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Peptide-based biopolymers represent highly promising biocompatible materials with multiple applications, such as tailored drug delivery, tissue engineering and regeneration, and as stimuli-responsive materials. Herein, we report the pH- and concentration-dependent self-assembly and conformational transformation of the newly synthesized octapeptide PEP-1. At pH 7.4, PEP-1 forms β-sheet-rich secondary structures into fractal-like morphologies, as verified by circular dichroism (CD), Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy, thioflavin T (ThT) fluorescence spectroscopy assay, and atomic force microscopy (AFM). Upon changing the pH value (using pH 5.5 and 13.0), PEP-1 forms different types of secondary structures and resulting morphologies due to electrostatic repulsion between charged amino acids. PEP-1 can also form helical or random-coil secondary structures at a relatively low concentration. The obtained pH-sensitive self-assembly behavior of the target octapeptide is expected to contribute to the development of novel drug nanocarrier assemblies. Biopolymere auf Peptidbasis stellen vielversprechende biokompatible Materialien mit vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten dar, wie z.B. maßgeschneiderte Drug-Delivery, Tissue Engineering und Regeneration sowie als auf Stimuli reagierende Materialien. Hier berichten wir über die pH- und konzentrationsabhängige Selbstassemblierung und Konformationstransformation des neu synthetisierten Oktapeptids PEP-1. Bei pH 7,4 bildet PEP-1β-blattreiche Sekundärstrukturen in fraktalähnliche Morphologien, verifiziert durch Zirkulardichroismus, Fourier-Transformation Infrarot-Spektroskopie, Thioflavin T (ThT)-Fluoreszenzspektroskopie-Assay und Rasterkraftmikroskopie. Beim Wechsel der pH-Wert (von pH 5,5 und 13,0) bildet PEP-1 aufgrund der elektrostatischen Abstoßung zwischen geladenen Aminosäuren verschiedene Arten von Sekundärstrukturen und daraus resultierende Morphologien. PEP-1 bildet auch helikale oder Random-Coil-Sekundärstrukturen bei relativ niedrigen Konzentration. Es wird erwartet, dass das erzielte pH-empfindliche Selbstassemblierungsverhalten des Zieloktapeptids zur Entwicklung neuartiger Wirkstoff-Nanocarrier-Baugruppen beitragen wird.

The visualization of a protein is hardly imaginable without secondary structure elements (SSEs). But SSEs play a by far more important role in the field of chemical biology, apart from the creation of fancy protein images. They are essential in structure-based analyses due to their impact on secondary structure prediction and structural protein alignment. However, their proper classification is a challenging issue. There are more than 30 tools available that underline the subjective character of the classification of SSEs. But only two tools have dominated this field of research for decades. Why is that? What are the advantages of hydrogen bond-based methods, despite the fact that they are often unable to assign left-handed helices, PPI-helices, or bent structures? We have developed SCOT, a novel multipurpose software that incorporates the benefits of a multitude of approaches for the classification of helices, strands, and turns in proteins. To our knowledge, it is the very first method that not only captures a variety of rare and basic SSEs (rightand left-handed a-, 310-, 2.27-, plus right-handed p-helices, PPII helices, and b-sheets) in protein structures, but also their irregularities in a single step, and provides proper output and visualization options. SCOT combines the benefits of geometry-based and hydrogen bond-based methods by using hydrogen bond and geometric information to gain insights into the structural space of proteins. Its dual character enables robust classifications of SSEs without major influence on the geometric regularity of the assigned SSEs. In consequence, it is perfectly suited to automatically assign SSEs for subsequent helix- and strand-based protein alignments with methods such as LOCK2. This is especially supported by our elaborate kink detection. All of these benefits are clearly demonstrated by our results. Together with the easy to use visualization of assignments by the means of PyMOL scripts, SCOT enables a comprehensive analysis of regular backbone geometries in protein structures. The high number of available secondary structure assignment methods (SSAMs) hampers a straight forward selection of the most suitable one for a certain application. In addition, relying on the most frequently cited tool must not necessarily result in an optimal choice. Thus, we have developed SNOT to fill the gap of a tool that provides a multitude of objective and rational criteria for the comparison and evaluation of different SSAMs. It provides exhaustive information on geometrical parameters, residue statistics, the consistency with respect to protein flexibility and quality, SSE overlaps and sequence coverage, and the consent of two classifications. We used SNOT to compare SCOT to DSSP, STRIDE, ASSP, SEGNO, DISICL, and SHAFT. The results point toward SCOT’s unique features as a solitary multipurpose SSAM with optimal performance for numerous challenges: the support of commonly observed and rare SSEs, the comprehensive assignment of turn types, the elaborate kink detection, the geometric consistency of the SSEs, the robustness with respect to structure quality and protein flexibility, and its superior suitability for SSE-based protein structure alignments. Our analyses of alternative p- and PPII-helix assignments indicate challenges which we try to address with our methodology. There are also hints toward a correlation between the SSEs of a protein and its function. Koch and Waldmann proposed that similar arrangements of SSEs in the neighborhood of a ligand binding site (ligand-sensing cores) can recognize similar scaffolds in disregard of the overall fold. We have developed SLOT to discover these unrevealed similarities which are solely based on SSEs. Its graph-based methodology is able to mimic the geometry of SSEs by using a flexible multi-point representation instead of a straight vector. These points are used to capture the geometry of a protein, i.e., the arrangement of SSEs, in distance matrices. This unique representation enables the comparison of protein structures regardless of their SSEs’ directions or SSE sequence. An optimized algorithm to determine the MCS of two given graphs is used to calculate their structural similarity and to ensure fast runtimes. What sets SLOT further apart from its 40 competitors is that it can be used with any external secondary structure classification. Our exhaustive evaluation highlights the benefits of SCOT for the use with SLOT and also covers our optimizations of the comparison algorithm. It additionally questions the applicability of the concept of ligand-sensing cores. In the end, SCOT, SNOT, and SLOT were the beacons on our journey to answer the question: Are there similar ligand-sensing cores or undiscovered structural similarities solely based on SSEs?

Unter den in der Natur üblichen Kettenmolekülen fallen Lassopeptide mit ihrer räumlichen Struktur aus der Rolle. Sie weisen eine cyclische Anordnung auf, die räumlich einem Lasso gleicht und in der Biosynthese unter Verwendung von Enzymen ausgebildet wird. Die Synthese solcher Strukturen stellt eine große Herausforderung in der organisch-synthetischen Chemie dar und konnte bis heute nicht erfolgreich durchgeführt werden. Um die Energiebarriere dieses Cyclisierungsprozesses zu verringern und das Verhältnis zwischen Ring und Kette im Gleichgewicht zu analysieren wurde die Cyclisierung reversibel gestaltet. Dies erfolgte mittels der Substitution einer Amidbindung durch eine Imin- oder Oxim-Bindung, welche die irreversible Macrocyclisierung eines Peptids in einen reversiblen Prozess transformiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioorthogonale Synthesemethoden für C terminale und Seitenketten-Peptidaldehyde entwickelt und die Cyclisierungstendenz dieser Peptide sowie die räumliche Anordnung der im Gleichgewicht entstehenden Produkte mittels NMR-Spektroskopie in wässriger Lösung untersucht. Mittels NMR-basierter, molekularer Modellierung wurden die Peptide analysiert und entsprechende Strukturen berechnet. Die Cyclisierungstendenz von C-terminalen Peptidaldehyden wurde im Rahmen des cyclischen Hexapeptids Segetalin A NMR-spektroskopisch untersucht und entgegen der erwarteten Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung eine Seitenketten-Cyclisierung über das NH-Indol des Tryptophans beobachtet. Neben Segetalin A wurden weitere cyclische Hexapeptide reversibel cyclisiert und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Im Gegensatz zur Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung musste für die Kopf-zu-Seitenketten-Cyclisierung neue in der Festphasensynthese einsetzbare Bausteine entwickelt und im Multigramm-Maßstab synthetisiert werden. Für die reversible Cyclisierung von Peptidaldehyden über die Seitenkette der Glutaminsäure wurden zwei verschiedene Synthesemethoden durchgeführt und untersucht. Im Rahmen der ersten Syntheseroute, die auf einem Precursor-basierten Ansatz beruht, wurde eine Synthese der unnatürlichen Aminosäure Homoallylglycin und dessen Derivate entwickelt und die oxidative Spaltung des terminalen Olefins zum Aldehyd analysiert. Der zweite Syntheseweg beinhaltete die Synthese eines Seitenketten-Dipeptids, bestehend aus Glutaminsäure und einem geschützten Glycinaldehyd oder einem Glycinaldehyd-Precursor in der Seitenkette. Dies vereinfachte die Synthese der Aldehyd-Aminosäuren erheblich, führte zu höheren Gesamtausbeuten und ergab ein im Multigramm-Maßstab herstellbares, stabiles Aminosäure-Derivat. Die Insertion der synthetischen Aminosäure in Peptide erfolgte mittels manueller und automatisierter Festphasenpeptidsynthese. Sämtliche, auf diese Art hergestellten, Seitenketten-Peptidaldehyde wurden auf ihre Cyclisierungstendenz in wässrigem Phosphatpuffer mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Die Einstellung des chemischen Gleichgewichts erfolgte bei pH 6.5 in wässrigem Phosphatpuffer, wodurch ein schneller H/D-Austausch stattfand und die NMR-Spektren basierend auf der Signalverbreiterung eine geringe Qualität aufwiesen. Durch reduktive Aminierung wurde die Gleichgewichtsreaktion abgefangen und es konnte gezeigt werden, dass alleine durch intramolekulare Wechselwirkungen keine Lasso-Topologie ähnlich dem Naturstoff erhalten wurde, sondern ausschließlich das cyclisch-verzweigte Peptid. Aufgrund der nicht ausreichenden Vorfaltung innerhalb des linearen Lassopeptids wurde mit Hilfe einer Disulfidbrücke das C-terminale Ende kovalent an das Rückgrat gebunden, sodass eine mögliche Macrolactamisierung des N-terminalen Rings zu einem korrekt eingefädelten Lassopeptid führen sollte. In diesem Fall wurde erneut kein topologisch korrektes Lassopeptid erhalten. Es wurde für die reversible Cyclisierung des N-terminalen Rings eine weitere Disulfidbrücke eingeführt, die die Amidbindung ersetzt, aber die native Ringgröße nicht verändert. Durch orthogonal geschützte Cysteine, die flexibel in der Primärsequenz substituiert wurden, konnten unterschiedliche Disulfidmuster synthetisiert und analysiert werden. Die synthetisierten Di- und Tetrasulfide, welche die höchste Analogie zum nativen Microcin J25 aufwiesen, wurden auf ihre biologische Aktivität untersucht. Unter Zugabe der synthetischen Peptide wurden Wachstumskurven von gram-negativen Bakterien wie Salmonella paratyphi, Shigella flexneri, Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) und Escherichia coli AS19 gemessen und die Wachstums-inhibierende Wirkung analysiert. Im Gegensatz zum nativen Microcin J25 zeigten die in dieser Arbeit synthetisierten Peptide keine ausgeprägte biologische Aktivität.

Lasso peptides have a very unique structure which is not comparable with structurally simpler biopolymers found in nature. The formed cyclic structure can be described by the macroscopic form of the eponymous lasso and is synthesized in nature by enzymes. The synthesis of such structures is a major challenge in organic-synthetic chemistry and until now there is no synthetic procedure known which leads to the correct topological isomer. To reduce the energy barrier of this cyclization process and to analyze the ratio between the macrocycle and the chain in the chemical equilibrium we performed the cyclization in a reversible manner. This was achieved by the substitution of a peptide bond for an imine or oxime which transforms irreversible macrocyclization into a reversible process. In this work bioorthogonal synthetic methods for C-terminal and sidechain peptide aldehydes were developed. The cyclization tendency of these peptides as well as the spatial arrangement of the cyclic products, formed in chemical equilibrium, were analyzed in buffered solution by NMR-spectroscopy. By means of NMR-based molecular modelling the peptides were evaluated and the corresponding structures calculated. The cyclization tendency of C terminal peptide aldehydes was examined for the cyclic hexapeptide Segetalin A by NMR-spectroscopy. Instead of the expected head-to-tail cyclization the sidechain cyclization of the Trp-NH-indole was observed. Besides Segetalin A, several additional cyclic hexapeptides were cyclized reversibly and their structures characterized by NMR-spectroscopy. In contrast to the head-to-tail cyclization novel monomers for the head-to-sidechain cyclization had to be developed and synthesized in multi gram scale for the use in solid phase peptide synthesis. For the reversible cyclization of peptide aldehydes via the sidechain of glutamic acid two different synthetic routes were performed and analyzed. The first route which was focused on a precursor-based strategy involved the synthesis of the unnatural amino acid homoallyglycine. Derivatives of this amino acid were prepared and the oxidative cleavage of the terminal olefin to the corresponding aldehyde was investigated. The second synthesis route fashioned a sidechain dipeptide consisting of glutamic acid and a protected glycinal or glycinal precursor in the sidechain was performed. This significantly simplified the synthesis of the amino acid aldehydes, led to higher overall yields and a stable amino acid derivative which is synthesizable in a multi gram scale. The insertion of the synthetic amino acid in peptides was performed by manual and automated solid phase peptide synthesis. All sidechain peptide aldehydes which were synthesized in this way were analyzed by their cyclization tendency in buffered solution by NMR-spectroscopy. The establishment of the chemical equilibrium was achieved at pH 6.5 in buffered solution whereby a fast H/D exchange occurred. Because of the resulting signal broadening the quality of the measured NMR-spectra was too low for a complete assignment of the signals. By reductive amination of the reactive imines the equilibrium was shifted and the obtained macrocyclic peptides could be analyzed more easily. The analysis showed that the intramolecular interactions itself were not sufficient to form the correct lasso topology, only cyclic-branched peptides were isolated. Based on the insufficient pre-folding of the linear lasso peptide the C-terminal end was linked to the backbone by a disulfide bridge. The performed macrocyclization of the N-terminal ring should then lead to the correct folded lasso peptide. The isolation of the topologically correct peptide failed either. For the reversible cyclization of the N-terminal ring an amide bond was replaced by another disulfide bridge. By orthogonal protected cysteines which could be flexibly substituted in the primary sequence different disulfide patterns were synthesized and analyzed. The biological activity of the synthesized di- and tetrasulfides which showed the strongest similarity to the native Microcin J25 was investigated. Growth curves of gram-negative bacteria like Salmonella paratyphi, Shigella flexneri, enterohaemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Escherichia coli AS19 were measured in the presence of the synthetic peptides and their growth-inhibitory activity were characterized. In contrast to the native Microcin J25 the biological activity of the synthetic peptides was quite low., Unter den in der Natur üblichen Kettenmolekülen fallen Lassopeptide mit ihrer räumlichen Struktur aus der Rolle. Sie weisen eine cyclische Anordnung auf, die räumlich einem Lasso gleicht und in der Biosynthese unter Verwendung von Enzymen ausgebildet wird. Die Synthese solcher Strukturen stellt eine große Herausforderung in der organisch-synthetischen Chemie dar und konnte bis heute nicht erfolgreich durchgeführt werden. Um die Energiebarriere dieses Cyclisierungsprozesses zu verringern und das Verhältnis zwischen Ring und Kette im Gleichgewicht zu analysieren wurde die Cyclisierung reversibel gestaltet. Dies erfolgte mittels der Substitution einer Amidbindung durch eine Imin- oder Oxim-Bindung, welche die irreversible Macrocyclisierung eines Peptids in einen reversiblen Prozess transformiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bioorthogonale Synthesemethoden für C terminale und Seitenketten-Peptidaldehyde entwickelt und die Cyclisierungstendenz dieser Peptide sowie die räumliche Anordnung der im Gleichgewicht entstehenden Produkte mittels NMR-Spektroskopie in wässriger Lösung untersucht. Mittels NMR-basierter, molekularer Modellierung wurden die Peptide analysiert und entsprechende Strukturen berechnet. Die Cyclisierungstendenz von C-terminalen Peptidaldehyden wurde im Rahmen des cyclischen Hexapeptids Segetalin A NMR-spektroskopisch untersucht und entgegen der erwarteten Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung eine Seitenketten-Cyclisierung über das NH-Indol des Tryptophans beobachtet. Neben Segetalin A wurden weitere cyclische Hexapeptide reversibel cyclisiert und deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Im Gegensatz zur Kopf-zu-Schwanz-Cyclisierung musste für die Kopf-zu-Seitenketten-Cyclisierung neue in der Festphasensynthese einsetzbare Bausteine entwickelt und im Multigramm-Maßstab synthetisiert werden. Für die reversible Cyclisierung von Peptidaldehyden über die Seitenkette der Glutaminsäure wurden zwei verschiedene Synthesemethoden durchgeführt und untersucht. Im Rahmen der ersten Syntheseroute, die auf einem Precursor-basierten Ansatz beruht, wurde eine Synthese der unnatürlichen Aminosäure Homoallylglycin und dessen Derivate entwickelt und die oxidative Spaltung des terminalen Olefins zum Aldehyd analysiert. Der zweite Syntheseweg beinhaltete die Synthese eines Seitenketten-Dipeptids, bestehend aus Glutaminsäure und einem geschützten Glycinaldehyd oder einem Glycinaldehyd-Precursor in der Seitenkette. Dies vereinfachte die Synthese der Aldehyd-Aminosäuren erheblich, führte zu höheren Gesamtausbeuten und ergab ein im Multigramm-Maßstab herstellbares, stabiles Aminosäure-Derivat. Die Insertion der synthetischen Aminosäure in Peptide erfolgte mittels manueller und automatisierter Festphasenpeptidsynthese. Sämtliche, auf diese Art hergestellten, Seitenketten-Peptidaldehyde wurden auf ihre Cyclisierungstendenz in wässrigem Phosphatpuffer mittels NMR-Spektroskopie analysiert. Die Einstellung des chemischen Gleichgewichts erfolgte bei pH 6.5 in wässrigem Phosphatpuffer, wodurch ein schneller H/D-Austausch stattfand und die NMR-Spektren basierend auf der Signalverbreiterung eine geringe Qualität aufwiesen. Durch reduktive Aminierung wurde die Gleichgewichtsreaktion abgefangen und es konnte gezeigt werden, dass alleine durch intramolekulare Wechselwirkungen keine Lasso-Topologie ähnlich dem Naturstoff erhalten wurde, sondern ausschließlich das cyclisch-verzweigte Peptid. Aufgrund der nicht ausreichenden Vorfaltung innerhalb des linearen Lassopeptids wurde mit Hilfe einer Disulfidbrücke das C-terminale Ende kovalent an das Rückgrat gebunden, sodass eine mögliche Macrolactamisierung des N-terminalen Rings zu einem korrekt eingefädelten Lassopeptid führen sollte. In diesem Fall wurde erneut kein topologisch korrektes Lassopeptid erhalten. Es wurde für die reversible Cyclisierung des N-terminalen Rings eine weitere Disulfidbrücke eingeführt, die die Amidbindung ersetzt, aber die native Ringgröße nicht verändert. Durch orthogonal geschützte Cysteine, die flexibel in der Primärsequenz substituiert wurden, konnten unterschiedliche Disulfidmuster synthetisiert und analysiert werden. Die synthetisierten Di- und Tetrasulfide, welche die höchste Analogie zum nativen Microcin J25 aufwiesen, wurden auf ihre biologische Aktivität untersucht. Unter Zugabe der synthetischen Peptide wurden Wachstumskurven von gram-negativen Bakterien wie Salmonella paratyphi, Shigella flexneri, Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC) und Escherichia coli AS19 gemessen und die Wachstums-inhibierende Wirkung analysiert. Im Gegensatz zum nativen Microcin J25 zeigten die in dieser Arbeit synthetisierten Peptide keine ausgeprägte biologische Aktivität.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Filaggrin-Peptide mit einer definierten Konformation in Lösung synthetisiert und analysiert. Bei Filaggrin-Peptiden handelt es sich um eine biologisch aktive Peptidsequenz, welche in der Lage ist Autoantikörper zu erkennen, die bei einer Erkrankung mit rheumatoider Arthritis gebildet werden. Die Struktur der rigiden Filaggrin-Peptide wurde NMR-spektroskopisch aufgeklärt und deren Einfluss auf die biologische Aktivität durch Immunassays untersucht. Ferner wurden über Aminosäuren-Mimetika Informationen über Position und Eigenschaften des Bindungsepitops sowie den Einfluss verschiedener Aminosäuren und Funktionalitäten auf die Faltung des Peptids erhalten. So kann ein entscheidender Beitrag zur Aufklärung der Geometrie der Epitop-Antikörper-Bindung sowie der Entwicklung einer personenspezifischen, frühzeitigen Rheumadiagnose auf Grundlage von Immunassays geleistet werden., During this thesis filaggrin peptides with a defined conformation in solution were synthesized and analyzed. Filaggrin peptides have a biologically active peptide sequence which is able to recognize autoantibodies formed in a disease with rheumatoid arthritis. The structure of the rigid filaggrin peptides was elucidated by NMR spectroscopy and their influence on the biological activity was analyzed by immunoassays. Amino acid mimetics provided information about the position and properties of the binding epitope and the effects of amino acids and functionalities on the folding of the peptide. Thus a crucial contribution to the elucidation of the geometry of the epitope-antibody binding and to the development of a personalized diagnosis of rheumatiod arthritis based on immunoassays has been done.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung und Beschreibung der Eigenschaften der synthetischen Dekapeptide Cetrorelix und Ozarelix durch analytische Methoden und computergestützte Modellierung. Diese Moleküle sind hydrophobe, aggregierende Antagonisten des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH). Zusätzlich wurden amyloidbildende Peptidstrukturen als Modelle für die Assoziationsprozesse in hydrophoben Peptiden untersucht und visualisiert. Die intrinsische Fluoreszenz der GnRH-Antagonisten und zusätzlich der Peptide Teverelix und D-Phe6-GnRH sowie von verkürzten Fragmenten des Cetrorelix wurde untersucht. Ein Strukturmodell für die Beschreibung der Aggregation der Dekapeptide wurde erarbeitet. Der Aufbau eines Rechenclusters durch das Einbinden der Computer am Lehrstuhl in ein Linux-System zur Verteilung von Rechenprozessen über das Netzwerk ermöglichte die Bereitstellung der notwendigen Leistung zur Realisierung der Berechnungen. Es wurden Werkzeuge zur Modellierung der solvatisierten Aggregate von Peptiden ohne eindeutige Vorzugsstruktur programmiert und in ein Docking-System für beliebige Moleküle eingebunden. Verwendet wurde das Kraftfeld MMFF94 mit einer Erweiterung durch ein Verfahren zur dynamischen Berechnung von Partialladungen in Molekülstrukturen. Solvatisierte Aggregate der Dekapeptide und von bekannten amyloidbildenden Strukturen wurden modelliert (Docking). Berechnet wurden als aggregierend beschriebene Sequenzen und entsprechende Vergleichsstrukturen des Calcitonins, des Insel-Amyloid-Polypeptides, des beta2-Mikroglobulins, des Amyloid-beta-Proteins, des Lactoferrins und weitere Modellpeptide. Die wesentlichen Wechselwirkungen während der Aggregation konnten schließlich anhand von Dynamik-Simulationen der faltblattartigen Dimere des Cetrorelix und Ozarelix beschrieben werden. So wurden die Prozesse der hydrophoben Assoziation und Stabilisierung durch Wasserstoffbrücken von Peptiden veranschaulicht und auf molekularer Ebene erfolgreich analysiert. Die Visualisierung der erhaltenen Modellierungsergebnisse erfolgt durch die Darstellung der Strukturen und Dynamik-Simulationen als interaktive 3D-Modelle in einem für diese Arbeit aufgebauten Internetauftritt. This work discusses the analysis of the aggregation properties of the gonadotropin releasing hormone antagonists Cetrorelix, Teverelix, Ozarelix and of small amyloid forming model peptides by analytical fluorescence spectroscopy and molecular modelling. A high performance linux compute cluster was developed for calculation of molecular structures. Solvated aggregate clusters of peptides without defined secondary structure were modelled by molecular mechanics methods (forcefield mmff94) in combination with an advanced charge equilibration and docking technique. Molecular dynamics of solvated peptide dimers were implemented and the role of hydrophic association and hydrogen bond formation in hydrophobic peptide aggregates was explained. Finally, an aggregation model for the directed association of hydrophobic peptides is presented. The modelling results, 3d structures and dynamic simulations are visualized in an interactive web material.

Die Anwendung von thermodynamischen Modellen ist eine weit verbreitete Methode zur Vorhersage von RNA-Sekundärstrukturen ausgehend von einer Nukleotidsequenz. Obwohl mithilfe dieser Modelle bereits nahezu perfekte Vorhersagen für einige kürzere RNAs getroffen werden können, werden insbesondere bei längeren Sequenzen eher Resultate mit mäßigerer Qualität erzielt. Generell ist ein tendenzielles Sinken der Vorhersagequalität mit steigender Sequenzlänge zu beobachten. Um dieser Tendenz entgegenzuwirken besteht die Möglichkeit neben der Nukleotidsequenz noch weitere Informationen in den Vorhersageprozess miteinzubeziehen. Hochdurchsatz-Methoden wie SHAPE (selektive 2’-Hydroxyl Acylierung analysiert mittels Primer-Extension) bieten die Möglichkeit die Reaktivität einzelner Nukleotide zu bestimmen. Da die gemessene Reaktivität invers mit der Paarungswahrscheinlichkeit korreliert, können diese zusätzlichen Informationen dazu verwendet werden den Faltungsprozess in eine Richtung zu lenken dessen Ergebnis die experimentell bestimmten Paarungswahrscheinlichkeiten widerspiegelt. Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt auf der Implementierung von diversen bereits publizierten Ansätzen zur Integration von experimentell ermittelten SHAPE Daten in die Faltungsrekursionen des Vienna RNA Package. Darüber hinaus wird die Auswirkung der Integration zusätzlicher experimenteller Daten auf die Qualität der Vorhersageresultate anhand eines Testsets mit bekannten Referenzstrukturen analysiert. RNA secondary structure prediction algorithms based on thermodynamic models are commonly used to predict possible secondary structures for a given nucleotide sequence. Even though almost perfect predictions can be achieved for small sequences, prediction accuracy tends to decrease with increasing sequence length. One way to work around this limitation is to incorporate additional data into the prediction algorithms. Chemical footprinting experiments like SHAPE (selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension) yield additional information about the flexibility of each nucleotide, which may be considered as inversely correlated to its pairing probability. By considering this additional information during the folding process, prediction algorithms may be biased in a way that leads to results closely related to the observed reactivity pattern. This work focuses on implementing various approaches for integrating SHAPE reactivities into the folding algorithms of the Vienna RNA Package by applying soft constraints, which are modifying the energy model according to the experimental data. The impact of those modifications onto the prediction algorithms and their ability to improve the quality of the prediction results are inspected by applying various approaches to a test set of RNAs with known reference structures. vorgelegt von: Dominik Luntzer Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2014

te Shapes wurden 2004 bei der Analyse von RNA-Sekundärstrukturen eingeführt und haben seither viele Anwendungen gefunden. Abstrakte Shapes sind Abstraktionen von Strukturen, wobei eine einzelne Shape eine Klasse von ähnlichen Strukturen enthält. Weiterhin enthält eine Shape als repräsentative Struktur diejenige mit der kleinsten freien Energie. Das Werkzeug RNAshapes bietet 5 verschiedene Abstraktionslevel (Shape-Typen), die hierarchisch aufgebaut sind. Je niedriger das Shape-Level, desto mehr Strukturelemente - wie Bulge oder Internal-Loops - werden in die Shape-Repräsentation einbezogen. Die Anzahl der Shapes ist exponentiell in der Sequenzlänge, wächst aber langsamer als die Anzahl der Strukturen. Das Wachstumsverhalten ist aus zwei Gründen interessant: Erstens geht es in die asymptotische Laufzeit von Algorithmen zur Shape-Analyse ein. Zweitens gibt die Gesamtzahl der Shapes eine Obergrenze für die Größe von Shape-Indices an, zu denen RNA-Datenbanken für die Struktur-basierte Suche vorverarbeitet werden. Die offene Frage der asymptotischen Anzahl der Shapes hat einiges Interesse in der theoretischen Bioinformatik gefunden. Die Asymptotik der Anzahl der Shapes wurden durch Lorenz, Ponty und Clote (2008) für Sequenzen der Länge n (Shape Typ 3 und 5) bestimmt, während Nebel und Scheid (2009) Shapes der Länge n untersuchten (Shape Typ 1-5). Das Anliegen der Arbeit war es, gewisse kombinatorische Aussagen über abstrakte Shapes zu gewinnen. Wieviel Shapes gibt es mit n Klammerpaaren? Wieviel Shapes gibt es zu Sequenzen der Länge n? Was ist die erwartete Anzahl der Shapes für eine Sequenz der Länge n? Zur letzten Frage erscheint ein theoretischer Zugang schwierig; daher wurden empirische Messungen ins Auge gefasst. In meinen Ergebnissen habe ich die Rekurrenzformel für die Anzahl der Shapes aller Sequenzen der Längen

This thesis deals with the preparation of protein microparticles by spray-freeze-drying (SFD) and the effects of the process on protein secondary and tertiary structure. The first part of this thesis covers the development of an FTIR method for objective and fast determination of protein secondary structure, which is directly linked to protein stability. The second part investigates the influence of atomization conditions on protein secondary and tertiary structure as well as residual enzyme activity during SFD. The process is analyzed after a)atomization b)atomization, freezing and thawing back at room temperature and c)the complete spray-freeze-drying process. A thorough comparison of the utilized ultrasound nozzles (including particle size distribution, temperatures and cavitation effects) is performed in the third part of this thesis. In the fourth and last part of this thesis, different formulations containing a mixture of a-CT and excipients are evaluated for their stability. Diese Arbeit behandelt die Herstellung von proteinbeladenen Mikropartikeln mittels Sprühgefriertrocknung und die Auswirkungen des Prozesses auf die Sekundär- und Tertiärstruktur von Proteinen. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt die Entwicklung einer FTIR Methode zur schnellen und objektiven Quantifizierung der Proteinsekundärstruktur, welche direkt mit der Stabilität eines Proteins verknüpft ist. Der zweite Teil untersucht den Einfluss von Zerstäubungsbedingungen auf die Sekundär- und Tertiärstruktur sowie auf die Enzymrestaktivität von Proteinen während der Sprühgefriertrocknung. Der Prozess wird nach folgenden Teilschritten analysiert: a)Zerstäuben b)Zerstäuben, Einfrieren und Tauen bei Raumtemperatur c)Nach dem kompletten SFD Prozess Ein ausführlicher Vergleich der eingesetzten Ultraschalldüsen (inklusive Partikelgrößenverteilung, Temperatur und Kavitation) wird im dritten Teil dieser Arbeit vorgenommen. Im vierten und letzten Teil dieser Arbeit werden schließlich diverse Formulierungen untersucht, welche Mischungen aus a-CT und Hilfsstoffen enthalten.

Biodiversity may be investigated and explored by the means of genetic sequence information and molecular phylogenetics. Yet, with ribosomal genes, information for phylogenetic studies may not only be retained from the primary sequence, but also from the secondary structure. Software that is able to cope with two dimensional data and designed to answer taxonomic questions has been recently developed and published as a new scientific pipeline. This thesis is concerned with expanding this pipeline by a tool that facialiates the annotation of a ribosomal region, namely the ITS2. We were also able to show that this states a crucial step for secondary structure phylogenetics and for data allocation of the ITS2-database. This resulting freely available tool determines high quality annotations. In a further study, the complete phylogenetic pipeline has been evaluated on a theoretical basis in a comprehensive simulation study. We were able to show that both, the accuracy and the robustness of phylogenetic trees are largely improved by the approach. The second major part of this thesis concentrates on case studies that applied this pipeline to resolve questions in taxonomy and ecology. We were able to determine several independent phylogenies within the green algae that further corroborate the idea that secondary structures improve the obtainable phylogenetic signal, but now from a biological perspective. This approach was applicable in studies on the species and genus level, but due to the conservation of the secondary structure also for investigations on the deeper level of taxonomy. An additional case study with blue butterflies indicates that this approach is not restricted to plants, but may also be used for metazoan phylogenies. The importance of high quality phylogenetic trees is indicated by two ecological studies that have been conducted. By integrating secondary structure phylogenetics, we were able to answer questions about the evolution of ant-plant interactions and of communities of bacteria residing on different plant tissues. Finally, we speculate how phylogenetic methods with RNA may be further enhanced by integration of the third dimension. This has been a speculative idea that was supplemented with a small phylogenetic example, however it shows that the great potential of structural phylogenetics has not been fully exploited yet. Altogether, this thesis comprises aspects of several different biological disciplines, which are evolutionary biology and biodiversity research, community and invasion ecology as well as molecular and structural biology. Further, it is complemented by statistical approaches and development of informatical software. All these different research areas are combined by the means of bioinformatics as the central connective link into one comprehensive thesis., Biologische Diversität kann mit Hilfe molekularer Sequenzinformation und phylogenetischen Methoden erforscht und erfasst werden. Bei ribosomalen Genen kann man jedoch wertvolle Information nicht nur aus der Primärsequenz beziehen, sondern auch aus der Sekundärstruktur. In den letzen Jahren wurde Software entwickelt, die solche Daten für taxonomische Fragestellung verwerten kann. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einer Erweiterung dieser Methodik durch eine Software-Anwendung, die die Annotation des ribosomalen Genes ITS2 deutlich vereinfacht. Mit dieser Studie konnten wir zeigen, dass dies einen entscheidenden Schritt der Sequenz-Struktur-Phylogenie und der Datenerfassung der ITS2-Datenbank darstellt. Die daraus resultierende und frei verfügbare Anwendung ermöglicht Annotationen von hoher Güte. In einer weiteren Studie wurde mittels Simulationen der gesamte Arbeitsfluß der Sequenz-Struktur Phylogenie auf theoretischer Ebene evaluiert. Dabei zeigte sich, dass sich sowohl die Genauigkeit, als auch die Robustheit von phylogenetischen Stammbäumen durch diesen Ansatz deutlich verbessern. Der zweite große Teil der Arbeit befasst sich mit Fallbeispielen, in denen dieser Arbeitsfluß zur Aufklärung von taxomonischen and ökologischen Fragestellungen Anwendung fand. In diesem Rahmen konnten wir mehrere und voneinander unabhängige Phylogenien ermitteln, welche die theoretischen Ergebnisse einer Verbesserung phylogenetischer Bäume auch von biologischer Seite aus bekräftigen. Der Ansatz war anwendbar in sehr feinskaligen Studien auf Art bzw. Gattungsniveau, aber durch die starke Konservierung der Sekundärstruktur auch an sehr weit von einander entfernten taxonomischen Gruppen. Eine weitere Studie, die sich mit der Phylogenie von Bläulingen befasst, zeigt deutlich, dass dieser Ansatz nicht nur für Fragestellungen bei Pflanzen, sondern auch im Tierreich angewandt werden kann. Die Bedeutung von qualitativ hochwertigen Stammbäumen auch für andere Fachbereiche wird an zwei unserer ökologischen Studien deutlich: Mit Hinzunahme von Sekundärstruktur war es uns möglich Fragestellungen über die Evolution von Ameisen-Pflanzen Interaktionen sowie über ökologische Gemeinschaften von Bakterien auf verschiedenen Pflanzenteilen zu beantworten. Zuletzt gehen wir spekulativ auf die Frage ein, wie Strukturphylogenie um die dritte Dimension erweitert werden kann. Dies bleibt zwar spekulativ und wurde nur um ein kleines Fallbeispiel ergänzt, jedoch zeigt sich deutlich, dass das Potential von Strukturphylogenie noch nicht erschöpft ist. Insgesamt befasst sich diese Arbeit mit Aspekten aus verschiedenen biologischen Disziplinen: Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung, sowie Gemeinschafts- und Invasionsökologie, aber auch Molekular- und Strukturbiologie. Dies wurde ergänzt durch statistische Ansätze und Entwicklung von informatischer Software. Diese verschiedenen Forschungsrichtungen wurden mit Hilfe der Bioinformatik als zentrales Bindeglied vereint.

This study addresses the structure-function relationships of three essential membrane proteins: Porin from Paracoccus denitrificans, Porin OmpG from Eschericia coli and BetP from Corynobacterium glutamicum using Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy and Attenuated Total Reflection (ATR) techniques. The structure of porin from P. denitrificans is known for more than a decade; however, the mechanism for loss of functionality together with the monomerization was not clear. In this study we have addressed the role of lipids for the functionality of porin using FT-IR. OmpF porin was found to interact with the lipid molecules via the aromatic girdles surrounding the protein for functionality. In this study, molecular bonds and groups of the lipids were established as reporter groups probing at different depths of the bilayer in order to understand the interaction partner of the aromatic girdles of porins. Monomerization of the trimeric assembly of OmpF porin reconstituted in lipids is induced by increasing the temperature. Porin (OmpF) was found to be extremely stable: The secondary structure of the protein was unaltered up to the temperature-induced main transition, around 80-90 °C, above which it is denatured. However, the interaction of the aromatic girdle with the lipid molecules exhibited distinct changes at much lower temperature values (40 - 50°) where, according to the previous functional studies, monomerization and the loss of function occurs. The results are compared with OmpG porin from E.coli, for which the functional unit is a monomer. The aromatic girdle-lipid interaction was monitored by the tyrosine aromatic ring C=C vibrational mode, a universal marker for the protein stability and interaction. We have also found that the aromatic girdles of porins are interacting with the interfacial region of the lipid bilayer instead of lipid headgroups. Lipid-protein interaction was found to be not only essential for the structural stability, but also for the functionality of OmpF porin. We have also studied the structural properties of OmpG from E.coli. The structure of OmpG at two pH values has been resolved using X-ray crystallography and the channel has been proposed to attain different states at different pH values as closed (pH < 5.5) and open (pH >7.5). This study, using IR spectroscopy, revealed that the pH-induced opening and closing of the channel is reflected by the frequency shifts of the ? sheet structure. OmpG has more rigid ? barrel properties upon opening of the channel. IR spectral analysis revealed multiple ? sheet signals with different hydrogen bond strengths. This enabled us to monitor the formation of hydrogen bridges between the extracellular loops upon opening of the channel. The conclusion that OmpG porin having two states at different pH values was also confirmed by the three mutants where the role of the histidine pair (H231 & H261) and loop 6 has been addressed. Temperature-profiling of the wild type (WT) protein and the mutants did not show pH dependent structural stability differences in detergent solution. However, the WT protein was found to be more stable in the open form in 2D crystals than the closed form. Reconstitution into lipids has increased the transition temperature value by ~20 °C in the closed state and ~25 °C in the open state. Therefore we conclude that the open and closed state of OmpG has structural stability differences that are only revealed in the lipid environment. A comparison of the transition temperature values of OmpG WT and the mutants suggested that the hydrogen bond network among S218-H231-H261-D267, together with the formation of 12 residue-long ?-sheet contributes to the structural stability of the open channel. In the process of closing and opening of the channel, the globular structure of the protein remains mainly unchanged, while there are changes in the side chain moieties. In addition to the role of the histidine pair and the loop L6, in situ opening/closing experiments showed that the negatively charged amino acids, i.e. Asp and Glu, and Arg residues also play an active role; possibly by interacting with each other inside the pore lumen. Therefore it could be concluded that the closure of the channel at acidic pH values is not only via closing the channel entrance by loop 6, but also via changing the electric potential inside the lumen due to the different states of charged amino acids in order to effectively block the gateway. BetP from C.glutamicum attains an active and inactive state in order to adjust its glycine betaine uptake rate to the osmotic conditions that the cell encounters. The structure of BetP is not yet available. The WT protein exhibited structural differences in the presence of excess K+, which is one of the activation conditions. In 2D crystals, increasing the ionic strength to 700 mM K+ was shown to induce changes in the ?-helical moiety with contributions from the ester groups and one Tyr residue using ATR-FTIR. An increase in ionic strength to 220 mM K+ was found to be the threshold value of potassium concentration ([K+]) where the protein exhibits structural alterations in detergent solution. The determined [K+] values are in good agreement with the previous functional studies. However, there are differences in the activation profile of BetP in 2D crystals and in detergent solution, which points out that the lipids are involved in the conformational transition from the inactive to the active state and their absence can lead to different structural properties. BetP WT was found to have ~65% alpha-helix, ~25% random coil and ~10% turn structure in detergent solution. In the presence of excess K+, the WT protein is found to adapt more unordered structure. Secondary structure analysis of the mutants revealed that both the N- and C-terminus are in ?-helical conformation. Reconstitution of WT protein in 2D crystals increased the main transition (denaturation) temperature value from ~62 °C to ~85 °C, a clear indication that the protein is more stable in lipid environment. Temperature-profiling of the two forms of the WT protein revealed that the structural breakdown is preceeded by monomerization of the trimeric assembly. Comparing the two forms of the WT protein and the mutant BetA, we conclude that the oligomeric status is stabilized via the interactions among hydrophilic regions involving the N terminus. H/D exchange and activation with excess K+ in D2O-buffer revealed that activation of the protein involves the interaction of Arg and Asp/Glu residues in the cytoplasmic region of the protein. BetP WT and the two mutants tested, i.e. BetA and BetP?C45, showed differences in protein packing upon activation. The WT protein and BetP?C45 mutant also show changes in the hydrogen bonding properties of turns. Since BetA does not show such a property in activation, we conclude that the N-terminus interacts with the loops in the inactive state via the interaction of charged amino acids for the WT protein and that this interaction is altered during the activation. It could be argued that the protein packing is affected via the changes in turns upon activation. We also have found experimental evidence that one Tyr residue has different orientations in the active and inactive state of BetP. Based on the previous functional studies, it could be one of the five Tyr residues in the cytoplasmic region of the protein (in loop 3, 6, 7 or C-terminus). The mutant BetP?C45, on the other hand, showed fewer differences between the active and inactive state conditions and based on the H/D exchange rates, the mutant shows the properties of an active WT protein, proving that the C-terminal truncation impairs the conformational transition between the active and inactive states. In der vorliegenden Arbeit werden Struktur-Funktions-Beziehungen von drei verschiedenen Membranproteinen mittels Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FT-IR) und abgeschwächter Totalreflexion (ATR) untersucht. Die analysierten Membranproteine umfassen die Außenmembranproteine OmpG aus Escherichia coli und OmpF aus Paracoccus denitrificans, sowie der osmoregulierte Sekundärtransporter BetP aus Corynebacterium glutamicum. Obwohl die Struktur des P. denitrificans Porins schon seit mehr als einem Jahrzehnt bekannt ist, sind die der Monomerisierung und des Funktionsverlustes zugrundeliegenden Mechanismen unbekannt. In dieser Arbeit wurde daher die Rolle der Lipide für die Funktionalität von OmpF unter Verwendung von FT-IR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass OmpF mit Lipidmolekülen über den sogenannten aromatischen Gürtel interagiert, welcher das Molekül an der Außenseite umgibt. Die Bindungen und Lipidgruppen, die in unterschiedlicher Tiefe der Membran lokalisiert sind, wurden damit als Reportergruppen für die Interaktion der Lipide mit dem aromatischen Gürtel identifiziert. Die Monomerisierung des in Lipiden rekonstituierten trimeren OmpF Porins wurde durch Erhöhung der Temperatur induziert. Dabei wurde festgestellt, dass OmpF extrem stabil ist: Die Sekundärstruktur des Proteins blieb bis zu der Übergangstemperatur von 80-90°C unverändert und denaturierte bei weiterer Temperaturerhöhung. Dagegen wies die Interaktion des aromatischen Gürtels mit den Lipidmolekülen bereits deutliche Änderungen bei niedrigeren Temperaturen (40-50°C) auf, wo gemäß bisheriger funktioneller Studien die Monomerisierung und der Funktionsverlust stattfindet. Die Ergebnisse der Studie am OmpF Porin aus P. denitrificans wurden mit denen vom OmpG Porin aus E. coli verglichen, bei dem die funktionelle Einheit ein Monomer ist. Die Interaktion der Lipide mit dem aromatischen Gürtel wurde mittels des C=C Vibrationsmodus des aromatischen Tyrosins, einem universellen Marker für Proteinstabilität und Interaktion, untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass der aromatische Gürtel der Porine mit der Region zwischen den Lipidkopfgruppen interagiert und nicht direkt mit ihnen. Darüber hinaus konnte für das OmpF Porin gezeigt werden, dass die Lipid-Protein-Interaktion nicht nur essentiell für die strukturelle Stabilität, sondern auch für die Funktionalität ist. Als weiteres Projekt wurden die strukturellen Eigenschaften von OmpG aus E. coli untersucht. Die dreidimensionale Struktur von OmpG wurde mittels Röntgenstrukturanalyse bei zwei pH-Werten gelöst (Yildiz et al.). Es war bekannt, dass der Kanal verschiedene Zustände bei unterschiedlichen pH-Werten einnimmt, nämlich einen geschlossenen (pH < 5,5) und einen offenen (>pH 7,5). In der vorliegenden Arbeit wurde mittels IR-Spektroskopie gezeigt, dass das pH-induzierte Öffnen und Schließen durch Frequenzverschiebung der ?-Faltblatt Struktur wiedergegeben wird. OmpG besitzt rigidere ? Fass Eigenschaften wenn der Kanal geöffnet ist. Die Auswertung der IR-Spektren ergab, dass mehrere ?-Faltblattsignale mit unterschiedlichen Wasserstoffbindungsstärken vorliegen. Diese Beobachtung ermöglichte uns, die Ausbildung der Wasserstoffbrücken zwischen den extrazellulären Schleifen bei der Öffnung des Kanals zu verfolgen. Den pH abhängigen Kanalzustand des OmpG Porins konnte auch durch drei Mutanten bestätigt werden, bei denen die Rolle des Histidin-Paares (H231 und H261) und der Schleife L6 untersucht wurde. Das Temperaturprofil des Wildtyp-Proteins (WT) und der Mutanten zeigte keine pH-abhängigen strukturellen Stabilitätsunterschiede, wenn das Protein in Detergenzlösung vorlag. War das WT Protein jedoch in 2D Kristallen eingebettet, stellte sich heraus, dass es im offenen Zustand stabiler war als im geschlossenen. Die Rekonstitution in Lipide hat dabei die Übergangstemperatur um ~20°C für den geschlossenen und ~25°C für den offenen Kanalzustand erhöht. Es konnte geschlussfolgert werden, dass der offene und geschlossene Zustand von OmpG strukturelle Stabilitätsunterschiede besitzt, die jedoch nur in der Lipidumgebung nachweisbar waren. Ein Vergleich der gemessenen Übergangstemperaturwerte von OmpG-WT mit denen der Mutanten deutet an, dass das Wasserstoffbrücken-Netzwerk zwischen S218-H231-H261-D267, zusammen mit der Ausbildung von einem zwölf Reste umfassenden Faltblatt zur strukturellen Stabilität des offenen Kanals beiträgt. Im Prozess des Schließens und Öffnens bleibt die Gesamtstructure des Proteins unverändert, während Änderungen der Seitenkettenpositionen vorliegen. Zusätzlich zu der Rolle des Histidin-Paares und der Schleife L6 haben in situ Experimente gezeigt, dass die negativ geladenen Aminosäuren Asp und Glu sowie Arg Reste auch eine aktive Rolle spielen, möglicherweise durch Interaktionen miteinander im Porenlumen. Daher kann angenommen werden, dass das Schließen bei saurem pH-Wert nicht allein am Kanaleingang durch Schleife L6 stattfindet, sondern auch über eine Änderung des elektrischen Potentials im Lumen, was zu unterschiedlichen Zuständen von geladenen Aminosäuren und schließlich zu einem effizienten Kanalverschluss führt. BetP aus C. glutamicum kann in einem aktiven und inaktiven Zustand vorliegen und dient dem Schutz der Zelle, indem es Änderungen von osmotischen Bedingungen durch einen Transport von Glycin-Betain kompensiert. Die dreidimensionale Struktur von BetP (ist zwar bislang noch nicht verfügbar) jedoch ist bekannt, dass die Zugabe eines Überschusses an K+-Ionen strukturelle Unterschiede zur Folge hat. Damit ist K+ bei der Aktivierung des Transports beteiligt. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels ATR-FTIR gezeigt werden, dass die Erhöhung der Ionenstärke auf 700 mM in 2D Kristallen Änderungen des ?-helikalen Anteils induziert, wobei Estergruppen und ein Tyr Rest beteiligt sind. Die Erhöhung der Ionenstärke auf 220 mM K+ wurde als Grenzwert der Kaliumkonzentration ([K+]) bestimmt, bei der das Protein strukturelle Änderungen in Detergenzlösung aufwies. Die definierten [K+] Werte stehen in guter Übereinstimmung mit vorhergehenden funktionalen Studien. Dennnoch gibt es Unterschiede im Aktivitätsprofil von BetP in 2D Kristallen und in Detergenzlösung. Diese Unterschiede weisen darauf hin, dass Lipide beim Konformationsübergang vom inaktiven zum aktiven Zustand involviert sind und dass ihre Abwesenheit andere strukturelle Eigenschaften zur Folge hat. In Detergenzlösung wurde der ?-helikale Anteil von BetP WT mit ~65% bestimmt, ~25% liegen als random coil vor und ~10% als Turns. In Anwesenheit eines K+-Überschusses nimmt das WT-Protein eine ungeordnetere Struktur an. Sekundärstrukturanalysen von mutiertem BetP zeigten, dass sowohl N- als auch C-Terminus in einer ?-helikalen Konformation vorliegen. Rekonstitution des WT Proteins in 2D Kristalle erhöhte die Temperatur des Hauptübergangszustandes (Denaturierung) von etwa 62°C auf 85°C, ein klarer Indikator dass das Protein stabiler in Lipidumgebung vorliegt. Die Temperaturprofile der zwei Formen des WT Proteins zeigt, dass die Monomerisation der trimeren Anordnung dem strukturellen Zusammenbruch vorausgeht. Der Vergleich der beiden Formen des WT Proteins und der Mutante BetA ließ die Schlussfolgerung zu, dass der oligomere Zustand über die Interaktionen entlang der hydrophilen Regionen stattfindet, einschließlich dem N-Terminus. H/D Austausch-Experimente mit einer einhergehenden Proteinaktivierung durch K+ Überschuss im D2O Puffer zeigt, dass die Interaktionen von Arg und Asp/Glu Resten auf der cytoplasmatischen Region involviert sind. BetP WT und die beiden getesteten Mutanten, d.h. BetA und Bet?C45, zeigten Unterschiede in der Proteinpackung nach Aktivierung. Das WT Protein und die BetP?C45 Mutante zeigten zudem Unterschiede in den Eigenschaften der Wasserstoffbrücken Eigenschaften in den Turns. Da BetA solch eine Eigenschaft nach Aktivierung nicht zeigt, konnte geschlussfolgert werden, dass der N-Terminus beim WT Protein mit den Schleifen im inaktiven Zustand über die Interaktion der geladenen Aminosäuren interagiert und dass sich diese Interaktion während der Aktivierung verändert. Es kann angenommen werden, dass die Proteinpackung über Änderungen in den Turn-Bereichen nach Aktivierung beeinflusst ist. Wir fanden experimentelle Beweise, dass ein Tyr Rest unterschiedliche Orientierung im aktiven und inaktiven Zustand von BetP besitzt. Basierend auf vorhergehende funktionale Studien könnte es einer der fünf Tyr Reste in der cytoplasmatischen Region des Proteins sein (in Schleife drei, sechs, sieben oder dem C Terminus). Die Mutante BetP(del)C45 hingegen zeigte weniger Unterschiede zwischen dem aktiven und inaktiven Zustand sowie basierend auf den H/D Austauschraten, zeigt diese Mutante Eigenschaften eines aktiven WT Proteins, was beweist, dass die C-terminale Verkürzung den Konformationsübergang zwischen dem aktiven und inaktivem Zustand beeinflusst.

The first high quality Amide I bands of membrane-bound Ras were obtained after establishing an ATR-FTIR set-up. Protein secondary structure analyses were performed by an improved curve-fitting technique. Truncated H-Ras (1-166) and membrane-bound N-Ras (1-188) protein secondary structures were in accordance with the literature. Tyr side chain band splitting was observed for the membrane-bound N-Ras. Besides, secondary structure deviations were apparent, when there was no membrane available to the protein for binding. Measurements were also performed with the polarized light. The study of membrane-bound Ras protein interaction with the nitric oxide was initiated in a model system. Protein activity was attained. The lipid absorption intensity was modulated. In relation, random to sheet transitions of the membrane-bound Ras protein was observed. Stabilizing interactions of the lipid C=O region were accompanying. This could be associated with the conformational changes in the Ras protein.

En sjukdom kan många gånger härledas till en kaskadereaktion mellan proteiner, co-faktorer och substrat. Denna kaskadreaktion blir många gånger målet för att behandla sjukdomen med läkemedel. För att designa nya läkemedelsmoleyler används vanligen datorbaserade verktyg. Denna design av läkemedelsmolekyler drar stor nytta av att målproteinet är känt och då framförallt dess tredimensionella (3D) struktur. Är 3D-strukturen känd kan man utföra så kallad struktur- och datorbaserad molekyldesign, 3D-geometrin (f.f.a. för inbindningsplatsen) blir en vägledning för designen av en ny molekyl. Många faktorer avgör interaktionen mellan en molekyl och bindningsplatsen, till exempel fysikalisk-kemiska egenskaper hos molekylen och bindningsplatsen, flexibiliteten i molekylen och målproteinet, och det omgivande lösningsmedlet. För att strukturbaserad molekyldesign ska fungera väl måste två viktiga steg utföras: i) 3D anpassning av molekyler till bindningsplatsen i ett målprotein (s.k. dockning) och ii) prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen. Huvudsyftena med arbetet i denna avhandling var som följer: i) skapa modeler för att prediktera affiniteten mellan en molekyl och bindningsplatsen i ett målprotein; ii) förfina molekyl-protein-geometrin som skapas vid 3D-anpassning mellan en molekyl och bindningsplatsen i ett målprotein (s.k. dockning); iii) karaktärisera proteiner och framför allt deras sekundärstruktur; iv) bedöma effekten av olika matematiska beskrivningar av lösningsmedlet för förfining av 3D molekyl-protein-geometrin skapad vid dockning och prediktion av molekylers affinitet för proteiners bindningsfickor. Ett övergripande syfte var att använda kemometriska metoder för modellering och dataanalys på de ovan nämnda punkterna. För att sammanfatta så presenterar denna avhandling metoder och resultat som är användbara för strukturbaserad molekyldesign. De rapporterade resultaten visar att det är möjligt att skapa kemometriska modeler för prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen i ett protein och att dessa presterade lika bra som andra vanliga metoder. Dessutom kunde kemometriska modeller skapas för att beskriva effekten av hur inställningarna för olika parametrar i dockningsprogram påverkade den 3D molekyl-protein-geometrin som dockingsprogram skapade. Vidare kunde kemometriska modeller andvändas för att öka förståelsen för deskriptorer som beskrev sekundärstrukturen i proteiner. Förfining av molekyl-protein-geometrin skapad genom dockning gav liknande och ickesignifikanta resultat oberoende av vilken matematisk modell för lösningsmedlet som användes, förutom för ett fåtal (sex av 30) fall. Däremot visade det sig att användandet av en förfinad geometri var värdefullt för prediktion av molekylers affinitet för bindningsplatsen i ett protein. Förbättringen av prediktion av affintitet var markant då en Poisson-Boltzmann beskrivning av lösningsmedlet användes; jämfört med prediktionerna gjorda med ett dockningsprogram förbättrades korrelationen mellan beräknad affintiet och uppmätt affinitet med 0,7 (R2). A disease is often associated with a cascade reaction pathway involving proteins, co-factors and substrates. Hence to treat the disease, elements of this pathway are often targeted using a therapeutic agent, a drug. Designing new drug molecules for use as therapeutic agents involves the application of methods collectively known as computer-aided molecular design, CAMD. When the three dimensional (3D) geometry of a macromolecular target (usually a protein) is known, structure-based CAMD is undertaken and structural information of the target guides the design of new molecules and their interactions with the binding sites in targeted proteins. Many factors influence the interactions between the designed molecules and the binding sites of the target proteins, such as the physico-chemical properties of the molecule and the binding site, the flexibility of the protein and the ligand, and the surrounding solvent. In order for structure-based CAMD to be successful, two important aspects must be considered that take the abovementioned factors into account. These are; i) 3D fitting of molecules to the binding site of the target protein (like fitting pieces of a jigsaw puzzle), and ii) predicting the affinity of molecules to the protein binding site. The main objectives of the work underlying this thesis were: to create models for predicting the affinity between a molecule and a protein binding site; to refine the geometry of the molecule-protein complex derived by or in 3D fitting (also known as docking); to characterize the proteins and their secondary structure; and to evaluate the effects of different generalized-Born (GB) and Poisson-Boltzmann (PB) implicit solvent models on the refinement of the molecule-protein complex geometry created in the docking and the prediction of the molecule-to-protein binding site affinity. A further objective was to apply chemometric methodologies for modeling and data analysis to all of the above. To summarize, this thesis presents methodologies and results applicable to structure-based CAMD. Results show that predictive chemometric models for molecule-to-protein binding site affinity could be created that yield comparable results to similar, commonly used methods. In addition, chemometric models could be created to model the effects of software settings on the molecule-protein complex geometry using software for molecule-to-binding site docking. Furthermore, the use of chemometric models provided a more profound understanding of protein secondary structure descriptors. Refining the geometry of molecule-protein complexes created through molecule-to-binding site docking gave similar results for all investigated implicit solvent models, but the geometry was significantly improved in only a few examined cases (six of 30). However, using the geometry-refined molecule-protein complexes was highly valuable for the prediction of molecule-to-binding site affinity. Indeed, using the PB solvent model it yielded improvements of 0.7 in correlation coefficients (R2) for binding affinity parameters of a set of Factor Xa protein drug molecules, relative to those obtained using the fitting software.

A straightforward synthesis of the two new furanoid sugar amino acids f-SAA 106 and f-SAA 107 in high yields in a few steps from glucose was developed. The described new synthetic pathway allows an easy access to f-SAA 106 and f-SAA 107, making them useful building blocks and structural templates for drug design and combinatorial syntheses. Their synthesis starts from readily available diacetone glucose, and is faster, easier to scale up and cheaper, than the syntheses of other SAAs so far known. f-SAA 106’s and f-SAA 107’s structural properties have been studied. Linear and cyclic mixed oligomers of f-SAA 106 and f-SAA 107 were synthesized and solution structures extensively investigated by circular dichroism (CD) and 2D-NMR spectroscopy. The linear oligomer Fmoc–[f-SAA106–beta-hGly]3–OH 113 exhibited 12/10/12 helical secondary structure in MeCN as proven by NMR, and subsequent molecular dynamics calculations. It is very remarkable that 113 forms a stable secondary structure, since stable secondary structures were only reported for beta-peptides consisting almost exclusively of a- or b-substituted beta-amino acids. The unsubstituted beta-homoglycin is obviously much more flexible than substituted b-amino acids. f-SAA 106 therefore very strongly induces turn elements in short oligomeric sequences. Furthermore the insights gained on the structure inducing properties of the f-SAAs 106 and 107, were applied to biologically active systems. A first library of 12 somatostatin analogues was designed under consideration of structure activity relationships. After biological testing (antiproliferation and selective induction of apoptosis on tumor cells) the identified lead structures were further optimized, in a second, larger library. From those libraries several promising drug candidates against both cancer and inflammatory diseases could be extracted. 10 analogues have IC50 values in the low µM-range. 142, 143, 148 and 158 possess antiproliferative and apoptotic activity against several different multidrug-resistant and/or drug-sensitive carcinoma cell lines. Some of these compounds are more active than TT232 135, the only other compound known to show apoptotic and antiproliferative activity against multi drugresistant carcinoma cell lines. Preliminary studies suggest that our compounds selectively exert thTThe nonproteinogenic properties of f-SAAs 106 and 107 should make the compounds physiologically more stable than the purely peptidic TT232 (135), the only other compound known to comparably induce either apoptosis on multidrug resistant tumor cells or to prohibit inflammation by substance P release inhibition. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung neuer, strukturinduzierender Zuckeraminosäuren (SAA), die für die Festphasensynthese und kombinatorische Chemie geeignet sind. Die strukturinduzierenden Eigenschaften dieser SAAs, wurden zunächst durch Synthese und NMR-Strukturuntersuchungen von linearen und cyclischen, gemischten Oligomeren („Foldameren“) nachgewiesen. So liegt z.B. das gemischte Oligomer von β-Alanin und der neuen furanoiden β-SAA als 12/10/12-Helix in CH3CN vor. Die so gewonnenen Erkenntnisse wurden auf biologische Systeme angewendet: Die SAAs wurden als strukturinduzierende Elemente in Somatostatinanaloge eingebaut. Diese zeigten starke Anti-Tumor-Aktivität.

In der vorliegenden Arbeit werden Sekundärstrukturmotive von isolierten Peptiden und Peptid-Aggregaten in der Gasphase analysiert. Zur Untersuchung ihrer intrinsischen Eigenschaften werden die isolierten Peptide durch adiabatische Abkühlung in Molekularstrahlen erzeugt. Durch die Anwendung hochsensitiver Techniken der Doppelresonanzspektroskopie, Resonante zwei Photonen Ionisation (R2PI) und Infrarot/Resonante zwei Photonen Ionisation (IR/R2PI), werden die Peptide und Peptid-Aggregate hinsichtlich ihrer Elektronen – und Schwingungsübergängen analysiert. Die Schwingungsfrequenzen im Bereich der Amid A, I, II Moden und im oberen „Fingerprintbereich“ von Peptiden sind sehr signifikant für die Geometrie des Rückgrates und der Seitenketten, z.B. unterscheiden sich Schwingungen von Gruppen, die an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, sehr stark durch ihre Lage und Intensität gegenüber Schwingungen von frei vorliegenden Gruppen. Ein Vergleich mit berechneten Schwingungsfrequenzen aus ab initio und Dichtefunktionaltheorie Rechnungen ermöglicht eine Zuordnung zu einer bestimmten Struktur. Es werden in dieser Arbeit verschiedene Sekundärstrukturen über die Analyse von geschützten Aminosäuren, Di- und Tripeptiden untersucht. Insbesondere gelang es erstmals, ein ß-Faltblattmodellsystem für ein isoliertes Dimer eines Peptids nachzuweisen. Weiterhin werden zum molekularen Verständnis der Mikrosolvatation Aggregate mit Wassermolekülen betrachtet und somit der Einfluss auf die Sekundärstruktur durch sukzessive Aggregation von Wassermolekülen analysiert. In Kooperation mit Prof. Schrader (Universität Duisburg-Essen) werden Templatmoleküle charakterisiert, um ihre Fähigkeiten zur Anlagerung an schädliche ß-Faltblattstrukturen zu untersuchen, die in sogenannten neurodegenerativen Krankheiten häufig auftreten. Die Effizienz ist sowohl über die Analyse der Zahl und Stärke der inter- und intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen als auch über die gebildete Clusterstruktur untersucht worden. In this work secondary structure motifs of isolated peptides and clusters of peptides have been analyzed in the gas phase. In order to study the intrinsic properties, isolated peptides have been generated by adiabatic cooling in molecular beams. The electronic and vibrational transitions of the peptide and peptide aggregates have been analyzed by applying highly sensitive double resonance techniques, resonance enhanced two photon ionization (R2PI) and infrared/resonance enhanced two photon ionization (IR/R2PI). The frequencies of amide A, I, II modes and the upper fingerprint region of peptides are strongly correlated with the geometry of the backbone and the side chain, e.g. there are significant differences in the intensities and band positions between vibrations of hydrogen bonded and free groups. Comparison with calculated frequencies from ab initio and density functional theory yields assignments to distinct structures. In this work different secondary structures are investigated via analyzes of protected amino acids, di- and tripeptides. For the first time a ß-sheet model system for the dimer of a peptide has been obtained Furthermore, aggregates with water molecules have been investigated to get a description of microsolvation on a molecular level and to analyze the influence on the secondary structure by successive aggregation of water molecules. In cooperation with Prof. Schrader (Universität Duisburg-Essen) template molecules have been characterized in order to test their ability to block on pathogenic ß-sheet structures which are common in so called neurodegenerative diseases. The efficiency has been investigated by analyzing the number and strength of inter- and intramolecular hydrogen bonds as well as the formed cluster structures.

In der vorliegenden Arbeit werden Sekundärstrukturmotive von isolierten Peptiden und Peptid-Aggregaten in der Gasphase analysiert. Zur Untersuchung ihrer intrinsischen Eigenschaften werden die isolierten Peptide durch adiabatische Abkühlung in Molekularstrahlen erzeugt. Durch die Anwendung hochsensitiver Techniken der Doppelresonanzspektroskopie, Resonante zwei Photonen Ionisation (R2PI) und Infrarot/Resonante zwei Photonen Ionisation (IR/R2PI), werden die Peptide und Peptid-Aggregate hinsichtlich ihrer Elektronen – und Schwingungsübergängen analysiert. Die Schwingungsfrequenzen im Bereich der Amid A, I, II Moden und im oberen „Fingerprintbereich“ von Peptiden sind sehr signifikant für die Geometrie des Rückgrates und der Seitenketten, z.B. unterscheiden sich Schwingungen von Gruppen, die an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligt sind, sehr stark durch ihre Lage und Intensität gegenüber Schwingungen von frei vorliegenden Gruppen. Ein Vergleich mit berechneten Schwingungsfrequenzen aus ab initio und Dichtefunktionaltheorie Rechnungen ermöglicht eine Zuordnung zu einer bestimmten Struktur. Es werden in dieser Arbeit verschiedene Sekundärstrukturen über die Analyse von geschützten Aminosäuren, Di- und Tripeptiden untersucht. Insbesondere gelang es erstmals, ein ß-Faltblattmodellsystem für ein isoliertes Dimer eines Peptids nachzuweisen. Weiterhin werden zum molekularen Verständnis der Mikrosolvatation Aggregate mit Wassermolekülen betrachtet und somit der Einfluss auf die Sekundärstruktur durch sukzessive Aggregation von Wassermolekülen analysiert. In Kooperation mit Prof. Schrader (Universität Duisburg-Essen) werden Templatmoleküle charakterisiert, um ihre Fähigkeiten zur Anlagerung an schädliche ß-Faltblattstrukturen zu untersuchen, die in sogenannten neurodegenerativen Krankheiten häufig auftreten. Die Effizienz ist sowohl über die Analyse der Zahl und Stärke der inter- und intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen als auch über die gebildete Clusterstruktur untersucht worden. In this work secondary structure motifs of isolated peptides and clusters of peptides have been analyzed in the gas phase. In order to study the intrinsic properties, isolated peptides have been generated by adiabatic cooling in molecular beams. The electronic and vibrational transitions of the peptide and peptide aggregates have been analyzed by applying highly sensitive double resonance techniques, resonance enhanced two photon ionization (R2PI) and infrared/resonance enhanced two photon ionization (IR/R2PI). The frequencies of amide A, I, II modes and the upper fingerprint region of peptides are strongly correlated with the geometry of the backbone and the side chain, e.g. there are significant differences in the intensities and band positions between vibrations of hydrogen bonded and free groups. Comparison with calculated frequencies from ab initio and density functional theory yields assignments to distinct structures. In this work different secondary structures are investigated via analyzes of protected amino acids, di- and tripeptides. For the first time a ß-sheet model system for the dimer of a peptide has been obtained Furthermore, aggregates with water molecules have been investigated to get a description of microsolvation on a molecular level and to analyze the influence on the secondary structure by successive aggregation of water molecules. In cooperation with Prof. Schrader (Universität Duisburg-Essen) template molecules have been characterized in order to test their ability to block on pathogenic ß-sheet structures which are common in so called neurodegenerative diseases. The efficiency has been investigated by analyzing the number and strength of inter- and intramolecular hydrogen bonds as well as the formed cluster structures.

Filoviren, zu denen das Marburg- (MARV) und das Ebolavirus Zaire (EBOV-Z) gehören, zählen zu den tödlichsten Humanpathogenen, gegen die es weder ein Therapeutikum noch einen Impfstoff gibt. Innerhalb der Mononegavirales besitzen sie das längste Genom (etwa 19 kb) und als einzige Mitglieder neben den Pneumoviren ein viertes Nukleokapsidprotein, VP30. Dieses dient beim EBOV als Transkriptionsaktivator, die Funktion für das MARV ist aber ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurden die cis-aktiven Signale für Replikation und Transkription des MARV, EBOV-Z und Ebolavirus Reston (EBOV-R) untersucht und gemeinsame Motive verglichen. Weiter wurde ein Volle-Länge-Rescue-System für das MARV etabliert, mithilfe dessen die Rolle des VP30 untersucht wurde. Als ein Kooperationsprojekt wurden die inhibitorischen Eigen-schaften synthetischer DNA-Analoga auf die Vermehrung von EBOV-Z in Zellkultur analysiert. Die Sekundärstruktur des Transkriptionsstart-Signal (TSS) des MARV wurde mittels chemischer Modifizierung ermittelt und unterschied sich gravierend von der des EBOV-TSS. Wurde die bei EBOV-Z gebildete Sekundärstruktur zerstört, so war kein VP30 mehr für die Transkription notwendig (Weik et al., 2002). Chimären der beiden Sekun-därstrukturen führten zum Verlust der Transkription und zu starker Reduzierung der Replikationsfähigkeit; VP30 hatte dabei keinen Einfluss auf die Transkription. Durch weitere Experimente konnte gezeigt werden, dass wahrscheinlich die Primärsequenz entscheidend für die Replikation und Transkription ist und nicht die Sekundärstruktur. Mithilfe des rekonstituierten Minigenomsystems für EBOV-Z wurde der genomische Replikationspromotor eingehend untersucht. Es war bereits bekannt, dass zwei Promotorelemente vorliegen, und die dazwischenliegende Sequenz unwichtig war und nur um 6 nts verlängert oder verkürzt werden konnte, ohne die Replikation zu beeinträchtigen (Schlenz, 2002, Weik, 2001). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nur 3 von 8 vorkommenden UN5-Hexameren nötig sind, um Replikation zu unterstützen. Dieses Motiv wurde auch bei EBOV-R und MARV gefunden. Allerdings deuten die Daten darauf hin, dass der genomische Replikationspromotor des MARV nur aus einem Element besteht, in dem die Replikations- und Transkriptionssignale überlappen. Als ein sehr nützliches Hilfsmittel zur detaillierten Untersuchung des MARV wurde ein Volle-Länge-Rescue-System etabliert, in welchem rekombinantes MARV durch Transfektion des Antigenoms und Plasmiden der Nukleokapsidproteine VP30, VP35, NP und L erzeugt werden konnte. Somit war eine gezielte Manipulation des viralen Genoms möglich. Arbeiten mit rekombinanten Viren wurden in Kooperation mit Prof. Volchkov in Lyon durchgeführt. Mithilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass VP30 eine wichtige Rolle für die effiziente Vermehrung des MARV in Zellkultur darstellt, obwohl eher eine strukturelle als katalytische Funktion angenommen wird. Bisher waren solche Untersuchungen nicht möglich, da VP30 im Minigenomsystem keine Funkti-on zukam. Zudem war es möglich, ein rekombinantes MARV zu erzeugen, welches 18 nts des Replikationspromotors des EBOV-Z inseriert hatte. Schließlich wurde eine Inhibition der Vermehrung des EBOV-Z in Zellkultur durch ein gegen die Translationsstart-Sequenz des VP35-Gens gerichtetes, peptidkonjugiertes Phosphorodiamidat-Morpholinooligomer (P-PMO) gezeigt. Die Daten zeigten eine sehr gute prophylaktische Nutzbarkeit, jedoch eingeschränkte Wirkung, wenn das P-PMO nach der Infektion appliziert wurde. Diese Ergebnisse wurden von der Kooperationsgruppe des USAMRIID in Mausexperimenten mit unkonjugierten PMOs bestätigt. Der Einsatz von (P)-PMOs zur Hemmung von VP35 ist ein vielversprechender prophylaktischer und evtl. sogar therapeutischer Ansatz für Filovirusinfektionen., The two filoviruses Marburg (MARV) and Ebolavirus Zaire (EBOV-Z) are two of the most lethal human pathogens. There are currently no cures or vaccines available. Filoviruses have the longest genome within the order Mononegavirales, and along with the Pneumoviruses, possess a fourth nucleocapsid protein (VP30). In the case of EBOV VP30 acts as an activator for transcription whereas its role for MARV is unknown. In this work, the cis-acting signals for replication and transcription of MARV, EBOV-Z and Ebolavirus Reston (EBOV-R) were examined, and common motifs compared. Furthermore, a full-length rescue system for MARV was established, that was used for studies on VP30. In collaboration with the USAMRIID synthetic DNA analogues were analysed for their ability to interfere with replication of EBOV-Z in cell culture. The secondary structure of the transcription start signal (tss) of MARV was determined by chemical modification and was shown to differ significantly from the EBOV-Z tss. Disruption of the secondary structure of the EBOV-Z tss resulted in a transcription independent of VP30. Chimeras of the two secondary structures were hardly replicated and showed no transcriptional activity. Additional experiments supported the notion that rather the primary sequence than the secondary structure is important for replication and transcription. The EBOV-Z-specific minigenome system was used to intensely study the replication promoter. It was already known, that two promoter elements (PE) existed separated by exchangeable sequence. However, the sequence between the two PEs could only be extended or shortened by a multiple of 6 nts without effect on replication. In this work I could show that only 3 out of 8 adjacent Hexamers UN5 were necessary to support minimal replication. This motif is also found in MARV and EBOV-R. The current data, however, suggests that MARV possesses a single promoter in which signals for replication and transcription overlap. As a useful tool to examine MARV in detail, a full-length rescue system was established. Recombinant MARV was generated by transfection of a full-length antigenome along with plasmids encoding the nucleocapsid proteins L, VP30, VP35, and NP. This allowed the introduction of specific mutations into the genome and their effects on the viral life cycle. This project was done in close collaboration with Prof. Volchkov in Lyon. Using this system the role of VP30 was found to be essential to rescue recombinant MARV, although rather a structural than a catalytic function is proposed. Additionally, it was possible to rescue a full-length MARV that contained 18 nucleotides of the EBOV-Z replication promoter. Finally, the inhibition of EBOV-Z replication in cell culture by peptide-conjugated phosphorodiamidate-morpholino oligomers (P-PMOs) was examined. One P-PMO targeted against the translation start sequence of the VP35 gene exhibited good prophylactic properties and even some therapeutic effect when applied postinfection. The results could be verified in the mouse model by collaborators at the USAMRIID. The use of P-PMOs as a prophylactic or even therapeutic approach looks promising.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die beiden membranproximalen Domänen des Signaltransduktors gp130 (gp130D5D6) kloniert, exprimiert, gereinigt und in hoher Konzentration vorgelegt. Die 1H-, 15N- und 13C-Resonanzen dieser Domänen wurden mittels heteronuklearer, dreidimensionaler NMR-Spektroskopie zugeordnet und anhand dieser Daten die Sekundärstruktur bestimmt. Weiterhin wurde die Grundlage für die Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von gp130D5D6 gelegt.

Phylogenetic analysis of nucleotide sequences and amino acid sequences has proven to be extremely powerful in the analysis of genomes. The comparative analysis of coding regions, i.e. regions where the order of nucleotides code for proteins, has been studied extensively. But what if the signal is not sequential? There are numerous examples of RNA genes and motifs where the structure instead of the sequence determines the function (and for sure, there are a lot of unknown ones today). In this case the selective pressure acts on the structure, which conserves structure instead of sequence. In spite of all its success, pure sequence based comparative analysis gets to its limit when structural conservation is of interest. In this thesis, I focus on strategies to align the structure of RNA molecules.

The analysis of RNA secondary structure has become more and more important throughout the last decades after it was recognised that RNA does not only serve as a passive messenger (mRNA), but also as a functional compound of the cell. Furthermore, it was elucidated that mainly the structure rather than the sequence determines the function of such non-protein-coding RNA. This means that two RNA molecules which have low sequence similarity but high structure similarity are likely to have a similar function. The prediction of RNA secondary structure is based on parameters that have been measured in vitro. This results in rather static parameters, that do not incorporate the dynamic change of environment occurring in living organisms. Nevertheless, the use of these parameters, that are summarised in the energy model, gave valuable results, especially for short sequences. Several refinements throughout the years improved the predictions, but still the calculated optimal structure is not guaranteed to correspond to the native one. In this case, and due to the fact that the native structure is feasible under the energy model, it is common practice to additionally calculate suboptimal structures and incorporate these in the study. The set of all suboptimal structures is referred to as the structure space, which actually holds the information needed to answer questions such as: Is the optimal structure also the native one? Are there more than one structure an RNA molecule can adopt? How well-defined is the optimal structure? Major problems in the analysis of the structure space are its size and its shape. The number of suboptimal structures is exponential in the sequence length, which means that for sequences of moderate length the size quickly exceeds several billion. Besides the size, the appearance of the structure space complicates its study. The structure space can be imagined as a rough landscape with valleys, holding local optimal structures, separated by mountains and saddles. This landscape is not smooth but cliffy and complex, which prevents the development of a practical and still intuitive visualisation. In general, the intention of structure space analysis is not its visualisation, but its complexity also hampers approaches to derive specific features hidden in the structure space. Despite these problems, several tools exist that analyse the complete structure space or at least a part of it to answer the aforementioned questions. Among these are MFOLD which produces a subset of all possible structures according to a threshold of structural similarity, SFOLD which samples the structures in a probabilistic fashion and provides a method to identify alternating structures, RNAsubopt to produce all suboptimal structures within a given energy threshold, barriers to identify valleys, mountains and saddles of the structure landscape, and others. My contribution to this area of research is twofold: First, I present paRNAss (prediction of alternating RNA secondary structures) which focuses on the detection of conformational switches and analyses the structure space based on pairwise comparisons. paRNAss has been available since 1997 and I could improve its predictive power as well as its speed which made possible a systematic evaluation. During this evaluation it turned out that paRNAss can even be used to identify more than two competing structures and hence get a deeper insight into the structure space. The second tool I introduce is RNAshapes which facilitates different kinds of analyses. The algorithm makes use of abstract representations of the secondary structure to compute only those that are morphologically dissimilar, i.e. are composed of different structural elements. Structures being morphologically similar are pooled in a class of structures and each class is represented by its best member. The list of these representatives gives a general overview of what is there in the structure space. In addition to this, I introduce an algorithm to compute probabilities of the aforementioned classes of structures. This gives hints to properties such as alternating secondary structures (two classes with similar probabilities) and structural well-definedness (one class with very high probability).

The aim of this thesis is to apply the framework of Algebraic Dynamic Programming (short ADP) to a well known problem with established significance in bioinformatics, to implement the current "state of the art", and finally to go one step further and solve one of the open problems. Ab initio RNA secondary structure folding of a single sequence was chosen as a perfect fit to the requirements. First, because of the compactness of the field, showing a clear path from the first description of the Nearest Neighbor model by Tinoco and others in a Nature paper from 1971, via the base pair maximization algorithm by Nussinov and others in 1978, to the first efficient and complete solution to the free energy minimization problem by Zuker and Stiegler in 1981, and then on to a number of further refinements to date (Tinoco et al., 1971; Nussinov et al., 1978; Zuker and Stiegler, 1981; Wuchty et al., 1999; Lyngsoe et al., 1999). Second, there is a clear description of an open problem in a paper by Zuker and Sankoff in 1984, that to our knowledge has not been solved yet (Zuker and Sankoff, 1984). It is the problem of reducing the structure space of a given RNA to saturated secondary structures whose helices can not be extended any further by legal base pairs.

Die Aktivität von Biooligomeren wird wesentlich beeinflusst von deren molekularer Struktur bzw. Konformation. Eine Einflussnahme auf die Struktur sollte deswegen auch mit einer Aktivitätsveränderung einhergehen, ein „Schalten“ von Struktur somit ein „Schalten“ von Aktivität nach sich ziehen. Alanyl-PNA ist ein Oligopeptid alternierender Konfiguration mit Nukleobasen in β-Position der Alanyl-Einheiten, das durch Wasserstoffbrückenbildung und π-Stacking mit einem komplementären Strang Paarungsduplexe mit β-faltblattartiger linearer Struktur eingeht. Der Einbau eines Alanyl-PNA-Stranges in ein Peptid oder Protein und Zugabe des korrespondierenden Gegenstranges sollte zu einer lokalen Induktion eines β-Faltblattes führen und strukturelle Veränderungen im Gesamtpeptid hervorrufen. Es kann dann von einem molekularen Schalter gesprochen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine vom cyclischen Peptidantibiotikum Gramicidin S abgeleitete 18mer-Peptid-Alanyl-PNA-Chimäre 20 mit eingebautem Alanyl-PNA-Pentamer dargestellt. Es konnte mittels temperaturabhängiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass sich bei Zugabe des komplementären Gegenstranges nichtkovalente Duplexe bilden. CD-spektroskopische Untersuchungen dieses Dimers lieferten keine eindeutigen Beweise für das vorliegen eines β-Faltblattes. Es konnte anhand des humanen Interleukins 8 gezeigt werden, dass der Einbau von Alanyl-PNA durch die Technik der native chemical ligation in größere Peptide möglich ist. Hierfür wurde der N-terminale Thioester 31 des humanen Interleukins hIL8(1-55) durch Expression des Fusionsproteines in E.coli und Expressed Protein Ligation dargestellt. Nach Umsetzung des Thioesters 31 mit einem Alanyl-PNA-Peptid-Hybrid 29, das N-terminal mit einem freien Cystein substituiert ist, wurde durch native chemical ligation ein von dem humanen Interleukin 8 abgeleitetes 77 Aminosäuren enthaltendes Peptid 30 mit eingebauter Alanyl-PNA erhalten. Darüber hinaus wurden mit keinem, einem oder zwei Lysinen substituierte Alanyl-PNA-Hexamere dargestellt und Strukturuntersuchungen unterworfen. Es konnte mittels temperaturabhängiger UV-Spektroskopie gezeigt werden, dass der Einbau zweier Lysine sowohl die Löslichkeit als auch die Bildungskinetik verändert, die Stabilität (Tm-Wert) der Duplexe jedoch unverändert lässt. Diese Hexamere wurden Kristallisationsversuchen unterworfen, bisher konnten noch keine Kristalle erhalten werden. Basierend auf den im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen sollte es in Zukunft darüber hinaus möglich sein, genaueren Aufschluss über die Struktur von Alanyl-PNA zu erhalten. Die Erhöhung der Löslichkeit von Alanyl-PNA durch Einbau zweier Lysine ermöglicht nicht nur weitere Kristallisationsversuche, sondern man gelangt auch in Konzentrationsbereiche, in denen NMR-Untersuchungen an Alanyl-PNA möglich werden, die bisher aufgrund zu schlechter Löslichkeit zu keinen zufrieden stellenden Ergebnissen geführt haben. Durch weitere Optimierung der native chemical ligation und Bereitstellung größerer Mengen von Interleukin 8 Derivaten mit eingebauter Alanyl-PNA sollte es in Zukunft möglich sein, den Einfluss des komplementären Alanyl-PNA-Stranges auf die Struktur des Gesamtsystems und dessen biologischer Aktivität zu untersuchen. Durch Variation und Optimierung der Sequenz und des örtlichen Einbaus der Alanyl-PNA kann so vielleicht das Fernziel eines molekularen strukturellen Schalters für Peptide bzw. Proteine erreicht werden. Ebenso ist es denkbar, dass durch den Einbau von Alanyl-PNA in zwei verschiedene Peptide bzw. Proteine nichtkovalente Protein-Protein-Komplexe erhalten werden können., Activity and properties of biooligomers depend mainly on their molecular structure and conformation. Changing structure causes also a change of activity. Therefore, “switching” structure results in “switching” activity. Alanyl-PNA is an oligopeptide consisting of amino acids with alternating configuration with nucleobases attached to the β-position of an alanyl unit. Addition of a complementary peptide strand induces a β-sheet like conformation in the backbone of the duplex by hydrogen bonding and π-stacking . Incorporation of alanyl-PNA into a peptide or protein and addition of a complementary sequence should induce a β-sheet like structure and produce structural changes in the entire system. For this effect the term molecular switch can be used. In this work a peptide-alanyl-PNA chimera 20 consisting of a sequence of 18 amino acids, which was derived from the cyclic antibiotic Gramicidin S, has been synthesized. It contained a terminal alanyl-PNA pentamere. Using temperature dependent UV-spectroscopy it could be proven that addition of the complementary strand led to noncovalent duplexes. Investigations by CD-spectroscopy did not give clear evidence for the existence of a β-sheet. To accomplish the incorporation of alanyl-PNA into larger peptides the techique native chemical ligation has been applied. Alanyl-PNA has been incorporated into the 77 amino acids containing peptide human interleukine 8 (hIL8). The N-terminal thioester hIL8(1-55) 31 was expressed by a fusion-protein in E.coli and worked up by Expressed Protein Ligation. After reaction of the thioester 31 with an alanyl-PNA-peptide hybrid 29, N-terminally substituted with a free cysteine, a new analogue 30 of hIL-8 could be obtained by native chemical ligation. Furthermore, alanyl-PNA hexamers containing up to two lysines have been synthesized and subjected to structural examinations. Using temperature dependent UV-spectroscopy it could be shown that the incorporation of two lysines not only increased the solubility of the oligomers substantially but also had strong influence on the kinetics of the duplex formation, whereas the stability of the pairing complex (defined by the Tm value) did not change. Attempts to crystallize these hexamers have not been successful up to the present. On the basis of these results it should be possible to obtain in the future more detailed information about the structure of alanyl-PNA. Due to the poor solubility, previous NMR examinations did not give satisfying results. The increase in solubility by addition of a second lysine to alanyl-PNA will allow in future further crystallisation experiments and more promising NMR investigations. By optimization of the native chemical ligation and supply of larger amounts of interleukine 8 derivatives with incorporated alanyl-PNA it should be possible to examine the influence of a complementary alanyl-PNA strand on the structure of the entire system and its biological activity. By variation and optimization of the sequence and the local incorporation of alanyl-PNA moieties the objective of a molecular switch for peptides and proteins might be reached. The incorporation of alanyl-PNA into two different peptides or proteins might also result in the formation of noncovalent protein-protein-complexes mediated by hydrogen bonding.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem Thema Evolutionäre Algorithmen und deren Verwendung für Optimierungsaufgaben. Im ersten Teil der Arbeit werden die theoretischen Grundlagen ausführlich dargelegt, die zum Verständnis der Problemstellung und der vorgeschlagenen Lösungsmöglichkeiten notwendig sind. Dazu gehören die Einführung des Konzeptes von Fitneßlandschaften, deren Eigenschaften sowie die kurze Darstellung bekannter stochastischer Optimierungsverfahren wie z.B. Simulated Annealing. Im Anschluß daran wird auf neue Verfahren - insbesondere gemischte Strategien - eingegangen und diese vergleichend gegenüber den herkömmlichen Verfahren abgegrenzt. Die neu entwickelten Verfahren werden an Modellproblemen getestet, welche im zweiten Teil der Arbeit vorgestellt werden. Verwendet wurden sowohl einfache theoretische Modelle wie Frustrierte Periodische Sequenzen als auch praktisch relevante Probleme wie das der RNA Sekundärstrukturen. Die verschiedenen Modellprobleme werden bezüglich ihrer Eigenschaften und Schwierigkeitsgrade untersucht und miteinander verglichen, um die Effizienz der verwendeten Optimierungsverfahren abschätzen zu können. Der dritte Teil der Arbeit präsentiert wichtige Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten umfangreichen numerischen Simulationen. Es wird demonstriert, wie sensitiv die Optimierungsergebnisse von den verwendeten Parametern der Algorithmen (wie z.B. Ensemblegröße, Temperatur oder Mutationsrate) abhängen und das ein relativ scharf umrissenes evolutionäres Fenster der Parameter existiert, innerhalb dessen die Optimierungsresultate deutlich besser sind. Eine im Rahmen dieser Arbeit entwickelte adaptive Parametersteuerung wird an den im zweiten Teil vorgestellten Modellproblemen getestet und gezeigt, daß es möglich ist, den Optimierungsprozeß automatisch innerhalb des evolutionären Fensters zu halten. Der letzte Teil gibt Einblick in die im Rahmen dieser Arbeit verwendete Computer-Software und das vom Autor entwickelte Programmpaket. Es wird hervorgehoben, daß die in C++ objektorientiert und modular geschriebene Software leicht an andere Optimierungsaufgaben angepaßt werden kann und dank graphischer Benutzeroberfläche auch einfach zu bedienen ist., This work explores Evolutionary Algorithms and their application to optimization tasks. The work's first part gives detailed theoretical background information necessary to understand the problem and proposed solutions. This theoretical part includes the introduction of fitness landscapes, the investigation of their properties, and it briefly reiterates well known stochastic optimization strategies like Simulated Annealing. Finally, new strategies, in particular mixed stategies, are introduced and compared to traditional optimization techniques. In the second part of this work, the newly developed strategies are benchmarked using model problems such as 'Frustrated Periodic Sequences', or the analysis of RNA secondary structures. To evaluate the efficiency of different optimization strategies, the introduced model problems are compared with respect to their difficulty level. The third part of this work presents results of extensive numerical simulations demonstrating how sensitive the investigated algorithms depend on their respective control parameters (ensemble size, temperature, mutation rate). It is shown that there is always a distinct parameter window, the so-called evolutionary window, that clearly leads to improved optimization results. Going back to the model problems introduced in part two, a newly developed adaptive parameter control is presented that automatically keeps the optimization algorithm's parameters within the evolutionary window. In the final part of this work not only the software used, but also the software newly developed by this work's author is illuminated. It is emphasized that the new software was designed highly flexible to allow for easy adaptation to different optimization problems. A graphical user interface is provided for convenience.

Diamond has excellent optical properties including broadband transmissivity, low self-absorption, and a high refractive index, which have prompted its use for optical sensing applications. Thin- film diamond strip waveguides (DSWGs) combined with tunable quantum cascade lasers (tQCLs) providing an emission wave- length range of 5.78–6.35 mm (1735–1570 cm"1) have been used to obtain mid-infrared (MIR) spectra of proteins, thereby enabling the analysis of their secondary structure via the amide I band. Three different proteins were analyzed, namely bovine serum albumin (BSA), myoglobin, and g-globulin. The secondary structure of BSA and myoglobin has a major contribution of a-helices, whereas g-globulins are rich in b-sheet structures, which is reflected in the amide I band. A comparison of the spectra obtained via the combination of the tQCL and DSWG with spectra obtained using conventional Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and a commercial diamond attenuated total reflection (ATR) element has been performed. It is shown that the main features evident in FTIR-ATR spectra are also obtained using tQCL-DSWG sensors., acceptedVersion

eingereicht von Alexander Berghamer Literaturverzeichnis: Seite 43-46 Masterarbeit Paris-Lodron-Universität Salzburg 2020 Abstract in englischer und deutscher Sprache

Diamond has excellent optical properties including broadband transmissivity, low self- absorption and a high refractive index, which have prompted its use in for optical sensing applications. Thin-film diamond strip waveguides (DSWGs) combined with tunable quantum cascade lasers (tQCLs) providing an emission wavelength range of 5.78-6.35 μm (1735-1570 cm-1) have been used to obtain mid-infrared (MIR) spectra of proteins, thereby enabling the analysis of their secondary structure via the amide I band. Three different proteins were analyzed, namely bovine serum albumin (BSA), myoglobin, and γ-globulin. The secondary structure of BSA and myoglobin has a major contribution of -helices, whereas γ-globulins are rich in β-sheet structures, which is reflected in the amide I band. A comparison of the spectra obtained via the combination of the tQCL and DSWG with spectra obtained using conventional Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and a commercial diamond attenuated total reflection (ATR) element has been performed. It is shown that the main features evident in FTIR-ATR spectra are also obtained using tQCL-DSWG sensors., submittedVersion