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The unsaturated carboxylic acid trans-aconitate is an isomer of cis-aconitate, an intermediate of the citric acid cycle, which is synthesized by the aconitase. It is known that trans-aconitate is produced by plants containing sugar and also by bacteria as a toxic substance, since it acts as an inhibitor of aconitase and fumarase. In Ustilago maydis a gene cluster was characterized in the course of this work which allows the fungus to use trans-aconitate as the sole carbon source and also counteracts the toxicity of this metabolite. This gene cluster contains four genes that are regulated together. Two code for transporters that are located in the plasma membrane and in the mitochondria. The characterization of mutants and HPLC measurements of the trans-aconitate degradation showed that the transporter Aip1 located in the cell membrane is necessary to import trans-aconitate into the cells. The mitochondrial transporter Mtt2 is also necessary for the growth of the cells on trans-aconitate as the sole carbon source. In addition an aconitate-delta-isomerase Adi2 and a transcription factor Ram1 are encoded in the cluster. The isomerase Adi2 gave the cluster its name because it is very similar to the isomerase Adi1, which is necessary for itaconic acid biosynthesis in U. maydis (Geiser et al., 2016). Adi2 was identified due to its similarity to Adi1 (Przybilla, 2014). Genetic analyzes in combination with HPLC measurements showed that Adi2 is used for the isomerization of trans-aconitate to cis-aconitate and is also necessary to remove toxic trans-aconitate from the cytosol. The transcription factor Ram1 belongs to the family of Zn(II)2-Cys6 transcription factors and is responsible for the regulation of the Adi2 gene cluster. This family of transcription factors is able to bind conserved DNA motifs using a binuclear zinc cluster. A DNA motif was postulated for the binding of Ram1 to the promoter region of the individual cluster genes. The activation domain of Ram1 is stimulated by the presence of trans-aconitate, which means that Ram1 is only able to initiate transcription of the cluster genes when trans-aconitate is present. The exact mechanism of the effect of trans-aconitate on the transcription factor has not been fully elucidated yet. However, experiments with chimeric transcription factors suggest that binding to DNA is probably not directly influenced by trans-aconitate. In addition, it was shown that glucose can inhibit the expression of the genes of the Adi2 gene cluster independently of Ram1., Die ungesättigte Carbonsäure trans-Aconitat ist ein Isomer von cis-Aconitat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, welches durch die Aconitase synthetisiert wird. Es ist bekannt, dass trans-Aconitat von zuckerhaltigen Pflanzen und auch von Bakterien als Schadstoff produziert wird, da es als Inhibitor der Aconitase und der Fumarase wirkt und daher toxisch sein kann. In Ustilago maydis wurde im Verlauf dieser Arbeit ein Gencluster charakterisiert, der es dem Pilz erlaubt, trans-Aconitat als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen und darüber hinaus der Toxizität dieses Metaboliten entgegenwirkt. In diesem Gencluster befinden sich vier gemeinsam regulierte Gene. Zwei codieren für die Transporter, die sich in der Plasmamembran bzw. in den Mitochondrien befinden. Die Charakterisierung von Mutanten und HPLC-Messungen des trans-Aconitat Abbaus zeigten, dass der in der Zellmembran befindliche Transporter Aip1 notwendig ist, um trans-Aconitat in die Zellen einzuschleusen. Der mitochondriale Transporter Mtt2 ist ebenfalls notwendig für das Wachstum von Zellen auf trans-Aconitat als alleiniger Kohlenstoffquelle. Zudem sind in dem Cluster eine Aconitat-delta-Isomerase Adi2 und ein Transkriptionsfaktor Ram1 codiert. Die Isomerase Adi2 war namensgebend für den Cluster, da sie sehr ähnlich zu der Isomerase Adi1 ist, die für die Itaconsäurebiosynthese in U. maydis notwendig ist (Geiser et al., 2016). Adi2 konnte aufgrund seiner Ähnlichkeit zu Adi1 identifiziert werden (Przybilla, 2014). Genetische Analysen wiederum in Kombination mit HPLC-Messungen zeigten, dass Adi2 für die Isomerisierung von trans-Aconitat in cis-Aconitat verwendet wird und außerdem notwendig ist, um toxisches trans-Aconitat aus dem Cytosol zu entfernen. Der Transkriptionsfaktor Ram1 gehört zur Familie der Zn(II)2-Cys6 Transkriptionsfaktoren und ist für die Regulation des Adi2-Genclusters verantwortlich. Diese Transkriptionsfaktor-Familie ist in der Lage, mithilfe eines binuklearen Zink-Clusters konservierte DNA-Motive zu binden. Für die Bindung von Ram1 in der Promotorregion der einzelnen Clustergene konnte ein DNA-Motiv postuliert werden. Die Aktivierungsdomäne von Ram1 wird durch die Anwesenheit von trans-Aconitat stimuliert, wodurch Ram1 nur dann in der Lage ist, die Transkription der Clustergene einzuleiten, wenn trans-Aconitat vorhanden ist. Der genaue Mechanismus der Wirkung von trans-Aconitat auf den Transkriptionsfaktor konnte noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Experimente mit chimeren Transkriptionsfaktoren legen jedoch nahe, dass vermutlich nicht direkt die Bindung an die DNA durch trans-Aconitat beeinflusst wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Glucose unabhängig von Ram1 die Expression der Gene des Adi2-Genclusters inhibieren kann.

Isoprenyldiphosphat-Synthasen produzieren in jedem lebenden Organismus die Vorläufer für eine Vielzahl von essentiellen Metaboliten des Primär- und Sekundärstoffwechsels. Dabei nutzen sie Isopentenyldiphosphat und Dimethylallyldiphosphat als Bausteine, um Kurzketten-Isoprenyldiphosphate wie Geranyldiphosphat (C10), Farnesyldiphosphat (C15) oder Geranylgeranyldiphosphat (C20) zu produzieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob in höheren Pflanzen, wie der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, auch längerkettigere Isoprenyldiphosphate existieren. Hierbei zeigte sich, dass die AtIDS9 (At3g29430) das 25 Kohlenstoffatome umfassenden Geranylfarnesyldiphosphat synthetisieren kann. Durch eine umfassende Charakterisierung dieses Enzymes konnten zudem ein umfassender Einblick in die Substrat- und Produktspezifität, Kinetik, Lokalisation sowie erste Anhaltspunkte über die biologische Funktion dieses Enzyms gewonnen werden., Isoprenyl diphosphate synthases produce the precursors for a variety of essential metabolites of the primary and secondary metabolism in every living organism. Thereby they uses isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate as building blocks to produce short chained isoprenyl diphosphates such as geranyl diphosphate (C10), farnesyl diphosphate (C15) and geranylgeranyl diphosphate (C20). In the context of this thesis the question was asked, whether longer chained isoprenyl diphosphates exist in higher plants such as the model organism Arabidopsis thaliana. At that it turned out that the AtIDS9 (At3g29430) is able to produce the 25 carbon atoms enclosing geranylfarnesyl diphosphate. A comprehensive analysis of this enzyme revealed detailed information about its substrate and product specificity, kinetics and localization within the plant as well as first hints of its biological function.

Um ihr eigenes Überleben zu sichern und sich Vorteile gegenüber anderen Bewohnern ihrer Umwelt zu verschaffen, haben Mikroorganismen die Fähigkeit entwickelt, bioaktive Sekundärmetabolite zu produzieren. Diese kann sich der Mensch als Antibiotika, Immunsuppressiva oder als Leitsubstanzen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe wie HIV-Proteaseinhibitoren oder Insulinmimetika ebenfalls zu Nutze machen. Damit stellen sie eine wichtige Quelle potentiell nutzbarer Wirkstoffe dar. Große Fortschritte wurden in den vergangenen Jahrzehnten auf dem Gebiet der Erforschung der für die Biosynthese dieser Metabolite notwendigen mikrobiellen Werkzeuge gemacht. Einerseits sind nichtribosomale Peptidsynthetasen und Polyketidsynthasen weit verbreitete Enzyme, die in viele Biosynthesen von Grundstrukturen involviert sind und aufgrund ihrer modularen Struktur viel Spielraum für Manipulationen durch die Synthetische Biologie bieten. Andererseits können Sekundärmetabolite durch Modifikationsenzyme (tailoring enzymes) wie z. B. Prenyltransferasen weiter verarbeitet werden, was ihre biologische Aktivität häufig erhöht. Um diese Enzyme gezielt einsetzen zu können, ist es von essentieller Bedeutung, ihre Struktur und Funktion zu untersuchen und zu verstehen. Zahlreiche prenylierte Bisindolylbenzochinone aus der Gruppe der prenylierten Indol-alkaloide konnten bereits aus Ascomyceten isoliert werden, biochemische Informationen waren bisher allerdings nur für die Biosynthese von Terrechinon A in Aspergillus nidulans verfügbar. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten die putativen Prenyltransferasegene astPT und ATEG_00702 (EAU39348) aus Aspergillus terreus heterolog in Escherichia coli exprimiert und anschließend bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Das rekombinante Protein AstPT katalysierte in Anwesenheit von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP) die N- und C-Prenylierung von Asterrichinon D (AQ D). Als enzymatische Produkte konnten zwei mono- und zwei diprenylierte Substanzen isoliert werden, deren Strukturen mittels NMR-Spektroskopie und Massenspektrometrie aufgeklärt wurden. Wie andere Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie war AstPT in seiner Katalyse unabhängig von Metallionen und folgte der Michaelis-Menten-Kinetik mit einer Michaelis-Konstante von 463 µM und einer Wechselzahl von 0,16 1/s für AQ D bzw. von 33,5 µM und 0,02 1/s für DMAPP. Besonderheiten von AstPT sind die Einführung von Prenyleinheiten an zwei verschiedenen Positionen des Substrates und zum anderen die hohe Spezifität für seine aromatischen Substrate. AstPT akzeptierte weder Aminosäuren noch cyclische Dipeptide, wie sonst typisch für Prenyltransferasen der DMATS-Superfamilie. Hingegen akzeptierte sie vier Hydroxyxanthonderivate als Substrate und katalysierte O-Prenylierungen in Anwesenheit von DMAPP, Geranyl- (GPP) und Farnesyldiphosphat (FPP), was bisher nur für ein Enzym der DMATS-Superfamilie beobachtet werden konnte. Die Michaelis-Konstante für das beste Xanthonderivat wurde mit 17,3 µM bestimmt, allerdings war die Wechselzahl für AQ D um das 160-fache höher als für das Xanthonderivat. EAU39348 konnte AQ D nicht umsetzen, mit Didemethylasterrichinon D (DDAQ D) als aromatisches Substrat war hingegen die Bildung von mehreren Produkten zu beobachten. Die langsame Umsetzung von AQ D durch AstPT und die alleinige Umsetzung von DDAQ D durch EAU39348 deuten auf eine bevorzugte Produktion von DDAQ D-Derivaten in Aspergillus terreus hin, die in deren höherer Bioaktivität begründet sein könnte. Ein drittes putatives Prenyltransferasegen, CHGG_03684, konnte aus Chaetomium globosum kloniert und in verschiedenen Expressionssystemen getestet werden. Unter diesen Bedingungen konnte jedoch kein lösliches Protein erhalten werden. Nach Solubilisierung der Protein-Einschlusskörper mittels Harnstoff wurde eine Renaturierung durch Dialyse versucht. Mit dem erhaltenen Protein und AQ D konnte in Anwesenheit von DMAPP keine Umsetzung beobachtet werden. Des Weiteren wurden vier putative, NRPS-ähnliche Gene aus Aspergillus terreus bzw. Chaetomium globosum mittels PCR amplifiziert. ATEG_02004, ATEG_03563 und CHGG_03687 konnten in den Expressionsvektor pJW24 kloniert werden, der pyrG als Selektionsmarker für die anschließende Transformation trägt. Das Konstrukt mit ATEG_02004 konnte erfolgreich in Aspergillus niger AB 1.13 eingebracht und die Integration in Genom mittels PCR nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Sekundärmetabolit-produktion der Transformanten führte allerdings nicht zur Identifizierung der Funktion von ATEG_02004. In einem weiteren Projekt innerhalb dieser Arbeit wurde die Bedeutung verschiedener Aminosäuren in FtmPT1 untersucht, um den auf der Enzymstruktur basierten Reaktions-mechanismus zu bestätigen. Durch zielgerichtete Mutagenese mittels PCR und anschließende Überproduktion und Aktivitätstests konnte die Beteiligung des Glutamatrests 102 an der Stabilisierung des Indolstickstoffs über Wasserstoffbrückenbindungen und seine Rolle als Protonenakzeptor während der Katalyse gezeigt werden. Der Austausch von Glycin 115 führte zur Änderung der Prenylierungsposition von C 2 nach C 3 unter Entstehung eines Hexahydropyrroloindols. Dies konnte sowohl für das natürliche Substrat von FtmPT1, Brevianamid F, als auch für verschiedene cyclische Dipeptide nachgewiesen werden. Damit wurde die essentielle Rolle von G115 in der Prenylierung in FtmPT1 aufgezeigt. Mutationen der entsprechenden Aminosäure in CdpC3PT, A115, senkten nur die Aktivität. Mit dem Austausch von Tyrosin 205 gegen Phenylalanin konnte die Akzeptanz von sechs Hydroxynaphthalinderivaten gegenüber dem Wildtypprotein verbessert werden., Microorganisms developed the capability to produce bioactive secondary metabolites to ensure their own viability and get evolutionary advantages. These metabolites can be used as antibiotics or immunosuppressive drugs, but also as lead structures for the development of new drugs like HIV protease inhibitors or insulin mimetics. Therefore, microorganisms are an important source of potentially active pharmaceutical ingredients. Significant progress has been achieved in the past decades in the research on the biosynthesis of these compounds. On the one hand, nonribosomal peptide synthetases and polyketide synthases are common enzymes involved in the biosynthesis of the backbones of numerous metabolites and their module-based structure represents a target for manipulations with the means of synthetic biology. On the other hand, secondary metabolites can be further modified by tailoring enzymes like prenyltransferases which often leads to a higher biological activity. It is of particular importance to investigate these structures and to understand their functions in order to make use of those enzymes. Many prenylated bisindolylbenzoquinones belonging to prenylated indole alkaloids have been isolated from ascomycetes, but biochemical information has been available only for the biosynthesis of terrequinone A in Aspergillus nidulans prior to this thesis. In this thesis the putative prenyltransferase genes astPT and ATEG_00702 (EAU39348) from Aspergillus terreus were expressed heterologously in Escherichia coli and subsequently purified to near homogeneity. The recombinant protein AstPT catalysed the N- and C-prenylation of asterriquinone D in the presence of dimethylallyldiphosphate (DMAPP). The enzyme products, two mono- and two diprenylated compounds, were isolated and their structure was elucidated by NMR spectroscopy and mass spectrometry. As other prenyltransferases from the DMATS-superfamily, AstPT was not dependent on the presence of metal ions for its catalytic activity. The reaction apparently followed Michaelis-Menten kinetics and the Michaelis constant was determined at 463 µM with a turnover number at 0.16 s-1 for AQ D and at 33.5 µM and 0.02 s 1 for DMAPP, respectively. Special features of AstPT were the introduction of prenyl moieties at two distinct sites of the substrate and its high specificity towards its aromatic substrate. It accepted neither amino acids nor cyclic dipeptides, which are typical substrates of prenyltransferases of the DMATS-superfamily. However, it accepted four hydroxyxanthone derivatives as substrates and catalysed O-prenylations in the presence of DMAPP but also from geranyl- (GPP) and farnesyldiphosphate (FPP). This phenomenon has only been observed for one enzyme from this group before. The best accepted xanthone derivative had a Michaelis constant at 17.3 µM, but the turnover number for AQ D was 160 times higher than for this hydroxyxanthone. EAU39348 was not able to convert AQ D. Using didemethylasterriquinone D (DDAQ D) as aromatic substrate, the formation of several products was observed. The slow conversion of AQ D by AstPT and the exclusive acceptance of DDAQ D by EAU39348 may indicate that the production of DDAQ D derivatives is preferred in Aspergillus terreus. The reason for this might be the stronger biological activities of DDAQ D derivatives in comparison to AQ D derivatives. A third putative prenyltransferase gene, CHGG_03684, was cloned from Chaetomium globosum and overproduction was tested in different expression systems. Unfortunately, no soluble protein was obtained under these conditions. An attempt of renaturation via dialysis was made after solubilisation of inclusion bodies with urea, but no activity was observable after incubation with AQ D and DMAPP. Furthermore, four putative NRPS-like genes from Aspergillus terreus and Chaetomium globosum were amplified via PCR. ATEG_02004, ATEG_03563 and CHGG_03687 were cloned into the expression vector pJW24 containing pyrG as a selection marker for subsequent transformations. The construct with ATEG_02004 was successfully trans-ferred into Aspergillus niger AB 1.13 and the genomic integration was confirmed via PCR. The function of ATEG_02004 could not be identified by investigation of the produced secondary metabolites. In addition, the importance of several amino acid residues in FtmPT1 was studied in this thesis to support the proposed reaction mechanism, which is based on the enzyme structure. The involvement of glutamate 102 in the stabilization of the indole nitrogen and its role as proton acceptor during catalysis was shown in activity assays after site-directed mutagenesis and overproduction of the proteins. Exchange of glycine 115 for threonine led to a shift of the prenylation position from C 2 to C 3 and the introduction of a hexahydropyrroloindole. This was observed by using the natural substrate brevianamide F as well as different cyclic dipeptides. These results revealed the essential role of G115 in the prenylation of FtmPT1. Mutation of the corresponding amino acid in CdpC3PT did not have any effect on the prenylation position and simply decreased the activity. The exchange of tyrosine 205 for phenylalanine increased the acceptance of six hydroxynaphthaline derivatives.

Hydroxyzimtsäureester und -amide, z.B. Hydroxycinnamoylchinat, Hydroxycinnamoylshikimat, Hydroxycinnamoyltyramin und Rosmarinsäure, sind im Pflanzenreich sehr weit verbreitet. Pflanzen synthetisieren diese Stoffe zur Abwehr gegen Bakterien oder Pilze, nutzen sie aber auch als UV-Schutz. Die Rosmarinsäuresynthase (RAS, Hydroxy-cinnamoylCoA:Hydroxyphenyllactat Hydroxycinnamoyltransferase) ist für die Biosynthese der Rosmarinsäure (RA), einem wichtigen phenolischen Inhaltsstoff der Buntnessel (Coleus blumei), essentiell. Zur Kristallisation und Strukturanalysen des RAS-Proteins wurde RAS-cDNA heterolog in E. coli exprimiert. Da das Protein hauptsächlich in inclusion bodies vorliegt, wurde eine Rückfaltung und Resolubilisierung durchgeführt. Auf Grund der geringen Aktivität wurde das RAS-Protein in SoluBL21TM E. coli-Zellen heterolog exprimiert. Nach Aufreinigung durch Gelpermeationschromatographie konnte aktives, sauberes Protein für Kristallisationsversuche verwendet werden. Es erfolgte jedoch kein Kristallwachstum. RAS, HST (Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat Hydroxycinnamoyltransferase), die zur Bildung von Lignanen und Monolignolen wichtig ist, und HQT (Hydroxycinnamoyl-CoA:Chinat Hydroxycinnamoyltransferase), ein Enzym der Chlorogensäure (CA)-Biosynthese, sind wichtige Vertreter der Hydroxycinnamoyltransferasen (HCTs). Ein Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung verschiedener HCTs in dem Efeublättrigen Gundermann (Glechoma hederacea). Die krautige, mehrjährige Pflanze ist in Europa, Asien und Amerika beheimatet und kann als interessantes Untersuchungsobjekt angesehen werden, da sie RA, CA und Kaffeesäure akkumuliert. Eine partielle cDNA-Sequenz, die möglicherweise für eine Hydroxycinnamoyl-CoA:Shikimat/Chinat Hydroxycinnamoyltransferase kodiert, konnte aus Glechoma herderacea isoliert werden. Außerdem wurden die RA-, CA- und Kaffeesäuregehalte, sowie die Transkriptmenge der RAS, HST und einer unbekannten HCT in Blättern, Blüten, Stängeln und Wurzeln bestimmt. Die untersuchten Transkripte konnten in allen Organen, außer in Wurzeln, nachgewiesen werden. Die Blüten akkumulierten 12,5% RA, während der Gehalt in Blättern, Stängeln und Wurzeln bei etwa 1% lag. Darüber hinaus wurde die Akkumulation der CA, RA und Kaffeesäure und außerdem die spezifische Aktivitäten der RAS und der Phenylalanin Ammoniak-Lyase (PAL) in einer Suspensionskultur von Glechoma hederacea bestimmt. Während des Untersuchungszeitraums von 14 Tagen wurden Wachstums- und Mediumsparameter, sowie der Sekundärmetabolismus untersucht. Die maximale PAL-Aktivität konnte an Tag 5 und die maximale RAS-Aktivität an Tag 8 bestimmt werden. RA war im Vergleich mit den anderen Sekundärmetaboliten mit fast 26% an Tag 7 am stärksten vertreten. In einem anderen Projekt wurden die spezifische Aktivität und Substratspezifität von bereits konstruierten CbRAS/HST- und CbHST/RAS-Chimären analysiert. Die Kristallstrukturanalyse verschiedener HCTs zeigt, dass sie aus zwei ungefähr gleich großen Domänen aufgebaut sind. Durch den Austausch der beiden Domänen konnten die Chimären synthetisiert werden. Die Aktivitätstests zeigten geringe RAS-Aktvität bei beiden Chimären, wohingegen keinerlei HST-Aktivität gemessen werden konnte. Melissa officinalis gehört wie die beiden vorher erwähnten Pflanzen zur Familie der Lamiaceae (Unterfamilie Nepetoideae) und dient aufgrund des Gehalts an ätherischem Öl und Phenolcarbonsäuren als Arzneipflanze. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von geringen Ozonkonzentrationen auf den Primär- und Sekundärstoffwechsel untersucht. Die Melissenpflanzen wurden geringen Ozonkonzentrationen (80 ppb, 5 h) ausgesetzt, da verschiedene Studien gezeigt haben, dass erhöhte Hintergrundkonzentrationen genauso schädlich wie Ozonspitzenkonzentrationen sein können. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12 und 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es wurden Änderungen der photosynthetischen Funktionen bestimmt, außerdem wurden ökophysiologische, biochemische und strukturelle Parameter untersucht. Nach Ende der Begasungsperiode konnten makroskopisch keinerlei Schäden erkannt werden, doch auf mikroskopischer Ebene zeigten sich nekrotische Bereiche in den Blättern. Auch wurden die photosynthetischen Funktionen stark beeinflusst. Verschiedene Enzyme, z.B. PAL, Hydroxyzimtsäure:Coenzym A Ligase (4CL), Tyrosin Aminotransferase (TAT) und RAS, sind an der Biosynthese der RA beteiligt. Durch quantitative Real-time-PCR wurden die Transkriptionslevel dieser Gene in Melissa officinalis untersucht. Es erfolgte eine schnelle Hochregulierung aller Gene, aber 24 h nach Beginn der Ozon-Begasung waren nur noch RAS und PAL hochreguliert. Die spezifische Aktivität der RAS korrelierte mit einem Absinken des RA-Gehalts, wohingegen die PAL-Aktivität einen Anstieg um 163% nach 12 h aufwies. In einem zweiten Begasungsexperiment unter den gleichen Bedingungen wurden antioxidative Effekte in der Zitronenmelisse untersucht. Die Probenahme erfolgte 0, 3, 5, 12, 24 und 48 h nach Beginn der Ozon-Begasung. Es konnten ein signifikanter Anstieg an Ascorbat, Dehydroascorbat und Gesamtascorbat, sowie ein biphasischer Verlauf des Redoxstatus festgestellt werden. Ein hohes Radikalfängerpotential korrelierte mit einem hohen Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen und einem hohen Carotinoidgehalt. Außerdem stiegen der Gehalt an Wasserstoffperoxid und Prolin. Die Bestimmung der Katalaseaktivität zeigte einen biphasischen Verlauf mit einem Anstieg nach 5 h und einem Abfall nach 48 h. Zusammenfassend verdeutlichen diese Ergebnisse den Einfluss von Ozonstress auf die Arzneipflanze Melissa officinalis.

In der vorliegenden Dissertation wurden Arbeiten zur biochemischen Charakterisierung der SAM-abhängigen N-Methyltransferase FgaMT aus A. fumigatus sowie verschiedener putativer Prenyltransferasen unterschiedlicher Aspergillen durchgeführt. Das putative Gen fgaMT, bestehend aus zwei Exons von 272 bp und 748 bp, getrennt durch ein Intron von 72 bp, wurde in dem Biosynthese-Gencluster von Fumigaclavin C in A. fumigatus identifiziert. Das abgeleitete Protein FgaMT besteht aus insgesamt 339 Aminosäuren und weist eine molekulare Masse von 38.1 kDa auf. Der codierende Abschnitt dieses Gens konnte per PCR erfolgreich aus cDNA amplifiziert werden. Nach Klonierung in den Expressionsvektor pQE60 wurde das entstandene Expressionskonstrukt pOR15 mit dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ transformiert. Die Überexpression des fgaMT-Gens erfolgte bei 37 oC, 200 rpm und 1 mM IPTG Endkonzentration im Medium. Das lösliche FgaMT-His6 wurde bis zur Homogenität aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Mit Hilfe von Enzymassays wurde bewiesen, dass FgaMT in Anwesenheit von S-Adenosylmethionin (SAM) als Co-Substrat die Methylierung von 4-Dimethylallyltryptophan (4-DMAT) an der NH2-Gruppe katalysiert. Das Produkt dieser Reaktion wurde durch Analyse per NMR und Massenspektroskopie eindeutig als 4-Dimethylallylabrin nachgewiesen. Da FgaMT 4-DMAT, nicht aber L-Tryptophan als Substrat akzeptierte, konnte nachgewiesen werden, dass FgaMT den zweiten Schritt in der Biosynthese von Ergotalkaloiden katalysiert. Das Enzym benötigt keine Metall-ionen für seine enzymatische Aktivität und weist eine relativ hohe Substratspezifität gegenüber einem Prenylrest an Position C-4 des Indolringes auf. Derivate von 4-DMAT mit Modifikationen am Indolring wurden ebenfalls von FgaMT als Substrate akzeptiert. Sogar 4-Methyl-L-tryptophan wurde von FgaMT umgesetzt. Die KM-Werte wurden mit 0,12 mM für 4-DMAT und 2,4 mM für SAM bestimmt. Die Umsatzrate betrug 2,0 s-1. Durch eine Analyse über FPLC konnte gezeigt werden, dass FgaMT als Homodimer wirkt. Das putative Prenyltransferasegen NFIA_112230 konnte von dem von mir betreuten Bachelor-Studenten Andreas Schweitzer aus genomischer DNA von N. fischeri NRRL181 amplifiziert und mit dem Expressionsvektor pQE60 kloniert werden. In Fortführung dieses Projektes wurde das Gen von mir in dem Stamm E. coli XL1 Blue MRF´ erfolgreich überexprimiert und das abgeleitete, rekombinante Enzym EAW20699-His6 isoliert. Das Protein konnte mit einer molekularen Masse von ca. 50 kDa fast bis zur Homogenität aufgereinigt werden. Um das natürliche Substrat von EAW20699 zu identifizieren, wurde eine Vielzahl von Enzymassays mit unterschiedlichen Substraten durchgeführt und über HPLC analysiert. Bisher konnte jedoch noch keine Prenylierungsaktivität nachgewiesen werden. Die beiden putativen Prenyltransferasegene AN9229-PT1 und AN9229-PT2 aus A. nidulans sowie das Gen ATEG_03092.1 aus A. terreus, ebenfalls für eine Prenyltransferase kodierend, wurden erfolgreich durch Fusions-PCR aus Fosmiden bzw. gDNA der entsprechenden Aspergillus-Stämme amplifiziert und in die beiden E. coli Expressionsvektoren pQE60 und pHis8, sowie im Falle von AN9229-PT2, auch in den Hefevektor pYES2/NT C kloniert und mit den entsprechenden Wirtsstämmen transformiert. Die erfolgreiche Klonierung konnte durch die Sequenzierung der Expressionskonstrukte bei allen drei Prenyltransferasegenen verifiziert werden. Die Überexpression der Gene war in dem für die Expression von pQE60-Konstrukten optimierten Wirtsstamm E. coli M15 [pREP4] ebenfalls erfolgreich, wobei die überproduzierten Proteine jedoch anscheinend zu “inclusion bodies“ aggregierten, ausfielen und nicht mehr ohne Weiteres isoliert und gereinigt werden konnten. Im Falle der Überexpression von AN9229-PT2 konnte aber durch Kultivierung unter sehr milden Bedingungen (niedrige Kultivierungstemperatur und Dauer, Induktion durch geringe IPTG-Konzentration) bzw. durch Aufreinigung mit Laurylsarcosin, das Protein in geringer Menge isoliert werden. Die Enzymassays mit den so gewonnenen Proteinen, wie auch durchgeführte Assays mit dem Rohextrakt, zeigten bisher aber noch keine Prenyltransferaseaktivität. Auch Enzymassays mit Rohextrakten der beiden anderen Prenyltransferasen AN9229-PT1 und EAU36366 wiesen auf keine enzymatische Aktivität hin.

Das Benzoxazinoid DIMBOA stellt einen wichtigen Sekundärmetaboliten der generellen pflanzlichen Abwehr in Zea mays dar. Die DIMBOA-Biosynthesegene (Bx-Gene) zeigen ein ähnliches Expressionsmuster. Ihre Transkription wird daher möglicherweise durch gleiche Transkriptionsfaktoren aktiviert. In einer vergleichenden Analyse der Bx-Gen-Promotoren wurde ein konserviertes Bx-Sequenzelement identifiziert. Es wurden erstmals zwei Transkrip-tionsfaktoren der HD-Zip-Klasse I aus Mais isoliert. Beide Proteine sind in der Lage Homo- und Heterodimere zu bilden und wirken in vitro als Aktivatoren der Genexpression. Aufgrund ihrer spezifischen Bindung an das konservierte Bx-Sequenzmotiv in verschiedenen in-vitro- und in-vivo-Systemen stellen beide Gene interessante Kandidaten für Transkriptionsfaktoren der Bx-Gene dar. The secondary metabolite DIMBOA belongs to the class of benzoxazinoids and represents an important part of general plant defence in Zea mays. The DIMBOA biosynthesis genes (Bx genes) show a similar expression pattern. Their transcription might therefore be activated by the same transcription factors. A comparative analysis of the Bx promoters led to the identifi-cation of a conserved Bx sequence element. Two transcription factors belonging to class I of HD-Zip proteins could be isolated from maize for the first time. Both proteins are able to form homo- and heterodimers and function as activators of gene expression in vitro. As they show specific binding to the conserved Bx element in vitro and in vivo, both proteins are interesting candidates as transcriptional regulators of Bx gene expression.

Modulare Polyketidsynthasen (PKS) sind Multienzymsysteme des bakteriellen Sekundärstoffwechsels. An ihnen läuft eine schrittweise Biosynthese vielfältiger Kohlenstoff-Gerüste ab, die von einfachen Carbonsäure-Einheiten ausgeht. Polyketid-Verbindungen zeigen eine große Bandbreite pharmazeutisch interessanter Aktivitäten. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Evolutionsstudien durchgeführt. Zunächst wurden die phylogenetischen Beziehungen zwischen modularen PKS und anderen PKS-Systemen sowie Fettsäuresynthasen untersucht, wodurch ihre zentrale Stellung innerhalb eines langen Evolutionsprozesses gezeigt werden konnte. Eine detaillierte Analyse der Phylogenien von Domänen bakterieller modularer PKS ergab, dass das Ausmaß an Genduplikationen, Genverlusten und Ereignissen horizontalen Gentransfers zwischen den verschiedenen Bakteriengruppen beträchtlich variiert. Aus der Genomsequenz des Actinobakteriums Streptomyces avermitilis wurden die Phylogenien aller Domänentypen rekonstruiert. Der Vergleich dieser Einzelphylogenien ermöglichte es, eine Reihe von homologen Rekombinationsereignissen aufzufinden. Homologe Rekombination scheint der Hauptmechanismus zu sein, auf dem die Strukturvielfalt der Polyketide in Bakterien beruht. Mit Hilfe eines „genome mining“-Ansatzes konnte im Genom des Cyanobakteriums Nostoc punctiforme eine Reihe von Biosynthese-Clustern, die zu den PKS und nichtribosomalen Peptidsynthetasen gehören, identifiziert werden. Durch chromatographische und massenspektrometrische Analysen von Zellextrakten und Kulturüberständen konnten einige der Biosynthese-Cluster bestimmten Metaboliten zugeordnet werden. Eines der Cluster wurde hinsichtlich des produzierten Metaboliten und der Regulationsstruktur eingehender charakterisiert. Die Folgerungen aus den gewonnen Ergebnissen werden im allgemeinen Zusammenhang der Evolution metabolischer Diversität ausführlich diskutiert., Modular polyketide synthases (PKS) are multienzym systems of bacterial secondary metabolism. They perform a stepwise biosynthesis of diverse carbon skeletons from simple carboxylic acid units. Polyketide compounds possess a wide range of pharmaceutically interesting activities. In this study, a series of evolutionary analyses was performed. Initially, the phylogenetic relationships between modular PKS and other PKS systems as well as fatty acid synthases were investigated revealing their central position within a long evolutionary process. In detail reconstruction of the phylogenies of bacterial modular PKS domains demonstrated that the extent of gene duplications, gene losses and horizontal gene transfer events varies considerably between different bacterial groups. Using the genome sequence of the actinobacterium Streptomyces avermitilis the phylogenies of all domain types were reconstructed. Comparison of these phylogenies allowed for detecting numerous events of homologous recombination, which appears to be the main mechanism underlying polyketide structural diversity in bacteria. A genome mining approach revealed a number of biosynthesis clusters of the PKS and nonribosomal peptide synthetase type in the genome of the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Cell extracts and culture supernatants were analysed by means of liquid chromatography and mass spectrometry and some of the biosynthesis clusters could be assigned to specific metabolites. One of the clusters was characterised in greater detail regarding the produced metabolite and the cluster’s regulatory structure. The implications of the results are extensively discussed within the general context of the evolution of metabolic diversity.

Die Benzoxazinone DIBOA und DIMBOA sind Sekundärmetabolite der generellen Pflanzenabwehr. Die DIMBOA-Biosynthese zweigt von der Tryptophan-Biosynthese ab und ist in Zea mays fast vollständig aufgeklärt. Eine umfassende Expressionsanalyse der biosynthetischen Gene wurde auf RNA- und Proteinebene durchgeführt. Das entwicklungsspezifische Expressionsmuster der DIMBOA-Biosynthesegene ist für die drei bei Mais vorliegenden Wurzeltypen identisch. In den Differenzierungszonen sind die DIMBOA-Biosynthesegene am stärksten ausgeprägt. Die von diesem Expressionsmuster abweichende Verteilung von DIMBOA im Wurzelgewebe lässt einen Transport des Metaboliten vermuten. The Benzoxazinoids DIBOA and DIMBOA are secondary metabolites of grasses that function as natural pesticides. The biosynthesis of the benzoxazinoid pathway has been elucidated in maize (Zea mays) and branches off the tryptophan biosynthesis pathway. An extensive expression analysis of the biosynthesis genes was carried out on RNA and protein level. The development specific expression pattern of the DIMBOA biosynthesis genes is identical in all three existing root types of maize. The highest expression of the DIMBOA biosynthesis genes was found in the differentiation zone, whereas the highest amount of DIMBOA was found in the root tip. This leads to the assumption that the metabolite is being transported.

In der vorliegenden Arbeit standen die an der Biosynthese der Cardenolide in Digitalis und Isoplexis beteiligten Enzyme _5-3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3ß-HSD) und Progesteron-5ß-Reduktase (5ß-POR) im Mittelpunkt der Untersuchungen. Unter Verwendung von spezifischen Primern und DNAs bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten wurden die 5ß-POR Gene aus 19 Digitalis-Spezies, bzw. Subspezies und 4 Isoplexis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert. Sowohl die erhaltenen 5ß-POR Nukleotidsequenzen, sowie die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzenwiesen mit 96 % Homologie ein hohes Maß der Übereinstimmung auf. Alle klonierten 5ß-POR Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die durchgeführte Southern-Blot-Analyse konnte die 5ß-POR in D. lanata als ein Mitglied einer kleinen Genfamilie identifizieren. Zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen der Digitalisund Isoplexis-Arten wurde ein Phylogramm basierend auf den 5ß-POR Gensequenzen ausgewählter Digitalis- und Isoplexis-Spezies erstellt. Um die 5ß-POR aus D. lanata weiter charakterisieren zu können, wurde das Enzym als His-tag Fusions-Protein in E. coli heterolog überexprimiert (r5ß-POR). Bei optimalen Expressionsbedingungen war es möglich, die r5ß-POR in löslicher und funktioneller Form zu exprimieren. Die nativ His-tag gereinigte r5ß-POR wurde bezüglich ihrer Substratspezifität, kinetischen Parameter und biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Zur Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms wurde sowohl r5ß-POR, als auch SeMet-r5ß-POR hergestellt. Unter Berücksichtigung der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften wurde die 5ß-POR der Enzym-Superfamilie der Short- Chain-Dehydrogenases/Reductases (SDR) zugeordnet. Zur Klonierung der 3ß-HSD wurden PCRs, bzw. RT-PCRs mit spezifischen Primern und DNAs, bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten durchgeführt. Es konnten die 3ß-HSD Gene aus 7 Digitalis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert werden. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen waren, ebenso wie die daraus abgeleiteten 3ß-HSD Aminosäuresequenzen, zu 95 % homolog. Die klonierten 3ß-HSD Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die 3ß-HSD aus D. lanata konnte als His-tag Fusions-Protein in E. coli funktionell überexprimiert werden (r3ß-HSD). Nach nativer His-tag Reinigung wurde die r3ß-HSD charakterisiert. Aufgrund der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften der 3ß-HSD konnte das Enzym, wie die 5ß-POR, als ein Mitglied der Short-Chain-Dehydrogenase/Reductase Superfamilie (SDR) eingeordnet werden. This thesis focused on the enzymes 5-3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß-HSD) and progesterone 5ß-reductase (5ß-POR), both involved in cardenolide biosynthesis in the genera Digitalis and Isoplexis. 5ß-POR genes from 19 Digitalis species/subspecies and 4 Isoplexis species were amplified, cloned and sequenced, using specific primers and corresponding DNA or cDNA, respectively. The nucleotide sequences as well as the deduced amino acid sequences showed a high degree of homology (96 %). All 5ß-POR sequences obtained were published in GenBank NCI Database. Southern blot analysis identified 5ß-POR from D. lanata to be a member of a small gene family. Using 5ß-POR genes of selected Digitalis and Isoplexis species, a phylogram was constructed, elucidating phylogenetic relationships between the genera Digitalis and Isoplexis. With a view to characterising 5ß-POR from D. lanata further, the enzyme was heterologously expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r5ßPOR). Optimised conditions for protein expression facilitated the expression of r5ß-POR in a soluble and functional form. The His-tagged r5ß-POR was purified under native conditions and afterwards characterised with regard to substrate specificity, kinetic constants and biochemical properties. To elucidate the 3-D structure of the enzyme, r5ß-POR as well as SeMet-r5ß-POR was produced. Taking the structural and biochemical properties of the enzyme into account, 5ß-POR was identified as a new member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR). With the purpose of cloning 3ß-HSD genes from Digitalis and Isoplexis, PCR/RTPCR amplifications were carried out using specific primers and DNA or cDNA of several Digitalis and Isoplexis species, respectively. In this process 3ß-HSD genes from 7 Digitalis species were successfully amplified, cloned and sequenced. The nucleotide sequences obtained as well as the amino acid sequences deduced showed a high degree of homology (95 %). All 3ß-HSD sequences have been published in GenBank NCI Database. Subsequent 3ßHSD from D. lanata was functionally expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r3ß-HSD). After purification of the recombinant enzyme under native conditions, r3ß-HSD was characterised. Structural and biochemical properties of the 3ß-HSD classified this enzyme, as in the case of 5ß-POR, as a member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR).

In dieser Arbeit wurde die Regulation des Shikimatstoffwechsels bei der europäischen Buche unter dem Einfluß von Ozon untersucht. Für jedes der sieben Enzyme des Shikimatstoffwechsels wurden putative cDNA-Sequenzen ermittelt und für die Genexpressionsstudien verwendet. Im Verlauf mehrerer Expositionsversuche mit 3- bis 4-jährigen Buchen wurde eine deutliche ozonbedingte Induktion einzelner Gene des Shikimatstoffwechsels beobachtet. Durch Westernblot-Analysen wurden diese Ergebnisse für ausgewählte Enzyme auch auf Proteinebene überprüft. Darüber hinaus wurden ozoninduzierte subtraktive cDNA-Banken erstellt und die Akkumulation einzelner Sekundärmetabolite und Signalsubstanzen untersucht. Die Befunde dieser Arbeit sprechen für eine streßbedingte Umsteuerung zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel in der europäischen Buche unter dem Einfluß von Ozon. The main focus of this work was to evaluate the influence of abiotic stress on the regulation of the shikimate pathway in European beech. For each enzyme involved in the shikimate pathway putative cDNA sequences were cloned and used as probes for gene expression analysis. In the course of several exposition experiments with beech saplings a significant induction was found for some of these genes. These results were confirmed on protein level for selected enzymes. Furthermore ozone induced SSH cDNA libraries were constructed and the accumulation of secondary metabolites and signal substances was analysed. Altogether ozone seems to induce a change in metabolite allocation between primary and secondary metabolism in European beech.

Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Expression und Funktion einer Chalconsynthase, O-Methyltransferase und Glucosyltransferase, die im Fruchtreifungsprozess bei der Biosynthese von Sekundärmetaboliten in Erdbeeren (Fragaria spp.) eine Rolle spielen. Ein Gegensinn Phänotyp einer reifekorreliert exprimierten Chalconsynthase von Fragaria x ananassa wurde chemisch-analytisch auf Veränderungen im Sekundärmetabolismus untersucht. Weiterhin sind Erdbeerpflanzen mit einem Sinn- und Gegensinnkonstrukt eines O-Methyltransferase-Gens, dessen Produkt in vitro o-Diphenolverbindungen und 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon methyliert transformiert worden. Die entstandenen transgenen Erdbeerpflanzen wurden mittels quantitativer Echtzeit Polymerase Kettenreaktion (QRT-PCR) auf veränderte Expressionslevel und chemisch-analytisch auf Veränderungen der Mengen der Sekundärmetabolite untersucht. Schließlich ist das Substratspektrum einer klonierten und heterolog exprimierten Fragaria x ananassa Glucosyltransferase (FaGT2) ermittelt worden. Die Expression von FaGT2 in den Früchten ist reifekorreliert, mit einem Maximum bei rot werdenden Früchten. Um die Funktion von FaGT2 in planta zu untersuchen wurden transgene Erdbeerpflanzen hergestellt und analysiert, die das FaGT2 Gen in Sinn- oder Gegensinn-Richtung enthielten. This work presents novel insights into the expression and function of a chalconsynthase, an O-methyltransferase and a glucosyltransferase, all of which play a role in the biosynthesis of secondary metabolites in strawberry (Fragaria spp.) during fruit ripening. An antisense phenotype of a ripening related chalconsynthase from Fragaria x ananassa was investigated using analytical methods. In addition, strawberry plants were transformed with an O-methyltransferase gene in sense and antisense direction, whose product is capable of methylating o-diphenols and 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone. The resulting transgenic strawberry plants were analyzed for changes in expression level using quantitative real time polymerase chain reaction (QRT-PCR) and for changes in secondary metabolites by analytical methods. Finally, after sequencing, cloning and heterologous expression, substrate specifity of a Fragaria x ananassa glucosyltransferase (FaGT2) was tested. FaGT2 expression is ripening-related, peaking in pink fruit. In order to investigate the function of FaGT2 in planta, transgenic strawberry plants were produced and analyzed, containing FaGT2 in either the sense or antisense direction.

Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der molekularen Funktionsweise von Polyketidsynthasen (PKS) zu leisten. Hierzu wurden Mutagenesestudien sowie biochemische Untersuchungen an Chalkonsynthase (CHS) und Acridonsynthase (ACS) aus Ruta graveolens durchgeführt. Neben den bereits vorliegenden Enzymen aus Ruta sollte die Klonierung weiterer PKS aus Dictamnus albus Vergleiche in einem homologen System ermöglichen. Die Umwandlung der Ruta-ACS in eine funktionelle CHS wurde erfolgreich abgeschlossen. Es konnte gezeigt werden, dass es mit nur drei Mutationen möglich ist, die ACS-Aktivität auf wenige Prozent des ursprünglichen Umsatzes zu senken und gleichzeitig die Fähigkeit zur Bildung des Naringeninchalkons deutlich zu steigern, so dass dies nun die Hauptaktivität der hergestellten Mutante ist. Der umgekehrte Weg, die Umwandlung der CHS in eine ACS, gestaltete sich schwieriger. Es wurden zahlreiche Hinweise auf notwendige Bedingungen für diesen offensichtlich komplizierteren Weg erarbeitet. So konnten bei der Mutante Rk1 unter bestimmten Bedingungen eine geringe ACS-Aktivität gemessen werden. Des Weiteren zeigten Hemmtests, dass die Bindung des Startsubstrats N-Methylanthraniloyl-CoA in allen CHS-Mutanten möglich ist, im Gegensatz zur Wildtyp-CHS. Die folgende Charakterisierung zeigte, dass die Mutanten Rk1 und Rk2 in erhöhtem Maße Anthraniloyl-CoA, das postulierte Startsubstrat der Hydroxychinolonsynthase (HQS), umsetzen. Erste Hinweise deuten darauf hin, dass die vorgenommenen Mutationen der CHS nicht nur zur teilweisen Umwandlung in eine ACS geführt haben, sondern möglicherweise auch zu einer HQS. Mit der Klonierung und funktionellen Expression der Chalkonsynthase aus Diptam steht eine weitere PKS aus der Familie der Rutaceae zur Verfügung. Der Vergleich mit bereits bekannten Sequenzen erbrachte Hinweise auf weitere Sequenzstellen, durch deren Austausch die bisher unvollständige Umwandlung der CHS in eine Acridonsynthase erreicht werden könnte. Die noch ausstehende Klonierung der HQS wird dazu beitragen, die Fragen, die sich aus den unterschiedlichen Substratspezifitäten der untersuchten Enzyme und Mutanten ergeben haben, zu beantworten., Chalcone synthases (CHSs) and acridone synthases (ACSs) belong to the superfamily of type III polyketide synthases (PKSs) and condense the starter substrate 4-coumaroyl-CoA or N-methylanthraniloyl-CoA with three malonyl-CoAs to produce flavonoids and acridone alkaloids, respectively. While acridone alkaloids are confined almost exclusively to the Rutaceae, flavonoids occur abundantly in all seed-bearing plants. ACSs and CHSs had been cloned from Ruta graveolens and shown to be closely related polyketide synthases which use N-methylanthraniloyl-CoA and 4-coumaroyl-CoA, respectively, as the starter substrate to produce the acridone or naringenin chalcone. As proposed for the related 2-pyrone synthase from Gerbera, the differential substrate specificities of ACS and CHS might be attributed to the relative volume of the active site cavities. The primary sequences as well as the immunological cross reactivities and molecular modeling studies suggested an almost identical spatial structure for ACS and CHS. Based on the Ruta ACS2 model the residues Ser132, Ala133 and Val265 were assumed to play a critical role in substrate specificity. Exchange of a single amino acid (Val265Phe) reduced the catalytic activity by about 75% but grossly shifted the specificity towards CHS activity, and site-directed mutagenesis replacing all three residues by the corresponding amino acids present in CHS (Ser132Thr, Ala133Ser and Val265Phe) fully transformed the enzyme to a functional CHS with comparatively marginal ACS activity. The results suggested that ACS divergently has evolved from CHS by very few amino acid exchanges, and it remains to be established why this route of functional diversity has developed in the Rutaceae only. The reverse triple mutation of Ruta-CHS1 (mutant R2) affected only insignificantly the CHS activity and did not confer ACS activity. However, competitive inhibition of CHS activity by N-methylanthraniloyl-CoA was observed for the mutant and in contrast to wild-type CHSs. Homology modeling of ACS2 with docking of 1,3-dihydroxy-N-methylacridone suggested that the starter substrates for CHS or ACS reaction are placed in different topographies in the active site pocket. Additional site specific substitutions (Asp205Pro/Thr206Asp/His207Ala or Arg60Thr and Val100Ala/ Gly218Ala, respectively) diminished the CHS activity to 75%-50% of the wild-type CHS1 without promoting ACS activity. The results suggest that conformational changes in the periphery beyond the active site cavity volumes determine the product formation by ACSs vs. CHSs in Ruta graveolens. It is likely that ACS has evolved from CHS, but the sole enlargement of the active site pocket as in CHS1 mutant R2 is insufficient to explain this process.