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Introduzione.L’acidemia metilmalonica (MMA) è una rara malattia autosomica recessiva del catabolismo dell’acido propionico dovuta a carenza totale o parziale dell’enzima metilmalonil-CoA mutasi (MUT) o a difetti di assorbimento o del metabolismo dei coenzimi derivanti dalla cobalamina. Si tratta di una malattia che può avere esiti mortali se il trattamento terapeutico non è iniziato immediatamente, per cui la diagnosi precoce è indispensabile. La diagnosi di malattie metaboliche ereditarie attraverso programmi di screening neonatale, rappresenta oggi uno degli strumenti più avanzati della pediatria preventiva (1) ma è ancora molto controverso quale sia l’intervallo di tempo più opportuno per la raccolta del campione. Scopo del lavoro e metodi.Noi qui riferiamo di due casi di MMA con due differenti mutazioni di tipo mut0, ovvero del tipo funzionalmente più invalidante, individuate nell’ambito di un programma di screening metabolico allargato effettuato mediante dosaggio di aminoacidi e acilcarnitine su driedblood spot o siero attraverso spettrometria di massa tandem (2). Risultati.Caso clinico 1: il primo paziente, apparentemente normale alla nascita, veniva ricoverato dopo 24 ore in terapia intensiva con imponente acidosi metabolica e chetosi. Lo screening, effettuato a 48 ore dalla nascita, mostrava un aumento significativo di C3 con un livello normale di C4DC; il dosaggio di acido metilmalonico su driedblood spot (DBS) portava alla diagnosi di MMA, confermata dal dosaggio degli acidi organici urinari. L’analisi molecolare rivelava che il paziente era omozigote per la mutazione di splicing c.1560+1g>t nell’esone 8 del gene MUT. L’analisi dell’RNA estratto da sangue periferico mostrava che la mutazione risultava nello skipping dell’esone 8 corrispondente alla delezione in frame p.S483_K520del nella proteina. La tempestiva diagnosi purtroppo non era sufficiente ad impedire l’exitus del paziente, avvenuto poco dopo le 48 ore di vita. Caso clinico 2: il secondo paziente nato in struttura che non eseguiva screening neonatale, era ricoverato a 5 giorni di vita in terapia intensiva neonatale (TIN) in seguito a grave disidratazione, ipotonia e progressiva letargia emersa dall’anamnesi a partire dalla seconda giornata. Il dosaggio di aminoacidi e acilcarnitinesu DBS è stato effettuatoin quinta giornata. Il profilo delle acilcarnitine e successivo secondtier test erano compatibili con una diagnosi di MMA, confermata dal dosaggio degli acidi organici urinari. L’analisi molecolare mostrava che la paziente era omozigote per la mutazione c.682C>T (p.R228X) sull’esone 3 del gene MUT. La paziente al momento è in terapia con prognosifavorevole. Conclusioni. I risultati di questo studio risollevanoilproblema del timing nello screening metabolicoallargato. Infatti, le lineeguidaitalianesuggerisconocheilcartoncino per lo screening siaeffettuatotra le 48 e le 72 ore dallanascita; tuttavia, la diagnosi di malattie come la MMA chepossonoavereesordio molto precocericeverebbeindubbibeneficidall’anticipazione del timing ad almeno 24 ore, come giàavviene in altripaesi, ad es. alcunistatidegli U.S.A. (Utah e Mississippi) (3) chesuccessivamenteeffettuano un secondo cartoncino in modo da evitarefalsinegativi. Inoltre, irisultatidelladiagnosimolecolaresottolineano la difficoltà di unacorrelazionegenotipo-fenotipo, dal momentochemutazioniapparentementemeno severe possonorisultare in unasintomatologiadrammatica molto piùprecoce ad esitoinfausto. Bibliografia 1- Scolamiero E. et al, MolBiosyst. 2015 Jun;11(6):1525-35. doi: 10.1039/c4mb00729h. 2- Catanzano F et al, J InheritMetabDis 2010;33:91–4. 3- http://www.rules.utah.gov/publicat/code/r398/r398-001.htm

Background The effects of sex and oral contraceptives (OCs) on blood metabolites have been scarcely studied. Considering the widespread use of OCs and the fact that protocol designs for clinical trials emphasise the use of contraception for women of childbearing potential, we examined if OCs and sex affect the serum levels of the physiologically relevant amino acids, carnitine and acylcarnitines, using metabolomics approaches. Methods Thirty-five healthy adult men and 67 women aged between 20 and 47 years were enrolled. They were drug free with the exception of women taking cyclic format OCs that contained ethinylestradiol and different progestins. OC-free women were analysed during the first ten days of their menstrual cycles, and amino acids, free carnitine and acylcarnitines were measured using HPLC or LC/MS/MS. Results The serum levels of alanine, serine, aspartic acid, arginine and taurine were not significantly different among the analysed groups. Men had significantly higher leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, asparagine, glutamine + glutamate, and histidine than women who did not use OCs, while tryptophan was significantly lower in men. OC use significantly decreased the levels of glycine, proline, glutamine + glutamate, lysine, hydroxyproline and ornitine when compared with non-user women. The level of free carnitine was higher in men than in women; in addition, OC use further reduced the levels of carnitine in women although the reduction is not significant. Total esterified carnitines were higher in untreated women when compared with that of men and OC users. Globally, the effect of OCs and sex was specific for the individual esterified carnitine. The observed metabolic changes were not attributable to renal or hepatic functions or to differences in body weight. Conclusion The assessed parameters were specifically influenced by sex, highlighting the need to have reference values for women and men. The major novelty of this study is the demonstration that OCs specifically change the profiles of serum amino acids and carnitine, which suggests that OC users and non-users should be represented in clinical trials.

Introduzione: Lo screening neonatale, esteso può avere implicazioni e benefici anche per le madri, permettendo di scoprire malattie non identificate nella vita pre-gestazionale. I principali markers primari di deficit materni sono alcuni aminoacidi ed acilcarnitine: alti livelli di fenilalanina e citrullina possono condurre ad una diagnosi di fenilchetonuria (mPKU) o citrullinemia (mCit), materna, rispettivamente, mentre le più frequenti condizioni materne individuate mediante l’analisi delle acilcarnitine sono la 3-metil-crotonilglicinuria e la 3-metilglutaconico aciduria (aumento di C5OH-carnitina), e la carenza di vitamina B12 (aumento di C3-carnitina). Il principale marker secondario di difetto materno è, invece, la carnitina che a livelli molto bassi può essere indicativa di un difetto primario di carnitina (carnitine uptake deficiency, CUD) (1). Scopo del lavoro e metodi: scopo di questo studio è stato valutare l’incidenza delle forme materne di disordini del metabolismo diagnosticati nel nostro laboratorio (anni 2007-2014) mediante dosaggio di aminoacidi e acilcarnitine su dried blood spot o siero effettuato mediante spettrometria di massa tandem (2). Risultati: nel corso del nostro programma di screening neonatale sono stati identificati 9 casi di alterazioni secondarie a deficit materni: 7 casi di carenza di vitamina B12 (0,015 %), 1 caso di CUD e 1 caso di PKU (0,039 %). I neonati di madri con carenza di B12 individuati dal nostro laboratorio mostravano allo screening elevati livelli di propionil-carnitina (C3) e di acido metilmalonico (MMA) sullo spot di sangue e, nel corso dei successivi tests di conferma, livelli significativi di MMA nelle urine e di omocisteina nel siero. La valutazione diagnostica delle madri evidenziava bassi livelli di vitamina B12 e alti livelli di omocisteina nel siero: di queste madri una soffriva di gastrite atrofica e una era vegana, le altre non dichiaravano condizioni particolari. Dopo due settimane di terapia con vitamina B12 gli analiti sono tornati nella norma nei neonati ma non nelle madri (3). Il dosaggio degli aminoacidi sierici eseguito come approfondimento diagnostico su una madre di due bambini nati con ritardo mentale e microcefalia ha evidenziato elevati livelli di Phe. Nonostante l’assenza di quadro clinico di PKU l’indagine molecolare nella madre ha confermato il sospetto di PKU. Il neonato della madre affetta da CUD mostrava allo screening ridotte concentrazioni di carnitina libera (3,18 micromol/L; v.n.: 11-51) e di diverse acilcarnitine confermate sul cartoncino del richiamo. Per approfondimento diagnostico è stato effettuato il dosaggio delle acilcarnitine sieriche della madre che ha mostrato una drastica riduzione della carnitina libera (1,4 micromoli/L; v.n.: 10-44) e delle acilcarnitine. Conclusioni: In conclusione i programmi di screening neonatale, rappresentano oggi non soltanto uno degli strumenti più avanzati della pediatria preventiva ma anche di diagnosi di forme materne di disordini del metabolismo. 1-la Marca G et al, J Inher Metab Dis 2008 31 (21): S395-S404 2- Catanzano F et al, J Inherit Metab Dis 2010;33:91–4. 3- Scolamiero et al,Clin Biochem. 2014.08.020. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2014.08.020 [Epub ahead of print]

Introduzione: La disponibilità di nuove tecnologie come la spettrometria di massa tandem ha contribuito enormemente al numero di errori congeniti del metabolismo che possono essere diagnosticati. Infatti, grazie ai programmi di screening metabolico esteso sin dalle prime ore di vita di un neonato, è possibile identificare malattie che possono in tal modo essere trattate precocemente, prima che sintomi clinici, spesso potenzialmente letali, si manifestino. Non esiste però un consenso universale sul pannello più opportuno di patologie da sottoporre a screening (1). Nella Regione Campania si effettua da alcuni anni un progetto pilota di screening neonatale allargato che coinvolge un numero limitato di centri nascita Scopo dello studio e metodi: In questo lavoro abbiamo confrontato l’incidenza, nel periodo 2007-2014, dei disordini metabolici diagnosticati mediante screening metabolico con quella dei disordini individuati nella popolazione dei pazienti per i quali è stato richiesto il dosaggio di aminoacidi e acilcarnitine sulla base di un sospetto clinico. Lo scopo era quello di valutare quanti dei pazienti nati nello stesso periodo in Campania e identificati dopo l’insorgenza dei sintomi clinici avrebbero potuto beneficiare di una diagnosi alla nascita. Risultati e conclusioni: Nel corso della nostra esperienza 26 su 45466 neonati (1:1749) sono stati i casi positivi identificati allo screening neonatale: 5 difetti di acil-CoA deidrogenasi a catena media (MCAD), 3 metilmalonico acidemia (MMA), 7 difetti di vitamina B12 secondari a carenza materna (2), 1 propionico acidemia (PA), 1 isovalerico acidemia, 1 beta-chetotiolasi (βKT), 1 difetto di isobutirril-CoA deidrogenasi, 1 difetto di acil-CoA deidrogenasi a catena corta/ramificata, 1 difetto di 3-metil-crotonil-CoA carbossilasi, 1 difetto di cistationina beta-sintetasi, 2 fenilchetonuria, 1 difetto di carnitina secondario a carenza materna, 1 formiminoglutammico aciduria. Una diagnosi (MCAD) ha consentito l’identificazione della patologia in un fratello asintomatico di 18 mesi che non era stato sottoposto allo screening. Ventisei diagnosi su 2545 (1:98) sono state invece eseguite nel nostro laboratorio su pazienti per i quali il dosaggio degli aminoacidi e delle acilcarnitine in spettrometria di massa tandem era stato richiesto su base clinica. Nell’ambito delle diagnosi post sintomatiche 14/26 sono state effettuate su pazienti nati dopo dell’inizio del progetto di screening metabolico allargato: 5 MMA, 1 PA, 1 βKT, 2 iperglicinemia non chetotica, 1 encefalopatia etilmalonica, 1 difetto di metilene-tetraidrofolato reduttasi, 2 difetti di 3-idrossi-acil-CoA deidrogenasi a catena lunga, 1 difetto di proteina trifunzionale mitocondriale. In conclusione, i dati ottenuti sottolineano la numerosità delle diagnosi effettuate in mancanza di screening, quando ormai il difetto metabolico si è tradotto in un danno d’organo, in uno stadio in cui il potenziale effetto della terapia è compromesso e ribadiscono l’importanza dello screening neonatale quale unico protocollo per la tempestiva diagnosi di malattie del metabolismo. 1- Watson MS. et al, Pediatrics 2006; 117: S296-307. 2- Scolamiero E. et al, Clin Biochem. 2014 doi: 10.1016/j.clinbiochem.2014.08.020 [Epub ahead of print]

Purpose: To improve quality of newborn screening by tandem mass spectrometry with a novel approach made possible by the collaboration of 154 laboratories in 49 countries. Methods: A database of 767,464 results from 12,721 cases affected with 60 conditions was used to build multivariate pattern recognition software that generates tools integrating multiple clinically significant results into a single score. This score is determined by the overlap between normal and disease ranges, penetration within the disease range, differences between conditions, and weighted correction factors. Results: Ninety tools target either a single condition or the differential diagnosis between multiple conditions. Scores are expressed as the percentile rank among all cases with the same condition and are compared to interpretation guidelines. Retrospective evaluation of past cases suggests that these tools could have avoided at least half of 279 false-positive outcomes caused by carrier status for fatty-acid oxidation disorders and could have prevented 88% of known false-negative events. Conclusion: Application of this computational approach to raw data is independent from single analyte cutoff values. In Minnesota, the tools have been a major contributing factor to the sustained achievement of a false-positive rate below 0.1% and a positive predictive value above 60%. © 2012 American College of Medical Genetics and Genomics.

Organic acidurias are inherited metabolic diseases due to the deficiency of an enzyme or a transport protein involved in one of the several cellular metabolic pathways devoted to the catabolism of amino acids, carbohydrates or lipids. These deficiencies result in abnormal accumulation of organic acids in the body and their abnormal excretion in urine. More than 65 organic acidurias have been described; the incidence varies, individually, from 1 out of 10,000 to >1 out of 1000,000 live births. Collectively, their incidence approximates 1 out of 3000 live births. Among these disorders, methyl malonic aciduria, propionic aciduria, maple syrup urine disease and isovaleric aciduria are sometimes referred to as classical organic acidurias. In this review, we focused on the basic GC–MS-based methodologies employed in the diagnosis of classical organic acidurias and provided updated reference values for the most common involved organic acids. We also attempted to provide the most recent updates on the pathogenetic bases of these diseases.

Methylmalonic acidemia with homocystinuria, cobalamin deficiency type C (cblC) (MMACHC) is the most common inborn error of cobalamin metabolism. Despite a multidrug treatment, the long-term follow-up of early-onset patients is often unsatisfactory, with progression of neurological and ocular impairment. Here, the in-vivo proteome of control and MMACHC lymphocytes (obtained from patients under standard treatment with OHCbl, betaine, folate and L-carnitine) was quantitatively examined by two dimensional differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE) and mass spectrometry. Twenty three proteins were found up-regulated and 38 proteins were down-regulated. Consistent with in vivo studies showing disturbance of glutathione metabolism, a deregulation in proteins involved in cellular detoxification, especially in glutathione metabolism was found. In addition, relevant changes were observed in the expression levels of proteins involved in intracellular trafficking and protein folding, energy metabolism, cytoskeleton organization and assembly. This study demonstrates relevant changes in the proteome profile of circulating lymphocytes isolated from treated cblC patients. Some results confirm previous observations in vivo on fibroblast, thus concluding that some dysregulation is ubiquitous. On the other hand, new findings could be tissue-specific. These observations expand our current understanding of the cblC disease and may ignite new research and therapeutic strategies to treat this disorder.

Rhabdomyolysis may result from various factors, namely trauma, exercise, medications, infections, endocrine disorders, congenital myopathies, and metabolic diseases.1 Among the latter, mitochondrial fatty acid β-oxidation (FAO) defects frequently cause recurrent rhabdomyolysis. FAO disorders are recessively inherited and have a combined incidence of 1:9,300, estimated after implementation of newborn screening programs by tandem mass spectrometry (MS/MS).2 Clinical manifestations of these disorders range from sudden infant death to Reye-like syndrome, nonketotic hypoglycemia, skeletal myopathy, peripheral neuropathy, and progressive cardiomyopathy. Here, we describe an 18-month-old child presenting with episodes of recurrent rhabdomyolysis related to mitochondrial trifunctional protein deficiency (MTPD), without additional manifestations of FAO defects. We discuss the diagnosis of MTPD and review the prognosis and treatments. The authors thank Jean Ann Gilder, Scientific Communication srl, for editing the text and Vittorio Lucignano, CEINGE–Biotecnologie Avanzate, for technical assistance.

Inborn errors of metabolism are genetic disorders due to impaired activity of enzymes, transporters, or cofactors resulting in accumulation of abnormal metabolites proximal to the metabolic block, lack of essential products or accumulation of by-products. Many of these disorders have serious clinical consequences for affected neonates, and an early diagnosis allows presymptomatic treatment which can prevent severe permanent sequelae and in some cases death. Expanded newborn screening for these diseases is a promising field of targeted metabolomics. Here we report the application, between 2007 and 2014, of this approach to the identification of newborns in southern Italy at risk of developing a potentially fatal disease. The analysis of amino acids and acylcarnitines in dried blood spots by tandem mass spectrometry revealed 24 affected newborns among 45,466 infants evaluated between 48 and 72 hours of life (overall incidence: 1 : 1894). Diagnoses of newborns with elevated metabolites were confirmed by gas chromatography-mass spectrometry, biochemical studies, and genetic analysis. Five infants were diagnosed with medium-chain acyl CoA dehydrogenase deficiency, 1 with methylmalonic acidemia with homocystinuria type CblC, 2 with isolated methylmalonic acidemia, 1 with propionic acidemia, 1 with isovaleric academia, 1 with isobutyryl-CoA dehydrogenase deficiency, 1 with beta ketothiolase deficiency, 1 with short branched chain amino acid deficiency, 1 with 3-methlycrotonyl-CoA carboxylase deficiency, 1 with formimino-transferase cyclodeaminase deficiency, and 1 with cystathionine-beta-synthase deficiency. Seven cases of maternal vitamin B12 deficiency and 1 case of maternal carnitine uptake deficiency were detected. This study supports the widespread application of metabolomic-based newborn screening for these genetic diseases.

Objectives Patients affected by Phenylketonuria (PKU) require lifelong management based on phenylalanine (Phe) and tyrosine (Tyr) restricted intake or tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Frequent monitoring of blood concentration of both amino acids during treatment is the key point for clinicians to achieve the best long-term neuropsychological outcome. Results The present study develops and validates a rapid and simple method for Phe and Tyr quantization in dried blood spot (DBS) since this specimen has the advantage of being low invasive, easily withdrawn even at home and stable if mail-delivered. The validation studies showed the robustness of the method. Conclusions Serum and DBS samples from PKU patients were analyzed and compared, finding a good correlation of Phe and Tyr concentrations between the two different matrixes.

A pilot expanded newborn screening programme to detect inherited metabolic disorders by means of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) began in the Campania region, southern Italy, in 2007. By October 2009, >8,800 dried blood samples on filter paper from 11 hospitals had been screened. Within this screening programme, we identified a case of mitochondrial acetoacetyl-coenzyme A (CoA) thiolase deficiency [beta-ketothiolase (beta-KT) deficiency] by analysing the acylcarnitine profile from a dried blood spot with LC-MS/MS. Gas chromatography coupled with mass spectrometry analysis of urinary organic acids and LC-MS/MS analysis of urinary acylcarnitines were in line with this disorder. In fact, concentrations were well beyond the cut-off values of tiglyl carnitine, 3-hydroxybutyrylcarnitine and 2-methyl-3-hydroxybutyrylcarnitine, 2-methyl-3-hydroxybutyric acid and tiglyl glycine. The absence of 2-methylacetoacetic acid in urine may be attributed to: (i) the instability of this beta-ketoacid because it undergoes spontaneous decarboxylation to 2-butanone, which is highly volatile and thus difficult to detect, and (ii) the good health of the patient in the first days of life. beta-KT deficiency was subsequently diagnosed in the patient's older sister, who showed increased levels of the same metabolites but also small amounts of 2-methylacetoacetic acid, which is considered a key marker for beta-KT diagnosis. Genomic analysis revealed mutation c.1189C >G in exon 12 of the ACAT1 gene, which results in a severe defect because of the p.H397D amino acid change in both alleles of both patients.