeito anti-secretivo e anti-proliferativo, podendo reduzir tanto os níveis de GH e IGF-I como o volume tumoral, porém as taxas de resposta bioquímica e tumoral variam entre os estudos. A maioria dos adenomas produtores de GH apresenta algum grau de redução tumoral em resposta aos LRS, a qual é influenciada principalmente pelo tipo de tratamento realizado, se primário ou adjuvante, e pelo tempo de tratamento. Apesar de os guidelines recomendarem análise conjunta dos níveis de GH randômico (GHr) e IGF-I na determinação do controle bioquímico, o IGF-I é geralmente considerado mais relevante para decisões terapêuticas quando os resultados bioquímicos são discordantes. Objetivo: Avaliar e comparar a resposta bioquímica e tumoral entre dois centros de referência para tratamento de doenças hipofisárias no Brasil após 6 e 12 meses de tratamento com LRS de primeira geração. Métodos: Considerando os níveis pré-tratamento de GH e IGF-I, os pacientes foram classificados em não respondedores (NR), respondedores parciais (RP) e respondedores completos (RC) após 6 e 12 meses de tratamento com LRS de acordo com os critérios a seguir: [critério A: GH+IGF-I] IGF-I normal e GHr < 1 ng/mL (RC); ? 50% de decréscimo do IGF-I e/ou do GHr (RP); < 50% de decréscimo do IGF-I e do GHr (NR); [critério B: somente IGF-I] IGF-I normal (RC); ? 50% de decréscimo do IGF-I (RP); < 50% de decréscimo do IGF-I (NR). Quanto à resposta tumoral, os pacientes foram classificados em bons respondedores (tBR) ou não respondedores (tNR) se a redução tumoral foi ? 20% ou < 20%, respectivamente, após 12 meses de tratamento com LRS. Resultados: Foram analisados 219 pacientes com acromegalia (59% mulheres, com idade média de 43,2 ± 14 anos), 73 provenientes do Centro I e 146 do Centro II. Não houve diferença estatística entre os dois centros em relação à idade, gênero, tamanho do tumor, realização de radioterapia prévia e tipo de tratamento com LRS (primário ou adjuvante). A proporção de RC, RP e NR pelos critérios A e B foi de 30,2% vs 49,1%, 52,8% vs 21,2% e 17% vs 29,7%, respectivamente (p

La acromegalia se debe a la producción excesiva de hormona del crecimiento (GH), generalmente por un adenoma hipofisario. El tratamiento primario de elección es el quirúrgico, con unos índices de remisión del 80-90% en pacientes con microadenomas y del 50% en los macroadenomas. Sin embargo, la disponibilidad de fármacos para el tratamiento de la acromegalia como los análogos de somatostatina (SSA) y, en menor medida, los agonistas dopaminérgicos (DA), ha modificado la secuencia terapéutica en algunos casos. Los SSA (octreótida, lanreótida y pasireótida) inhiben la secreción de GH mediante la unión a receptores específicos de la somatostatina (SRIF). En particular, los SSA de primera generación, octreótida y lanreótida, se unen preferentemente a receptores SST2; mientras que el SSA de segunda generación, pasireótida, se une a varios receptores y con mayor afinidad a SST5. Por su parte, los DA se unen fundamentalmente al receptor de dopamina tipo-2 (DR2). Aunque se ha demostrado que estos fármacos son capaces de reducir los niveles de GH y aliviar algunos síntomas, su eficacia no es generalizada y un porcentaje de los pacientes presentan baja o nula respuesta de partida, o una pérdida de la misma, probablemente asociada a unos bajos niveles de expresión de receptores de SST y dopamina en el adenoma somatotropo. Por desgracia, hasta el momento actual, no hay descrito ningún parámetro clínico, bioquímico, anatomopatológico, inmunohistoquímico ni molecular a nivel tumoral que nos permita predecir con seguridad la eficacia del tratamiento médico pre-quirúrgico y/o la curación de la acromegalia en los enfermos tratados con cirugía, siendo necesario el seguimiento de por vida en todos los casos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es determinar la posible relación entre las características clínico-patológicas de los pacientes al diagnóstico de la acromegalia y la expresión de distintos receptores moleculares a nivel tumoral. El segundo objetivo de nuestro estudio es analizar si existe una relación entre la señal en T2 en la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) del adenoma y las características clínico-patológicas de los pacientes al diagnóstico de la acromegalia y/o con la expresión génica de distintos receptores a nivel tumoral, para así poder anticipar cuál podría ser el tratamiento más eficiente en la terapia prequirúrgica del paciente. Así mismo, como último objetivo se pretendió evaluar la posible capacidad de la expresión de receptores para predecir la curación o recidiva de la acromegalia. Para ello se diseñó un estudio observacional retrospectivo, en el que se incluyeron 22 pacientes con acromegalia diagnosticados en el servicio de Endocrinología y Nutrición del Hospital Universitario Reina Sofía que se intervinieron quirúrgicamente, y en los que se realizó el estudio molecular del tumor en el Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC) y el Departamento de Biología Celular de la Universidad de Córdoba. Los resultados demuestran que: 1) No existen diferencias en cuanto a la curación quirúrgica o el control bioquímico, entre aquellos que recibieron tratamiento con SSA antes de la cirugía, y los que no lo recibieron. 2) Los niveles de expresión de los receptores en el adenoma no se correlacionaron con las medidas de IGF-1 o de GH sérica después de la SOG. 3) Los adenomas con crecimiento extraselar y concretamente aquellos con crecimiento supraselar tienen mayor expresión de SST3, por lo que pasireótida podría ser una alternativa terapéutica. También expresan más DR4, por lo que probablemente sea interesante el estudio de este receptor como diana para el tratamiento de estos pacientes. A su vez, tienen mayor expresión de SST3 y mayor expresión de Ki67. Concretamente aquellos con crecimiento supraselar tienen mayor expresión de SST3, DR4 y DR5 que aquellos sin crecimiento supraselar. Los adenomas con invasión de senos cavernosos también expresan más DR5 que aquellos sin invasión. 4) Los niveles de colesterol total basal, y los de LDL-c se correlacionan de forma directa con SST2, lo que sugiere que los pacientes con hipercolesterolemia se podrían beneficiar mejor del tratamiento con octreótida o lanreótida. 5) Los niveles de cortisol plasmático se relacionan de forma directa con la expresión de SST2, SST3, SST5 y DR2L. 6) Existe una correlación inversa entre la edad al diagnóstico y la talla y entre la edad al diagnóstico y los niveles de GH plasmáticos. 7) Los adenomas hiperintensos en T2 tendían a ser más grandes, sobre todo en el diámetro inferoposteiror (DIP) y a ser más invasivos, pues tenían un índice de Knosp mayor. Además, los adenomas hiperintensos en T2 tendían a tener niveles más altos de IGF-1 y un nadir menor de GH tras SOG, y mayor expresión de DR5 y Ki67 que aquellos isointensos. 8) La expresión de DR5 se correlaciona de forma directa con los diámetros DAP y DIP, y también existe una correlación directa entre el índice de Knosp y la expresión de DR5 y de SST3. Además, el índice de proliferación Ki67 se correlacionó de forma directa con la expresión de DR5, SST2 y SST3. 9) Los adenomas con mayores niveles de expresión del DR2T muestran una correlación con un mejor control bioquímico de los pacientes.

Background: Acid inhibition from chronic proton pump inhibitor use and a possible increase in gastrin can lead to changes in the regulation of hydrochloric acid production. However, it has not known whether such chronic use changes the presence of gastrin, delta, and enterochromaffin-like cells in the stomach or the relationship between gastrin and delta cells. Aim: To analyze the number of gastrin-producing gastrin cells, somatostatin-producing cells, and histamine-producing cells in patients who were chronic users of proton pump inhibitor, with or without related Helicobacter pylori infection. Methods: Biopsies from 105 patients, including 81 chronic proton pump inhibitor users (experimental group) and 24 controls, were processed immunohistochemically and subjected to counting of gastrin, delta, and enterochromaffin-like cells in high-magnification microscopic fields and in 10 glands. Results: Gastrin cell, delta cell, and enterochromaffin-like cells counts were similar across the groups and appeared to be unaffected by Helicobacter pylori infection. The ratio between gastrin cells and delta cells was higher in the chronic users of proton pump inhibitor group than in controls. Conclusion: Chronic users of proton pump inhibitor does not affect gastrin cell, delta cell, and enterochromaffin-like cell counts significantly, but may alter the ratio between gastrin cells and delta cells., Graphical Abstract IHC identifying G, D, and ECL cells

El término quilotórax se refiere a la presencia de quilo en el espacio pleural, es usualmente secundario a la ruptura del conducto torácico, a una de sus ramas o debido a alguna alteración del flujo del quilo. Algunas de sus causas: son trauma, neoplasias, misceláneas e idiopáticas. Esta asociado a una alta morbilidad y mortalidad. Su manejo puede ser conservador o quirúrgico. Se presenta el caso de un paciente de 16 años, que después a un accidente de tránsito conduciendo una motocicleta, tuvo traumatismo cerrado de tórax y posteriormente desarrolló quilotórax bilateral. Este fue resuelto conservadoramente mediante toracostomía bilateral y la administración de nutrición parenteral total ysomatostatina. Hubo disminución gradual de la producción de quilo, a los once días se le suspendió la sonda de tórax izquierda y a los dieciséis días se le suspendió la sonda derecha, las radiografías control no mostraron persistencia de liquido pleural y se egresa. The presence of chyle in the chest cavity is known as chylothorax. It is usually secondary to the disruption of the thoracic duct or one of its branches or due to an alterationin the flow of lymph. Some of the causes of chylothorax are: trauma, tumors, miscellaneous or idiopathic. It is associated with high morbidity and mortality. The management of thiscondition can be conservative or surgical. We report the case of a sixteen-year-old patient, who was involved in a motorcycle accident and suffered bluntthoracic trauma, thus developing bilateral chylothorax. He was treated conservatively through bilateral cheste tube insertion, parenteral nutrition and administration of somatostatin. There was a gradual drop in chyle production, the left chest tube was removed after eleven days and the right one after sixteen. Chest x-rays did not show any residual pleural fluid and the patient was discharged.

Certain components of the somatostatin-system play relevant roles in Prostate Cancer (PCa), whose most aggressive phenotype (Castration-Resistant-PCa (CRPC)) remains lethal nowadays. However, neuronostatin and the G protein-coupled receptor 107 (GPR107), two novel members of the somatostatin-system, have not been explored yet in PCa. Consequently, we investigated the pathophysiological role of NST/GPR107-system in PCa. GPR107 expression was analyzed in well-characterized PCa patient&prime, s cohorts, and functional/mechanistic assays were performed in response to GPR107-silencing and NST-treatment in PCa cells (androgen-dependent (AD: LNCaP) and androgen-independent (AI: 22Rv1/PC-3), which are cell models of hormone-sensitive and CRPC, respectively), and normal prostate cells (RWPE-1 cell-line). GPR107 was overexpressed in PCa and associated with key clinical parameters (e.g., advance stage of PCa, presence of vascular invasion and metastasis). Furthermore, GPR107-silencing inhibited proliferation/migration rates in AI-PCa-cells and altered key genes and oncogenic signaling-pathways involved in PCa aggressiveness (i.e., KI67/CDKN2D/MMP9/PRPF40A, SST5TMD4/AR-v7/In1-ghrelin/EZH2 splicing-variants and AKT-signaling). Interestingly, NST treatment inhibited proliferation/migration only in AI-PCa cells and evoked an identical molecular response than GPR107-silencing. Finally, NST decreased GPR107 expression exclusively in AI-PCa-cells, suggesting that part of the specific antitumor effects of NST could be mediated through a GPR107-downregulation. Altogether, NST/GPR107-system could represent a valuable diagnostic and prognostic tool and a promising novel therapeutic target for PCa and CRPC.

Introdução: A inibição ácida com o uso crônico de inibidores de bomba de prótons e o possível aumento da gastrina podem ser seguidos de alterações na regulação da produção do ácido clorídrico. No entanto, não se sabe se esse uso crônico altera a presença de células G, D e enterocromafin-like no estômago ou a razão entre as células G e D em humanos. Objetivo: Avaliar o número de células G - produtoras de gastrina, células D produtoras de somatostatina e células ECL produtoras de histamina, em pacientes usadores crônicos de inibidores de bomba de prótons (mais de 6 meses), com ou sem infecção pelo Helicobacter pylori. Material e Método: Biópsias de 105 pacientes, 81 usadores crônicos de inibidores de bomba de prótons e 24 controles, foram processados imuno-histoquimicamente e submetidas à contagem de células G, D e ECL em campos microscópicos de grande aumento e em 10 glândulas. Resultados: Células G, D e ECL foram semelhantes entre os grupos e parece não serem afetadas pela infecção por Helicobacter pylori. A razão células G/D foi maior no grupo dos usadores crônicos de IBP do que nos controles. Conclusão: O uso crônico de inibidores de prótons parece não interferir na contagem das células G, D e ECL, porém interfere na razão entre as células G e D. Estudos de longo prazo, especialmente incluindo pacientes que usam IBP por > 3 anos, são necessários para definir o período de uso que pode levar a uma mudança significativa no número das células da mucosa do estômago. Background: Acid inhibition from chronic proton pump inhibitor use and a possible increase in gastrin can lead to changes in the regulation of hydrochloric acid production. However, it has not known whether such chronic use changes the presence of G, D, and enterochromaffin-like cells in the stomach or the relationship between G and D cells. Objective: To analyze the number of gastrin-producing G cells, somatostatin-producing D cells, and histamine-producing ECL cells in patients who are chronic proton pump inhibitor users (more than 6 months), with or without related Helicobacter pylori infection. Materials and Methods: Biopsies from 105 patients, including 81 chronic PPI users and 24 controls, were processed immunohistochemically and subjected to counting of G, D, and ECL cells in high-magnification microscopic fields and in 10 glands. Results: G cell, D cell, and ECL cell counts were similar across the groups, and appeared to be unaffected by Helicobacter pylori infection. The ratio between G/D cells was higher in the chronic PPI users group than in controls. Conclusion: Chronic PPI use does not affect G cell, D cell, and ECL cell counts significantly, but may alter the ratio between G cells and D cells. Longer-term studies, especially inclusive of patients who have used PPIs for >3 years, are needed to define the period of use that may lead to significant shift in stomach mucosal cell populations.

RESUMEN Las metástasis en hueso malar de tumores sólidos infraclaviculares son excepcionales. En aquellos de estirpe neuroendocrina, se debe considerar la expresión de receptores de somatostatina mediante diferentes técnicas de medicina nuclear para realizar terapias dirigidas. Se presenta un caso clínico de un varón de 66 años con neoplasia pulmonar con diferenciación oncocítica, cuyo debut es una metástasis malar de lenta evolución. Es tratado con lanreotido y ácido zolendrónico con enfermedad estable al año de seguimiento. ABSTRACT Malar bone metastases of solid infraclavicular tumours are exceptional. Expression of somatostatin receptors should be considered in neuroendocrine strains, in order to carry out targeted therapies. We report a clinical case of a 66-year-old man with a tumour of the lung with oncocytic features, which debut is a malar metastasis of slow evolution. He is treated with Lanreotide and Zolendronic acid with stable disease at 1-year follow-up.

espanolLas metastasis en hueso malar de tumores solidos infraclaviculares son excepcionales. En aquellos de estirpe neuroendocrina, se debe considerar la expresion de receptores de somatostatina mediante diferentes tecnicas de medicina nuclear para realizar terapias dirigidas. Se presenta un caso clinico de un varon de 66 anos con neoplasia pulmonar con diferenciacion oncocitica, cuyo debut es una metastasis malar de lenta evolucion. Es tratado con lanreotido y acido zolendronico con enfermedad estable al ano de seguimiento. EnglishMalar bone metastases of solid infraclavicular tumours are exceptional. Expression of somatostatin receptors should be considered in neuroendocrine strains, in order to carry out targeted therapies. We report a clinical case of a 66-year-old man with a tumour of the lung with oncocytic features, which debut is a malar metastasis of slow evolution. He is treated with Lanreotide and Zolendronic acid with stable disease at 1-year follow-up.

A wealth of evidence has shown that opioid and kinin systems may control proximal defense in the dorsal periaqueductal gray matter (dPAG), a critical panic-associated area. Studies with drugs that interfere with serotonin–mediated neurotransmission suggest that the μ-opioid receptor (MOR) synergistically interacts with the 5-HT 1A receptor in the dPAG to inhibit escape, a panic-related behavior. A similar inhibitory effect has also been reported after local administration of bradykinin (BK), which is blocked by the non-selective opioid receptor antagonist naloxone. The latter evidence, points to an interaction between BK and opioids in the dPAG. We further explored the existence of this interaction through the dPAG electrical stimulation model of panic. We also investigated whether intra-dPAG injection of captopril, an inhibitor of the angiotensin-converting enzyme (ACE) that also degrades BK, causes a panicolytic-like effect. Our results showed that intra-dPAG injection of BK inhibited escape performance in a dose-dependent way, and this panicolytic-like effect was blocked by the BK type 2 receptor (B2R) antagonist HOE-140, and by the selective MOR antagonist CTOP. Conversely, the panicolytic-like effect caused by local administration of the selective MOR agonist DAMGO was antagonized by pre-treatment with either CTOP or HOE-140, indicating cross-antagonism between MOR and B2R. Finally, intra-dPAG injection of captopril also impaired escape in a dose-dependent way, and this panicolytic-like effect was blocked by pretreatment with HOE-140, suggesting mediation by endogenous BK. The panicolytic-like effect of captopril indicates that the use of ACE inhibitors in the clinical management of panic disorder may be worth exploring.

Background: Paraduodenal pancreatitis is a rare cause of chronic abdominal pain characterized by an inflammatory process and scarring in the groove area between the pancreatic head and the duodenal wall. Besides abdominal pain, symptoms such as vomiting and weight loss are common. Currently, advances in radiological and endoscopic diagnostic methods allow it to be identified without histological confirmation, although the differentiation from pancreatic adenocarcinoma could be challenging in some cases. Many therapeutic options are available nowadays including pharmacological, endoscopic, or surgical treatment. Methods: We report 3 cases of paraduodenal pancreatitis that had different therapeutic approaches. Results and Conclusion: They show that this pathology should be taken into account in the differential diagnosis of pancreatic masses with duodenal infiltration, and that its management should be individualized and judicious. Introdução: A pancreatite paraduodenal constitui uma causa rara de dor abdominal crónica, caracterizada por processo inflamatório com consequente cicatrização no sulco entre a cabeça do pâncreas e a parede duodenal. Para além de dor abdominal, sintomas como vómitos e perda de peso são frequentes. Actualmente, com o desenvolvimento dos métodos diagnósticos imagiológicos e endoscópicos, pode ser identificada sem necessidade de confirmação histológica, embora a diferenciação com o adenocarcinoma pancreático possa ser desafiante. Diversas opções terapêuticas encontram-se disponíveis incluindo tratamento farmacológico, endoscópico ou cirúrgico. Métodos: Os autores descrevem três casos de pancreatite paraduodenal com diferentes atitudes terapêuticas. Resultados e Conclusão: Estes demonstram que esta patologia deve ser considerada no diagnóstico diferencial de massas pancreáticas com infiltração duodenal e que a sua abordagem deve ser individualizada e judiciosa.

Neuroendocriene tumoren (NET) vormen een heterogene groep van zeldzaam voorkomende, langzaam groeiende tumoren. NET ontstaan vanuit enterochromaffine cellen. De jaarlijkse incidentie van NET is progressief toegenomen in de afgelopen jaren. Het is echter niet duidelijk of deze toename in incidentie een werkelijke toename is, veroorzaakt wordt door verbeterde diagnostische procedures, of door een combinatie van beiden. Hoewel NET vaak al gemetastaseerd blijken te zijn bij de diagnose, is de gemiddelde overleving van patiënten met NET toegenomen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan verbeterde diagnostiek en toegenomen therapeutische mogelijkheden. Er zijn goede en gestandaardiseerde diagnostische procedures nodig om patiënten met een NET in een zo vroeg mogelijk stadium te diagnosticeren, om het beloop van de ziekte nauwlettend te vervolgen en om deze patiënten een optimale behandeling te kunnen geven. In de afgelopen jaren is het aantal medicamenteuze behandelingsmogelijkheden voor patiënten met een NET sterk toegenomen. In dit proefschrift worden een aantal studies beschreven die betrekking hebben op diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor NET patiënten. Hoofdstuk 1 betreft een algemene inleiding over NET en benadrukt de toepassing en beperkingen van de huidige diagnostische procedures voor patiënten met NET. Er wordt een overzicht gegeven van een aantal mogelijk nieuwe diagnostische (bio)merkers. In dit hoofdstuk worden tevens huidige en nieuwe behandelingsmogelijkheden voor functionele en niet-functionele NET besproken. Dit hoofdstuk vormt de inleiding voor het onderwerp van dit proefschrift, n.l. nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met NET. Hoofdstuk 1 wordt afgesloten met een overzicht van de doelstellingen van het onderzoek van het proefschrift. In het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2 is de expressie van verschillende componenten van het somatostatine/cortistatine en het ghrelin systeem onderzocht in een grote serie van goed gekarakteriseerde typische en atypische long carcinoiden (LC). Voor zover bekend is dit de eerste studie waarin beide systemen tegelijkertijd worden onderzocht in LC weefsels. Het onderzoek toont aan dat de expressie van somatostatine, van enkele somatostatine receptor subtypen (SSTs), en van de ghrelin receptor GHSR, gradueel toeneemt van normaal naar niet tumor-aangrenzend weefsel en tumor weefsel. Bovendien werd voor de eerste keer in LC expressie aangetoond van de korte iso-vormen SST5TMD4, In1-ghrelin en de ghrelin receptor GHSR1b. Hogere expressie van ghrelin-O-acetyltrasferase (GOAT) werd gevonden in tumoren met necrose, grotere tumoren met meer peritumorale invasie en metastasen op afstand. Deze bevindingen suggereren dat een ontregelde regulatie van het ghrelin systeem betrokken zou kunnen zijn bij de ontwikkeling/progressie van de tumoren. In hoofdstuk 3 wordt onderzoek naar de expressie van componenten van het somatostatine/ cortistatine systeem in gastroenteropancreatische- (GEP-) NET beschreven. De gevonden hogere expressie van SST5 in tumor weefsel in vergelijking met tumor-aangrenzend en met normaal weefsel, en de klinische relatie van SST5 expressie met vasculaire- en zenuw invasie, suggereert dat SST5 een mogelijk doelwit is om agressieve GEP-NET te behandelen. Bovendien kan de evaluatie van het SSTs profiel in GEP-NET aanvullende informatie opleveren die mogelijk gebruikt kan worden bij klinische besluitvorming, waaronder het gebruik van een tweede generatie somatostatine analogen (SSA). De meest nieuwe en relevante bevinding van het onderzoek beschreven in hoofdstuk 4 is de duidelijke overexpressie van GOAT in GEP-NET weefsel. Terwijl de expressie van dit enzym vrijwel afwezig is in bijbehorend normaal weefsel, wordt expressie gevonden in aangrenzend niet-tumor weefsel en is expressie van GOAT met name aanwezig in tumor weefsel. De hogere expressie van GOAT in GEP-NET weefsel werd tevens aangetoond met behulp van immunohistochemie. Hoge expressie van dit enzym was geassocieerd met grotere tumoren en voornamelijk in gastro-intestinale NET. Deze bevindingen, tezamen met eerdere publicaties, suggereren dat GOAT een mogelijke diagnostische biomerker is in GEP-NET. Hoofdstuk 5 beschrijft onderzoek naar de effecten van het geneesmiddel ketoconazol op de groei, cel cyclus, apoptose en afgifte van ACTH of serotonine en chromogranine in respectievelijk een ACTH-producerende long NET cellijn en een niet-ACTH producerende pancreas NET cellijn. Ketoconazol heeft een voornamelijk pro-apoptotisch of cytotoxisch effect, afhankelijk van het type cellijn. Bovendien zorgt behandeling met ketoconazol voor veranderingen in celcyclus, namelijk een toename in G0/G1 fase in beide cellijnen en een afname in G2/M fase in de pancreas NET cellijn. Bovendien tonen de resultaten in hoofdstuk 5 een niet eerder gerapporteerd remmend effect aan van het SSA pasireotide op serotonine afgifte van de pancreas NET cellijn. Dit effect wordt waarschijnlijk gemedieerd via de hoge SST5 expressie in deze cellijn. Het onderzoek in hoofdstuk 6 beschrijft een uitgebreide karakterisering van twee páncreas NET modellen in tweedimensionale (monolayer) en driedimensionale (sferoïden) kweeksystemen, in verschillende kweekmedium condities. Op basis van de resultaten van dit onderzoek wordt geconcludeerd dat een driedimensionaal (sferoïde) kweeksysteem een veelbelovend systeem is om groei en hormoon secretie van NET cellijnen te bestuderen, zelfs onder serum arme kweekcondities. In dit onderzoek wordt tevens aangetoond dat de expressie van SSTs en de dopamine D2 receptor (D2R) verandert tijdens de groei van cellen, zowel in twee- als driedimensionale kweken. De effecten van het somatostatine analoog octreotide, de dopamine agonist cabergoline en van twee nieuwe SSTs-D2R bindende geneesmiddelen (BIM-065 en BIM-23A760) werden onderzocht in de twee kweeksystemen. Cabergoline en de twee SSTs-D2R multi-receptor bindende geneesmiddelen, en niet octreotide, hadden een remmend effect op de afgifte van chromogranine en serotonine, maar niet op de celgroei. De bevindingen suggereren dat het effect van de twee SSTs-D2R bindende geneesmiddelen op de afgifte van hormonen in dit pancreas NET model verloopt via de D2R, en een mogelijke rol voor dopamine agonisten bij de behandeling van D2R-bevattende functionele NET, waaronder het carcinoid syndroom. Hoofdstuk 7 beschrijft onderzoek naar de in vitro effecten van de nieuwe tryptofaan hydroxylase remmer telotristat op pancreas NET cellen. Telotristat remt krachtig en dosisafhankelijk de serotonine afgifte, bij klinisch relevante concentraties. De combinatie met pasireotide, maar niet met octreotide, had een aanvullend remmend effect op de serotonine afgifte. In driedimensionaal gekweekte pancreas NET cellen kon de serotonine afgifte volledig worden geremd door telotristat, maar was er geen effect op de celgroei. Deze resultaten tonen aan dat serotonine in dit pancreas NET model geen autocrien/paracrien effect heeft op de celgroei. Het onderzoek in hoofdstuk 8 toont dat de SSTs expressie in GEP-NET weefsel van patiënten met type 2 diabetes verlaagd is ten opzichte van GEP-NET weefsel van patiënten zonder diabetes. In type 2 diabetes patiënten die behandeld werden met metformine werd deze verlaging in SSTs expressie niet gevonden. In vitro experimenten toonden groei remmende effecten van biguanides en statines aan op NET cellijnen, met een toegenomen apoptose en afgenomen migratie van de cellen. Aangezien metformine en statines commercieel verkrijgbare en relatief goedkope geneesmiddelen zijn en er een langdurige ervaring is in het gebruik ervan, kunnen deze geneesmiddelen mogelijk van aanvullende waarde zijn bij de adjuvante behandeling van patiënten met NET. In hoofdstuk 9 worden de resultaten en conclusies van de studies uit dit proefschrift bediscussieerd in relatie tot huidige en mogelijk nieuwe toekomstige diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met een NET. Los tumores neuroendocrinos (NETs) son un grupo heterogéneo de neoplasias poco comunes, caracterizadas por un lento crecimiento y que se originan a partir de las células enterocromafines. Su incidencia anual viene aumentando progresivamente, aunque se desconoce si éste incremento es real, el reflejo de mayor uso de (mejores) técnicas diagnósticas o una combinación de ambas. A pesar de que frecuentemente los NETs tienen metástasis al diagnóstico, la supervivencia en estos pacientes ha aumentado, lo cual puede relacionarse con mejoras en las opciones diagnósticas y terapéuticas disponibles. Los NETs requieren métodos diagnósticos estandarizados para asegurar un diagnóstico precoz, así como para monitorizar la progresión de la enfermedad y orientar un tratamiento óptimo. Adicionalmente, el número y la calidad de las opciones terapéuticas se ha incrementado en los últimos años. En este sentido, esta tesis evalúa algunas nuevas opciones diagnósticas y terapéuticas para pacientes con NETs. El capítulo 1 ofrece una visión general sobre los NETs, y se centra en la utilidad/ limitaciones de los biomarcadores actualmente disponibles, así como en la descripción de algunos nuevos (posibles) marcadores en NETs. Además, resume opciones terapéuticas para tumores neuroendocrinos funcionantes y no funcionantes, tanto aquellas nuevas como las actualmente disponibles. Este capítulo representa la introducción al contenido fundamental de esta tesis: nuevos marcadores diagnósticos y opciones terapéuticas en NETs. El capítulo 1 termina con una visión general de los objetivos generales de esta tesis. El capítulo 2 evalúa detalladamente la expresión de algunos componentes de los sistemas somatostatina/cortistatina y ghrelina en una seria amplia, bien caracterizada, de carcinoides pulmonares típicos y atípicos. Hasta donde sabemos, este estudio representa la primera caracterización sistemática de los componentes de estos sistemas reguladores en muestras de carcinoides pulmonares (LCs), tejido adyacente no tumoral y pulmón sano. En este estudio, la expresión de somatostatina, de algunos de sus receptores (SSTs) y del receptor de ghrelina se incrementó gradualmente en el tejido no tumoral adyacente y en el tejido tumoral en comparación a pulmón normal. Además, la presencia de isoformas truncadas SST5TMD4, In1-ghrelin y el receptor de ghrelina GHSR1b fue reportada por primera vez en LCs. Asimismo, una expresión aumentada de la enzima ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) se observó en tumores con necrosis, los cuales (a su vez) fueron aquellos con mayor tamaño, mayor capacidad de invasión y de producir metástasis a distancia. Estos datos sugieren que una desregulación del sistema ghrelina puede estar involucrada en el desarrollo/progresión de estos tumores. El capítulo 3 discute específicamente la expresión de componentes de los sistemas somatostatina/ cortistatina en tumorres gastroenteropancreáticos (GEP-NETs). La sobre-expresión observada de SST5 en el tejido tumoral comparado con el tejido adyacente no tumoral y el control sano, así como su relación clínica con la invasión vascular y nerviosa del tumor, sugieren un probable rol de SST5 como diana terapéutica en GEP-NETs agresivos, además, enfatiza la importancia de evaluar el perfil de SSTs en GEP-NETs, el cual aportaría información adicional para la toma de decisiones terapéuticas, incluida la utilización de análogos de somatostatina (SSAs) de segunda generación. El hallazgo más novedoso y relevante del capítulo 4 es la marcada sobre-expresión de la enzima GOAT en muestras de GEP-NETs. Específicamente, cuando la expresión de esta enzima es prácticamente ausente en tejido normal, su expresión se observó en tejido adyacente no tumoral y se sobre-expresó en tejido tumoral, una sobre-expresión que fue confirmada utilizando inmunohistoquímica. Asimismo, esta enzima se asoció con tumores de mayor tamaño, especialmente en NETs gastrointestinales. Estos hallazgos, combinados con publicaciones previas, sugieren el posible papel de la enzima GOAT como un biomarcador en NETs. El capítulo 5 describe los efectos de ketoconazol en la proliferación, ciclo celular, apoptosis, secreción de adrenocorticotropina (ACTH) o serotonina y cromogranina en una línea celular de NET bronquial productora de ACTH y una línea celular de NET pancreático no productora de ACTH. Específicamente, ketoconazol mostró características predominantemente pro-apoptóticas o citotóxicas dependiendo de la línea celular; estos efectos se mantuvieron a pesar de la combinación con SSAs. Además, ketoconazol fue capaz de inducir cambios en el ciclo celular, específicamente el aumento de las fases G0/G1 en ambas líneas celulares y una disminución de las fases G2/M en la línea celular pancreática. Incluso se observó un efecto inhibitorio en la secreción de serotonina del análogo de somatostatina pasireotide en la línea celular pancreática, el cual no había sido previamente descrito y que probablemente se debe a la expresión de SST5 en esta línea celular. En el capítulo 6 se caracteriza de forma detallada un modelo de líneas celulares pancreáticas utilizando sistemas de cultivo en dos- (2D; monolayer) y tres- dimensiones (3D; esferoides) en diferentes condiciones de nutrientes. Al analizar los resultados, se observa que los cultivos en 3D con esferoides representan un método valioso para evaluar la secreción y proliferación celular en líneas celulares de NETs, incluso en condiciones con deprivación de suero. Se observó una expresión dinámica de los SSTs y receptor de dopamina (D2R) en los sistemas de cultivo en 2D y 3D, lo cual no se había descrito previamente. En este capítulo, los efectos del análogo de somatostatina octreotide y el agonista de dopamina cabergolina, así como de los nuevos fármacos quimera SSTs-D2R (BIM-065, BIM-23A760) se evaluaron en ambos modelos de cultivo. El tratamiento con cabergolina y ambas quimeras inhibió la secreción de cromogranina A y serotonina, pero no la proliferación celular. Esto sugiere que el efecto de las quimeras en la secreción parece estar mediado por el D2R, sugiriendo un posible papel de los agonistas de cabergolina para el tratamiento de NETs funcionantes, incluido el síndrome carcinoide siempre y cuando expresen D2R. El capítulo 7 muestra los efectos in vitro de telotristat etiprate, un nuevo inhibidor de la enzima hidroxilasa de triptófano en líneas celulares pancreáticas. Este fármaco mostró un potente efecto en la inhibición de la secreción de serotonina, el cual fue dependiente de dosis en un modelo de células pancreáticas de NETs. Su combinación con pasireotide, pero no con octreotide, tuvo un efecto aditivo en el control de la secreción de serotonina. En el modelo 3D de NET pancreático, la secreción de serotonina fue totalmente inhibida por telotristat, sin embargo, este bloqueo no produjo cambios en el crecimiento celular. Estos datos sugieren que la serotonina no ejerce un efecto autocrino/paracrino en la proliferación celular en este modelo 3D de NET pancreático. En el capítulo 8 se observó una expresión disminuida de SSTs en pacientes con diabetes tipo 2 y GEP-NETs comparado con pacientes con GEP-NETs pero sin diabetes. Esta expresión disminuida no se observó cuando los pacientes diabéticos fueron tratados con metformina. Los estudios in vitro demostraron el efecto anti-proliferativo de las biguanidas y estatinas en líneas celulares de NETs, con el consiguiebnte incremento de la apoptosis y disminución de la migración celular. Puesto que la metformina y las estatinas son fármacos comercialmente disponibles, económicos y con una amplia experiencia en su uso, nuestros resultados sugieren que estos fármacos podrían representar una opción terapéutica factible como terapia adyuvante en NETs. Finalmente, en el capítulo 9 se discuten los resultados y conclusiones de los estudios presentados en esta tesis, especialmente en relación a las modalidades diagnósticas y opciones terapéuticas, tanto actuales como futuras, para los pacientes con NETs.

Neuroendocriene tumoren (NET) vormen een heterogene groep van zeldzaam voorkomende, langzaam groeiende tumoren. NET ontstaan vanuit enterochromaffine cellen. De jaarlijkse incidentie van NET is progressief toegenomen in de afgelopen jaren. Het is echter niet duidelijk of deze toename in incidentie een werkelijke toename is, veroorzaakt wordt door verbeterde diagnostische procedures, of door een combinatie van beiden. Hoewel NET vaak al gemetastaseerd blijken te zijn bij de diagnose, is de gemiddelde overleving van patiënten met NET toegenomen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan verbeterde diagnostiek en toegenomen therapeutische mogelijkheden. Er zijn goede en gestandaardiseerde diagnostische procedures nodig om patiënten met een NET in een zo vroeg mogelijk stadium te diagnosticeren, om het beloop van de ziekte nauwlettend te vervolgen en om deze patiënten een optimale behandeling te kunnen geven. In de afgelopen jaren is het aantal medicamenteuze behandelingsmogelijkheden voor patiënten met een NET sterk toegenomen. In dit proefschrift worden een aantal studies beschreven die betrekking hebben op diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor NET patiënten. Hoofdstuk 1 betreft een algemene inleiding over NET en benadrukt de toepassing en beperkingen van de huidige diagnostische procedures voor patiënten met NET. Er wordt een overzicht gegeven van een aantal mogelijk nieuwe diagnostische (bio)merkers. In dit hoofdstuk worden tevens huidige en nieuwe behandelingsmogelijkheden voor functionele en niet-functionele NET besproken. Dit hoofdstuk vormt de inleiding voor het onderwerp van dit proefschrift, n.l. nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met NET. Hoofdstuk 1 wordt afgesloten met een overzicht van de doelstellingen van het onderzoek van het proefschrift. In het onderzoek beschreven in hoofdstuk 2 is de expressie van verschillende componenten van het somatostatine/cortistatine en het ghrelin systeem onderzocht in een grote serie van goed gekarakteriseerde typische en atypische long carcinoiden (LC). Voor zover bekend is dit de eerste studie waarin beide systemen tegelijkertijd worden onderzocht in LC weefsels. Het onderzoek toont aan dat de expressie van somatostatine, van enkele somatostatine receptor subtypen (SSTs), en van de ghrelin receptor GHSR, gradueel toeneemt van normaal naar niet tumor-aangrenzend weefsel en tumor weefsel. Bovendien werd voor de eerste keer in LC expressie aangetoond van de korte iso-vormen SST5TMD4, In1-ghrelin en de ghrelin receptor GHSR1b. Hogere expressie van ghrelin-O-acetyltrasferase (GOAT) werd gevonden in tumoren met necrose, grotere tumoren met meer peritumorale invasie en metastasen op afstand. Deze bevindingen suggereren dat een ontregelde regulatie van het ghrelin systeem betrokken zou kunnen zijn bij de ontwikkeling/progressie van de tumoren. In hoofdstuk 3 wordt onderzoek naar de expressie van componenten van het somatostatine/ cortistatine systeem in gastroenteropancreatische- (GEP-) NET beschreven. De gevonden hogere expressie van SST5 in tumor weefsel in vergelijking met tumor-aangrenzend en met normaal weefsel, en de klinische relatie van SST5 expressie met vasculaire- en zenuw invasie, suggereert dat SST5 een mogelijk doelwit is om agressieve GEP-NET te behandelen. Bovendien kan de evaluatie van het SSTs profiel in GEP-NET aanvullende informatie opleveren die mogelijk gebruikt kan worden bij klinische besluitvorming, waaronder het gebruik van een tweede generatie somatostatine analogen (SSA). De meest nieuwe en relevante bevinding van het onderzoek beschreven in hoofdstuk 4 is de duidelijke overexpressie van GOAT in GEP-NET weefsel. Terwijl de expressie van dit enzym vrijwel afwezig is in bijbehorend normaal weefsel, wordt expressie gevonden in aangrenzend niet-tumor weefsel en is expressie van GOAT met name aanwezig in tumor weefsel. De hogere expressie van GOAT in GEP-NET weefsel werd tevens aangetoond met behulp van immunohistochemie. Hoge expressie van dit enzym was geassocieerd met grotere tumoren en voornamelijk in gastro-intestinale NET. Deze bevindingen, tezamen met eerdere publicaties, suggereren dat GOAT een mogelijke diagnostische biomerker is in GEP-NET. Hoofdstuk 5 beschrijft onderzoek naar de effecten van het geneesmiddel ketoconazol op de groei, cel cyclus, apoptose en afgifte van ACTH of serotonine en chromogranine in respectievelijk een ACTH-producerende long NET cellijn en een niet-ACTH producerende pancreas NET cellijn. Ketoconazol heeft een voornamelijk pro-apoptotisch of cytotoxisch effect, afhankelijk van het type cellijn. Bovendien zorgt behandeling met ketoconazol voor veranderingen in celcyclus, namelijk een toename in G0/G1 fase in beide cellijnen en een afname in G2/M fase in de pancreas NET cellijn. Bovendien tonen de resultaten in hoofdstuk 5 een niet eerder gerapporteerd remmend effect aan van het SSA pasireotide op serotonine afgifte van de pancreas NET cellijn. Dit effect wordt waarschijnlijk gemedieerd via de hoge SST5 expressie in deze cellijn. Het onderzoek in hoofdstuk 6 beschrijft een uitgebreide karakterisering van twee páncreas NET modellen in tweedimensionale (monolayer) en driedimensionale (sferoïden) kweeksystemen, in verschillende kweekmedium condities. Op basis van de resultaten van dit onderzoek wordt geconcludeerd dat een driedimensionaal (sferoïde) kweeksysteem een veelbelovend systeem is om groei en hormoon secretie van NET cellijnen te bestuderen, zelfs onder serum arme kweekcondities. In dit onderzoek wordt tevens aangetoond dat de expressie van SSTs en de dopamine D2 receptor (D2R) verandert tijdens de groei van cellen, zowel in twee- als driedimensionale kweken. De effecten van het somatostatine analoog octreotide, de dopamine agonist cabergoline en van twee nieuwe SSTs-D2R bindende geneesmiddelen (BIM-065 en BIM-23A760) werden onderzocht in de twee kweeksystemen. Cabergoline en de twee SSTs-D2R multi-receptor bindende geneesmiddelen, en niet octreotide, hadden een remmend effect op de afgifte van chromogranine en serotonine, maar niet op de celgroei. De bevindingen suggereren dat het effect van de twee SSTs-D2R bindende geneesmiddelen op de afgifte van hormonen in dit pancreas NET model verloopt via de D2R, en een mogelijke rol voor dopamine agonisten bij de behandeling van D2R-bevattende functionele NET, waaronder het carcinoid syndroom. Hoofdstuk 7 beschrijft onderzoek naar de in vitro effecten van de nieuwe tryptofaan hydroxylase remmer telotristat op pancreas NET cellen. Telotristat remt krachtig en dosisafhankelijk de serotonine afgifte, bij klinisch relevante concentraties. De combinatie met pasireotide, maar niet met octreotide, had een aanvullend remmend effect op de serotonine afgifte. In driedimensionaal gekweekte pancreas NET cellen kon de serotonine afgifte volledig worden geremd door telotristat, maar was er geen effect op de celgroei. Deze resultaten tonen aan dat serotonine in dit pancreas NET model geen autocrien/paracrien effect heeft op de celgroei. Het onderzoek in hoofdstuk 8 toont dat de SSTs expressie in GEP-NET weefsel van patiënten met type 2 diabetes verlaagd is ten opzichte van GEP-NET weefsel van patiënten zonder diabetes. In type 2 diabetes patiënten die behandeld werden met metformine werd deze verlaging in SSTs expressie niet gevonden. In vitro experimenten toonden groei remmende effecten van biguanides en statines aan op NET cellijnen, met een toegenomen apoptose en afgenomen migratie van de cellen. Aangezien metformine en statines commercieel verkrijgbare en relatief goedkope geneesmiddelen zijn en er een langdurige ervaring is in het gebruik ervan, kunnen deze geneesmiddelen mogelijk van aanvullende waarde zijn bij de adjuvante behandeling van patiënten met NET. In hoofdstuk 9 worden de resultaten en conclusies van de studies uit dit proefschrift bediscussieerd in relatie tot huidige en mogelijk nieuwe toekomstige diagnostische en therapeutische mogelijkheden voor patiënten met een NET. Los tumores neuroendocrinos (NETs) son un grupo heterogéneo de neoplasias poco comunes, caracterizadas por un lento crecimiento y que se originan a partir de las células enterocromafines. Su incidencia anual viene aumentando progresivamente, aunque se desconoce si éste incremento es real, el reflejo de mayor uso de (mejores) técnicas diagnósticas o una combinación de ambas. A pesar de que frecuentemente los NETs tienen metástasis al diagnóstico, la supervivencia en estos pacientes ha aumentado, lo cual puede relacionarse con mejoras en las opciones diagnósticas y terapéuticas disponibles. Los NETs requieren métodos diagnósticos estandarizados para asegurar un diagnóstico precoz, así como para monitorizar la progresión de la enfermedad y orientar un tratamiento óptimo. Adicionalmente, el número y la calidad de las opciones terapéuticas se ha incrementado en los últimos años. En este sentido, esta tesis evalúa algunas nuevas opciones diagnósticas y terapéuticas para pacientes con NETs. El capítulo 1 ofrece una visión general sobre los NETs, y se centra en la utilidad/ limitaciones de los biomarcadores actualmente disponibles, así como en la descripción de algunos nuevos (posibles) marcadores en NETs. Además, resume opciones terapéuticas para tumores neuroendocrinos funcionantes y no funcionantes, tanto aquellas nuevas como las actualmente disponibles. Este capítulo representa la introducción al contenido fundamental de esta tesis: nuevos marcadores diagnósticos y opciones terapéuticas en NETs. El capítulo 1 termina con una visión general de los objetivos generales de esta tesis. El capítulo 2 evalúa detalladamente la expresión de algunos componentes de los sistemas somatostatina/cortistatina y ghrelina en una seria amplia, bien caracterizada, de carcinoides pulmonares típicos y atípicos. Hasta donde sabemos, este estudio representa la primera caracterización sistemática de los componentes de estos sistemas reguladores en muestras de carcinoides pulmonares (LCs), tejido adyacente no tumoral y pulmón sano. En este estudio, la expresión de somatostatina, de algunos de sus receptores (SSTs) y del receptor de ghrelina se incrementó gradualmente en el tejido no tumoral adyacente y en el tejido tumoral en comparación a pulmón normal. Además, la presencia de isoformas truncadas SST5TMD4, In1-ghrelin y el receptor de ghrelina GHSR1b fue reportada por primera vez en LCs. Asimismo, una expresión aumentada de la enzima ghrelin-O-aciltransferasa (GOAT) se observó en tumores con necrosis, los cuales (a su vez) fueron aquellos con mayor tamaño, mayor capacidad de invasión y de producir metástasis a distancia. Estos datos sugieren que una desregulación del sistema ghrelina puede estar involucrada en el desarrollo/progresión de estos tumores. El capítulo 3 discute específicamente la expresión de componentes de los sistemas somatostatina/ cortistatina en tumorres gastroenteropancreáticos (GEP-NETs). La sobre-expresión observada de SST5 en el tejido tumoral comparado con el tejido adyacente no tumoral y el control sano, así como su relación clínica con la invasión vascular y nerviosa del tumor, sugieren un probable rol de SST5 como diana terapéutica en GEP-NETs agresivos, además, enfatiza la importancia de evaluar el perfil de SSTs en GEP-NETs, el cual aportaría información adicional para la toma de decisiones terapéuticas, incluida la utilización de análogos de somatostatina (SSAs) de segunda generación. El hallazgo más novedoso y relevante del capítulo 4 es la marcada sobre-expresión de la enzima GOAT en muestras de GEP-NETs. Específicamente, cuando la expresión de esta enzima es prácticamente ausente en tejido normal, su expresión se observó en tejido adyacente no tumoral y se sobre-expresó en tejido tumoral, una sobre-expresión que fue confirmada utilizando inmunohistoquímica. Asimismo, esta enzima se asoció con tumores de mayor tamaño, especialmente en NETs gastrointestinales. Estos hallazgos, combinados con publicaciones previas, sugieren el posible papel de la enzima GOAT como un biomarcador en NETs. El capítulo 5 describe los efectos de ketoconazol en la proliferación, ciclo celular, apoptosis, secreción de adrenocorticotropina (ACTH) o serotonina y cromogranina en una línea celular de NET bronquial productora de ACTH y una línea celular de NET pancreático no productora de ACTH. Específicamente, ketoconazol mostró características predominantemente pro-apoptóticas o citotóxicas dependiendo de la línea celular; estos efectos se mantuvieron a pesar de la combinación con SSAs. Además, ketoconazol fue capaz de inducir cambios en el ciclo celular, específicamente el aumento de las fases G0/G1 en ambas líneas celulares y una disminución de las fases G2/M en la línea celular pancreática. Incluso se observó un efecto inhibitorio en la secreción de serotonina del análogo de somatostatina pasireotide en la línea celular pancreática, el cual no había sido previamente descrito y que probablemente se debe a la expresión de SST5 en esta línea celular. En el capítulo 6 se caracteriza de forma detallada un modelo de líneas celulares pancreáticas utilizando sistemas de cultivo en dos- (2D; monolayer) y tres- dimensiones (3D; esferoides) en diferentes condiciones de nutrientes. Al analizar los resultados, se observa que los cultivos en 3D con esferoides representan un método valioso para evaluar la secreción y proliferación celular en líneas celulares de NETs, incluso en condiciones con deprivación de suero. Se observó una expresión dinámica de los SSTs y receptor de dopamina (D2R) en los sistemas de cultivo en 2D y 3D, lo cual no se había descrito previamente. En este capítulo, los efectos del análogo de somatostatina octreotide y el agonista de dopamina cabergolina, así como de los nuevos fármacos quimera SSTs-D2R (BIM-065, BIM-23A760) se evaluaron en ambos modelos de cultivo. El tratamiento con cabergolina y ambas quimeras inhibió la secreción de cromogranina A y serotonina, pero no la proliferación celular. Esto sugiere que el efecto de las quimeras en la secreción parece estar mediado por el D2R, sugiriendo un posible papel de los agonistas de cabergolina para el tratamiento de NETs funcionantes, incluido el síndrome carcinoide siempre y cuando expresen D2R. El capítulo 7 muestra los efectos in vitro de telotristat etiprate, un nuevo inhibidor de la enzima hidroxilasa de triptófano en líneas celulares pancreáticas. Este fármaco mostró un potente efecto en la inhibición de la secreción de serotonina, el cual fue dependiente de dosis en un modelo de células pancreáticas de NETs. Su combinación con pasireotide, pero no con octreotide, tuvo un efecto aditivo en el control de la secreción de serotonina. En el modelo 3D de NET pancreático, la secreción de serotonina fue totalmente inhibida por telotristat, sin embargo, este bloqueo no produjo cambios en el crecimiento celular. Estos datos sugieren que la serotonina no ejerce un efecto autocrino/paracrino en la proliferación celular en este modelo 3D de NET pancreático. En el capítulo 8 se observó una expresión disminuida de SSTs en pacientes con diabetes tipo 2 y GEP-NETs comparado con pacientes con GEP-NETs pero sin diabetes. Esta expresión disminuida no se observó cuando los pacientes diabéticos fueron tratados con metformina. Los estudios in vitro demostraron el efecto anti-proliferativo de las biguanidas y estatinas en líneas celulares de NETs, con el consiguiebnte incremento de la apoptosis y disminución de la migración celular. Puesto que la metformina y las estatinas son fármacos comercialmente disponibles, económicos y con una amplia experiencia en su uso, nuestros resultados sugieren que estos fármacos podrían representar una opción terapéutica factible como terapia adyuvante en NETs. Finalmente, en el capítulo 9 se discuten los resultados y conclusiones de los estudios presentados en esta tesis, especialmente en relación a las modalidades diagnósticas y opciones terapéuticas, tanto actuales como futuras, para los pacientes con NETs.

Diabetic retinopathy; Brimonidine; Vascular dilation Retinopatia diabètica; Brimonidina; Dilatació vascular Retinopatía diabética; Brimonidina; Dilatación vascular Structural retinal microvascular changes have been identified as risk markers of diabetic retinopathy (DR). In order to estimate the retinal response of neuroprotective eye drops, we aimed to evaluate the effect of topical retinal neuroprotection on retinal microvascular changes in early DR. METHODS: Patients with type 2 diabetes with no or early DR were randomized 1:1:1 to topical treatment with placebo, brimonidine, or somatostatin in a 96-week prospective, phase II to III, European multicenter trial. Retinal vascular calibers were measured semiautomatically in digital fundus images by certified graders at baseline and follow-up and summarized as central retinal arteriolar and venular equivalent (CRAE and CRVE). RESULTS: Of 449 patients originally included, 297 completed the study with gradable retinal images. Median age and duration of diabetes was 64.5 and 9.9 years, and 65.7% were male. At baseline, Early Treatment Diabetic Retinopathy Study levels were 10 (no DR, 42.8%), 20 (minimal DR, 28.3%), and 35 (mild DR, 29.0%), and CRAE and CRVE did not differ between groups. As opposed to patients with no or minimal DR at baseline, patients with mild DR in the active groups developed a larger retinal arteriolar (brimonidine: +6.2 μm, P = 0.006; somatostatin: +7.2 μm, P = 0.006) and venular (brimonidine: +13.9 μm, P = 0.01; somatostatin: +14.3 μm, P = 0.0001) caliber in contrast to those in the placebo group. CONCLUSIONS: Topical treatment with brimonidine and somatostatin causes retinal arteriolar and venular dilation in patients with type 2 diabetes and preexisting early DR. Upcoming studies should elaborate on the potential of these findings in arresting early DR.

Memoria de Trabajo fin de Máster presentada por Cesar Redondo Alañon, para obtener el Máster en Neurociencia por la Universidad Autónoma de Madrid (UAM), realizada bajo la dirección de Pablo Méndez García.-- 53 páginas., El hipocampo interviene en procesos de orientación espacial y procesamiento emocional, además de estar especialmente relacionado con la memoria y el aprendizaje. Para estudiar estos procesos usamos un paradigma de condicionamiento de aversión al contexto. En este, los animales asocian un contexto neutro con un estímulo aversivo, mostrando una respuesta condicionada a este contexto. Primero investigamos diferentes aspectos de la conducta en este paradigma, para conocer cómo reflejaban el aprendizaje llevado a cabo. Después nos centramos en la extinción característica del condicionamiento clásico. Para ello, utilizamos farmacogenética para silenciar la actividad de neuronas inhibitorias hipocampales genéticamente definidas (Parvalbúmina o Somatostatina positivas) y esclarecer el papel de la su actividad inhibitoria en la extinción de la memoria contextual. Además, medimos la actividad neuronal, analizada con c-Fos, para ver cómo se relacionaban cambios en la actividad neuronal, en distintas áreas cerebrales, con el proceso de extinción.

The aim of this study was to identify and evaluate gamma (PP) and delta cells in alpaca pancreas by immunohistochemistry (IHC). Samples were obtained from 30 alpacas from the southern highlands of Peru (crías, juveniles and adults). Histological sections of 5 μm thickness (3 per lobe and 2 of the body) were used. A commercial kit of IHC and polyclonal antibodies (anti-PP and anti-SSTR3) were used to identify PP and delta cells. Rat pancreas samples were used as positive controls. The intensity of the marking was qualitatively classified between 0 (no marking) and 3 (strong marking). PP cells were present in all age groups, mainly in the body and right lobe of the pancreas, being observed mainly in the periphery and intermediate zone of the islets with a medium and strong marking. Delta cells were present in both lobes until 4 months of age, without being observed in juveniles or adults. Delta cells were observed mainly on the periphery of the islets with a light marking., El estudio tuvo por finalidad identificar y evaluar las células gamma (PP) y delta en páncreas de alpacas mediante inmunohistoquímica (IHQ). Las muestras se obtuvieron de 30 alpacas de la sierra sur del Perú (crías, jóvenes y adultas). Se utilizaron cortes histológicos de 5 μm de espesor (3 por lóbulo y 2 del cuerpo). Se usó un kit comercial de IHQ y anticuerpos policlonales (anti-PP y anti-SSTR3) para identificar las células PP y delta, así como muestras de páncreas de rata como controles positivos. La intensidad de la marcación se clasificó cualitativamente entre 0 (sin marcación) hasta 3 (marcación fuerte). Las células PP estaban presentes en todos los grupos etarios, principalmente en el cuerpo y lóbulo derecho del páncreas, observándose principalmente en la periferia y zona intermedia de los islotes con una marcación media y fuerte. Las células delta estaban presentes en ambos lóbulos hasta los 4 meses de edad, sin observarse en juveniles ni en adultos. Las células delta se observaron principalmente en la periferia de los islotes con una marcación leve.

El estudio tuvo por finalidad identificar y evaluar las células gamma (PP) y delta en páncreas de alpacas mediante inmunohistoquímica (IHQ). Las muestras se obtuvieron de 30 alpacas de la sierra sur del Perú (crías, jóvenes y adultas). Se utilizaron cortes histológicos de 5 µm de espesor (3 por lóbulo y 2 del cuerpo). Se usó un kit comercial de IHQ y anticuerpos policlonales (anti-PP y anti-SSTR3) para identificar las células PP y delta, así como muestras de páncreas de rata como controles positivos. La intensidad de la marcación se clasificó cualitativamente entre 0 (sin marcación) hasta 3 (marcación fuerte). Las células PP estaban presentes en todos los grupos etarios, principalmente en el cuerpo y lóbulo derecho del páncreas, observándose principalmente en la periferia y zona intermedia de los islotes con una marcación media y fuerte. Las células delta estaban presentes en ambos lóbulos hasta los 4 meses de edad, sin observarse en juveniles ni en adultos. Las células delta se observaron principalmente en la periferia de los islotes con una marcación leve. The aim of this study was to identify and evaluate gamma (PP) and delta cells in alpaca pancreas by immunohistochemistry (IHC). Samples were obtained from 30 alpacas from the southern highlands of Peru (crías, juveniles and adults). Histological sections of 5 µm thickness (3 per lobe and 2 of the body) were used. A commercial kit of IHC and polyclonal antibodies (anti-PP and anti-SSTR3) were used to identify PP and delta cells. Rat pancreas samples were used as positive controls. The intensity of the marking was qualitatively classified between 0 (no marking) and 3 (strong marking). PP cells were present in all age groups, mainly in the body and right lobe of the pancreas, being observed mainly in the periphery and intermediate zone of the islets with a medium and strong marking. Delta cells were present in both lobes until 4 months of age, without being observed in juveniles or adults. Delta cells were observed mainly on the periphery of the islets with a light marking.

[eng] Somatostatin (SST or SRIF14) is a peptidic hormone secreted throughout the central nervous system and in the gastrointestinal tract which has anti-secretory, anti-proliferative and anti-angiogenic effects. Although its administration as a drug is effective in certain conditions, its therapeutic use is limited by its short plasma half-life (< 3 min), the broad spectrum of biological responses and the lack of selectivity over its receptors (SSTRs). In order to obtain more stable and selective analogues we have incorporated both non-natural electron-rich and electron-poor aromatic amino acids at key positions of the native sequence to overcome the above-mentioned drawbacks. In this regard, we have obtained different analogues which have been studied by NMR obtaining the structures of the major set of conformations. Their binding profile and half-lives have also been determined. Among all the analogues, one stood out due to its half-life of around 40 h, the highest one known for a SRIF14 analogue. Furthermore, it displayed a major set of conformations in solution and high selectivity towards SSTR2. In recent years, receptor-targeted cancer therapy has gained interest as certain receptors are overexpressed in cancer cells. This is the case of SSTRs in endocrine tumours. On this subject, we have coupled different molecules at the N-terminal part of the previously mentioned analogue. The first one was a chromophore which enabled us to follow the internalisation of the analogue inside CHO-K1 wild type (WT) and CHO-K1 SSTR2-overexpressing (ST) cell lines which turned to be far more better in ST than in WT. In light of these findings, we decided to go one step further and test this analogue as a drug delivery system thus coupling it to a colour-changing chromophore (green: bonded to the peptide, blue: when released). As before, both the internalisation and the drug release was better in ST than in WT. Last step was to test the analogue as a p38α inhibitor by coupling the inhibitor directly at the N-terminal part. As for the other assays, the inhibition of p-Hsp27 (p38α downstream target) was better in ST than in WT which was attributed to a better internalisation of the analogue., [spa] La somatostatina (SST o SRIF14) es una hormona peptídica secretada por el sistema nervioso central y el tracto gastrointestinal que tiene efectos anti-secretores, anti-proliferativos y anti-angiogénicos. Aunque su administración como fármaco es eficaz en ciertas condiciones, su uso terapéutico está limitado por su corta vida media plasmática (

Chimeric somatostatin/dopamine compounds such as BIM-23A760, an sst2/sst5/D2 receptors-agonist, have emerged as promising new approaches to treat pituitary adenomas. However, information on direct in vitro effects of BIM-23A760 in normal and tumoral pituitaries remains incomplete. The objective of this study was to analyze BIM-23A760 effects on functional parameters (Ca2+ signaling, hormone expression/secretion, cell viability and apoptosis) in pituitary adenomas (n = 74), and to compare with the responses of normal primate and human pituitaries (n = 3–5). Primate and human normal pituitaries exhibited similar sst2/sst5/D2 expression patterns, wherein BIM-23A760 inhibited the expression/secretion of several pituitary hormones (specially GH/PRL), which was accompanied by increased sst2/sst5/D2 expression in primates and decreased Ca2+ concentration in human cells. In tumoral pituitaries, BIM-23A760 also inhibited Ca2+ concentration, hormone secretion/expression and proliferation. However, BIM-23A760 elicited stimulatory effects in a subset of GHomas, ACTHomas and NFPAs in terms of Ca2+ signaling and/or hormone secretion, which was associated with the relative somatostatin/dopamine-receptors levels, especially sst5 and sst5TMD4. The chimeric sst2/sst5/D2 compound BIM-23A760 affects multiple, clinically relevant parameters on pituitary adenomas and may represent a valuable therapeutic tool. The relative ssts/D2 expression profile, particularly sst5 and/or sst5TMD4 levels, might represent useful molecular markers to predict the ultimate response of pituitary adenomas to BIM-23A760., This work has been funded by the following grants: Junta de Andalucía (BIO-0139, CTS-1406, PI-639-2012); Ministerio de Economía y Competitividad, Gobierno de España (BFU2013-43282) ; Proyectos de Investigación en Salud FIS, funded by Instituto de Salud Carlos III (PI13-00651, co-funded by ERDF/ESF, “Investing in your future”); Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad ‘CIBERobn’; and Ayuda Merck Serono 2013 (to RML and JPC). Department of Veterans Affairs, Veterans Health Administration, Office of Research and Development Merit Award and the National Institutes of Health: R21AG031465 and R01DK088133 (to RDK).

El cáncer es una de las amenazas más serias y complejas para la salud de la población mundial1. En concreto, el cáncer de próstata es el segundo tipo de tumor solido más frecuente entre los hombres, y causa 300.000 muertes al año en todo el mundo1. Desde su aparición en la década de los 90, el test del PSA (“antígeno prostático específico”) revolucionó el diagnóstico del cáncer de próstata, incrementado el número de pacientes diagnosticados en una fase temprana de la enfermedad 1,2. Sin embargo, debido a la compleja biología y heterogeneidad de los tumores prostáticos, la mayoría de los tumores detectados por el test del PSA presentan una baja agresividad y la probabilidad de que el paciente muera debido a su desarrollo también es relativamente baja 2-4. Desafortunadamente, el tratamiento de tumores de “baja agresividad” puede producir por sí mismo más efectos secundarios que el propio tumor2. Además, debido a que el PSA se puede elevar por causas benignas (prostatitis, toma de medicamentos, etc) presenta un elevada proporción de falsos positivos2. Aunque se están estudiando en la actualidad otros biomarcadores, ninguno de ellos ha mostrado evidencia clínica suficiente como para justificar su uso y, por tanto, se requieren nuevos biomarcadores que complementen y/o mejoren el uso del test de PSA2,5. El cáncer de próstata depende de la estimulación androgénica para su supervivencia y proliferación celular6. En la clínica del cáncer de próstata se pueden diferenciar dos fases: una primera fase en la cual los pacientes se tratan hormonalmente con el objetivo de bloquear la producción de andrógenos mediante anti-andrógenos o con análogos o antagonistas de LHRH7, y una segunda fase conocida como “cáncer de próstata resistente a la castración” (en inglés CRPC “Castration-Resistant Prostate Cancer”), en la cual los tumores se vuelven resistentes a la terapia hormonal6. Actualmente se concede un papel vital a los andrógenos residuales tras la castración y al receptor de andrógenos en la biología del CRPC8,9. De hecho, la aparición de formas truncadas de splicing aberrante del receptor de andrógeno (AR-V7) es uno de los fenómenos más importantes de esta fase, y actualmente, su presencia se considera como un marcador de prognosis e indicador de resistencia a la terapia hormonal10-12. Numerosos neuropéptidos, como los pertenecientes a la familia de factores reguladores del eje hipotálamo-hipofisario, desempeñan multitud de funciones en diversos tejidos bajo condiciones normales o en situaciones patológicas, como el cáncer. Una característica común de muchas de estas situaciones endocrino-metabólicas es la presencia atípica/ectópica, la alteración y/o la pérdida total/parcial de moléculas que, como los neuropéptidos y sus receptores, pueden controlar la función de estas células. De hecho, numerosos estudios indican que los procesos de splicing alternativo, y en particular la aparición de formas de splicing no canónico o aberrante, contribuyen al desarrollo de las patologías tumorales, y en muchos casos son potenciales biomarcadores de la enfermedad, como es el caso de las variantes del receptor de andrógeno en cáncer de próstata. En este sentido, el objetivo de la tesis doctoral se ha centrado en estudiar la presencia y el papel funcional que ejercen dos sistemas pleiotrópicos de control del organismo; en concreto, el sistema formado por la somatostatina (SST), la cortistatina (CORT) y receptores (sst1-5), incluyendo las variantes de splicing sst5TMD4/5, y el sistema de la ghrelina y sus receptores (GHSR1a/b), que incluye la variante de splicing In1-ghrelina, y la enzima GOAT, en muestras humanas de próstata sana y de cáncer de próstata. Asimismo, se evaluó la utilidad de algunas de estas moléculas como nuevos biomarcadores de diagnosis y/o prognosis de la enfermedad, y su potencial terapéutico en cáncer de próstata. 2. Contenido de la investigación El análisis inicial mediante la técnica de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de la expresión de los sistemas somatostatina y ghrelina demostró una profunda desregulación de algunos de los componentes de ambos sistemas en cáncer de próstata. Concretamente, se encontró que los receptores sst1 y sst5TMD4 del sistema somatostatina, y la enzima GOAT y la forma de splicing alternativo In1-ghrelina del sistema ghrelina, se encuentran significativamente sobreexpresados en tejidos tumorales prostáticos. La sobreexpresión del receptor sst1 ha sido previamente publicada y se relaciona con la agresividad de la enfermedad13. Por el contrario, nuestros resultados son los primeros que demuestran la sobreexpresión de sst5TMD4, In1-ghrelina y GOAT en cáncer de próstata. La sobreexpresión del receptor truncado sst5TMD4 fue especialmente significativa en los pacientes con presencia de metástasis y con peor prognosis, pudiendo ser por ello un nuevo biomarcador de agresividad. Este resultado fue descubierto inicialmente con la técnica de qPCR y se corroboró después a nivel proteico en otra cohorte de pacientes mediante la técnica de inmunohistoquimica (IHQ). Posteriormente, se analizaron las consecuencias que podría ejercer la sobreexpresión de sst5TMD4 en cáncer de próstata. Para ello, se usaron modelos in vitro (líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-dependientes y líneas resistentes a la castración) e in vivo (xenotransplantes en ratones inmunodeprimidos) para demostrar que la sobreexpresión de sst5TMD4 incrementa claramente la malignidad de las células prostáticas tumorales (ej. proliferación y migración celular) y que dichos efectos se llevaban a cabo a través de la modulación de diversas vías de señalización celular claves en la biología del cáncer de próstata (ej. MAPK/ERK, MAPK/JNK, MYC/MAX, WNT, RB y TGF-β14), y de la desregulación de la expresión de oncogenes (ej. CAV1, IL-6) y genes supresores de tumores (ej. CDKN2A, APC, SFRP1, NRIP1, RARB, LOXL1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de sst5TMD4 en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de sst5TMD4 mediante el diseño, validación y utilización de un siRNA (“ARN pequeño de interferencia”) específico para la secuencia de sst5TMD4. El silenciamiento disminuyó la proliferación y migración celular de las células en comparación con células control. Por su parte, la expresión de la enzima GOAT se encontró incrementada en muestras tumorales prostáticas respecto a controles, y dicha expresión se correlacionó con parámetros metabólicos de los pacientes tales como el peso, su índice de masa corporal (IMC) o la presencia de dislipidemia. Este resultado se corroboró a nivel proteico, mediante IHQ, con un anticuerpo específico de GOAT. La sobreexpresión de GOAT se observó también al comparar líneas celulares de cáncer de próstata respecto a líneas celulares de próstata normal. Además, por primera vez se demostró que las células prostáticas tumorales son capaces de secretar enzima GOAT y que el tratamiento con diferentes señales metabólicas (ej. insulina, IGF-1, ghrelina y/o In1-ghrelina) regulan su expresión en la próstata. Mediante un ELISA específico se descubrió que los niveles de esta enzima están aumentados en el plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata respecto a controles y que se correlacionan con factores de agresividad de la enfermedad, así como con diferentes parámetros metabólicos, tales como la presencia de diabetes y dislipidemia. Además, demostramos que los niveles plasmáticos de GOAT podrían servir como un nuevo biomarcador no invasivo para el diagnóstico del cáncer de próstata, especialmente en pacientes no diabéticos en los que la sensibilidad y especificidad de los niveles plasmáticos de GOAT para detectar la enfermedad son particularmente elevadas. Asimismo, nuestros resultados demuestran que la expresión de In1-ghrelina, pero no ghrelina nativa, se encuentran significativamente elevados en muestras de tejido y en líneas celulares de cáncer de próstata, así como en muestras de plasma y orina de pacientes con cáncer de próstata en comparación con muestras de tejido normal o de pacientes sanos. Dado que tanto In1-ghrelina como ghrelina nativa se expresaba en tejido sano prostático, investigamos el posible papel funcional que ambas moléculas podrían presentar en la regulación de la función prostática. Para ello se realizaron cultivos celulares de células prostáticas no tumorales, que se trataron con los péptidos acilados de In1-ghrelina o ghrelina nativa. Resultó interesante observar que el tratamiento con los péptidos de la In1-ghrelina, pero no con ghrelina aumenta la expresión (mRNA) y secreción (proteína) de PSA. Además, la sobreexpresión de In1-ghrelina, pero no de ghrelina, aumentó la proliferación de las células prostáticas sanas. Posteriormente analizamos el papel patofisiológico de la sobreexpresión de In1-ghrelina en cáncer de próstata. Para ello, utilizamos diferentes líneas celulares de cáncer de próstata que representan el amplio espectro de la enfermedad. Tanto el tratamiento con péptidos In1-ghrelina como la transfección con un vector de expresión de In1-ghrelina aumentó la proliferación y migración celular de las diferentes líneas celulares de cáncer de próstata. Más aún, este resultado se corroboró en un modelo preclínico in vivo de xenotransplante en ratones inmunodeprimidos. Se comprobó que los efectos patológicos de la In1-ghrelina se llevaban a cabo a través de la modulación de la actividad de la vía de las quinasas ERK, de un aumento de expresión de ciertos oncogenes (ej. CAV1, CAV2, IGFBP-5, LOXL1) y por una disminución de determinados genes supresores tumorales (ej. APC, SFRP1, NRIP1). Finalmente, y con el objetivo de demostrar el potencial terapéutico de In1-ghrelina en cáncer de próstata, se silenció la expresión endógena de In1-ghrelina mediante el diseño, validación y aplicación de dos siRNAs (“ARN pequeño de interferencia”) específicos para la secuencia de In1-ghrelina en varias líneas celulares de cáncer de próstata; dicho silenciamiento disminuyó la proliferación celular y la secreción de PSA de esas células en comparación con células control. 3. Conclusiones Por todo ello, los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral sobre la regulación de la expresión y el papel patofisiológico de las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y de la enzima GOAT en el contexto del cáncer de próstata, refuerzan la relevancia de los sistemas somatostatina y ghrelina, especialmente de sus formas de splicing alternativo, en el desarrollo y progresión tumoral del cáncer de próstata. Específicamente, nuestros hallazgos demuestran que las variantes de splicing sst5TMD4 e In1-ghrelina y la enzima GOAT están sobreexpresadas en cáncer de próstata, donde inducen importantes alteraciones relacionadas con la agresividad tumoral. Por tanto, estas moléculas podrían servir como nuevos biomarcadores de diagnóstico y/o pronóstico y podrían representar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata.