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Der Ligand der PDE10A GAF-Domänen war vor dieser Arbeit noch unbekannt. Durch die Erzeugung einer funktionellen Chimäre aus dem N-Terminus und den beiden GAF-Domänen der humanen PDE10A sowie der PAS- und katalytischen Domäne der Adenylatcyclase CyaB1 aus Anabaena war es möglich, cAMP als Ligand des PDE10 GAF-Tandems zu bestimmen. Durch dieses Testsystem war eine Trennung von Ligand und Substrat der PDE möglich. Als ligandenbindende Domäne konnte die GAF-B der PDE10 bestimmt werden. Eine cAMP-Bindung an die GAF-B erfolgte mit einem EC50 von 18 µM, der über der zellulären cAMP-Konzentration liegt. Eine Stimulation der katalytischen Aktivität der AC mit cAMP war um einen Faktor von 15,5 möglich. cGMP dagegen stimulierte nur vierfach. Eine Veränderung der Affinität für cAMP mit den N-Termini der beiden humanen PDE10-Hauptformen PDE10A1 und PDE10A2 zeigte sich nicht. Für die GAF-A wurde keine cAMP- oder cGMP-bindende Funktion gefunden. Eine Bedeutung dieser bei der Dimerisierung ist wahrscheinlich. Ein Entfernen des relativ kurzen PDE10 N-Terminus zeigte keinen Einfluss auf die cAMP-Affinität und unterscheidet sich damit deutlich von den Verhältnissen in der PDE5 oder PDE11. Die Kombination der GAF-A der humanen PDE5A1 mit der GAF-B der humanen PDE10A ist unter Erzeugung einer funktionsfähigen Chimäre mit der CyaB1 AC als Reporterenzym gelungen. Damit konnte eine cGMP-bindende GAF-Domäne mit einer cAMP-bindenden GAF-Domäne gekoppelt werden. Dabei war es irrelevant, welcher N-Terminus sich vor dem GAF-Tandem befand. Mit beiden N-Termini erhielt man funktionsfähige Chimären. Allerdings erfolgte die Stimulation der katalytischen Aktivität der AC vorrangig über cAMP und nicht wie vermutet, verstärkt über cGMP. In diesen Chimären ist die PDE10 GAF-B offensichtlich die ligandenbindende Domäne. Damit scheint die PDE5 GAF-A in gewisser Weise die Funktion der GAF-A der PDE10 zu übernehmen. Dennoch nicht ohne einen gewissen Einfluss auf die Affinität und Stimulation mit cAMP, denn die Affinität erhöhte sich auf 7 µM cAMP unter Verringerung der maximalen Stimulation. Ein Ersetzen des PDE10 Linkers in dieser PDE5-PDE10-CyaB1-Chimäre führte zum Verlust der Stimulation der katalytischen Aktivität der AC mit cAMP und cGMP. Damit nimmt der Linker eine Schlüsselrolle beim Signalisieren über die GAF-Domänen ein. Chimären aus den nicht-bindenden GAF-Domänen der PDE5 und PDE10 waren wie erwartet nicht stimulierbar. Eine Kristallisation des PDE10 GAF-Tandems war mit und ohne cAMP möglich. Allerdings konnte mit den erhaltenen Kristallen nicht die Struktur der GAF-Domänen aufgeklärt werden. The ligand for the PDE10A GAF domains was unknown before this work. By constructing a functional chimera consisting of the human PDE10A tandem GAF domains including their N-terminus and the PAS and catalytic domain of the cyanobacterial CyaB1 adenylyl cyclase it was possible to determine cAMP as a ligand for the PDE10 GAF domains. In this PDE-cyclase chimera the ligand (cAMP) and the substrate (ATP) differ. PDE10A GAF-B binds cAMP with an EC50 of 18 µM, which is higher than the cellular cAMP concentration. The PDE10 GAF domains activate the associated AC 15.5-fold via cAMP and only 4-fold via cGMP. There was no change in the affinity for cAMP with the different N-terminal regions of the human PDE10 major isoforms PDE10A1 and PDE10A2. For PDE10A GAF-A no function concerning cAMP- or cGMP-binding was found. It is likely that GAF-A could be involved in dimerization. A removal of the relatively short PDE10A N-terminus had no effect on the cAMP-affinity of the GAF-domains, what is strongly different from PDE5 or PDE11. In this work I could show that it is possible to combine the human PDE5A1 GAF-A with the human PDE10A GAF-B in a functional chimera with the CyaB1 AC as a reporter enzyme. That means a cGMP-binding GAF domain (PDE5 GAF-A) was coupled with a cAMP-binding GAF domain (PDE10 GAF-B). In this case it was unimportant, which N-terminus was located in front of the GAF tandem. With the PDE5 as well as with the PDE10 N-terminus the chimera was working. However in both chimeras the activation of the catalytic domain of the AC was higher with cAMP than with cGMP. In these PDE5-PDE10-CyaB1 chimeras PDE10 GAF-B binds cAMP (EC50=7 µM). Interestingly, the substitution of the PDE10 linker between the PDE5 GAF-A and the PDE10 GAF-B by the PDE5 linker resulted in a completely loss of the activation of the AC by cAMP and cGMP. This shows an importance of the linker for the GAF-signalling. It was possible to crystallize the human PDE10 tandem GAF domains with and without their ligand cAMP, but with the received crystals it was impossible to solve the structure of the GAF tandem.

Der Versuch eine Adenylatcyclase (AC) aus Paramecium durch Homologieklonierung zu finden, führte zu einem Gen von 2595bp, dessen offener Leserahmen für ein Protein von 98 kDa kodiert. Datenbankanalysen ergaben, daß es sich um ein Multidomänenenzym handelt. Im N-terminalen Abschnitt finden sich 6 transmembranspannende Regionen (TM). Die TM4 entspricht einem kanonischen Spannungssensor mit sieben positiven Ladungen (K/RXXK/R...). C-terminal befindet sich ein cytosolischer Bereich, der Identitäten und Ähnlichkeiten mit einer Klasse III-AC besitzt. Die Ähnlichkeit ist besonders ausgeprägt zu homodimeren, bakteriellen ACn aus Anabaena oder Stigmatella. Zwischen dem Membrananker und der AC Domäne befindet sich ein Bereich, der eine klassische Kalium-spezifizierende Porenregion besitzt (GFGD). 30 Aminosäuren vor dem Carboxylende befindet sich ein Proteinabschnitt mit Ähnlichkeit zu einer Tetratricopeptidrepeateinheit (TPR). Wegen der Abweichung vom universellen genetischen Code und der unorthodoxen Codonverwendung durch Paramecium wurde das Gen mit einer Mammalia-Codonusage resynthetisiert. Die funktionelle Expression sowohl des Holoenzyms als auch von cytosolischen Proteinabschnitten scheiterte an der Bildung von 'inclusion bodies'. Es konnte keine AC-Aktivität nachgewiesen werden. Bei den Expressionsversuchen wurden folgende Systeme verwendet: E.coli, Streptomyces lividans, Rapid Translation System RTS500, HEK293, CHO-, OK- und Sf9-Zellen. Der Transport in die Plasmamembran von CHO- oder OK-Zellen durch Fusion mit den N-Termini der K+-Kanäle rSK2 und Kir2.1 bzw. dem ER-Export-Signal FCYENE von Kir2.1 war erfolglos. Die Herstellung von Antiseren gegen inclusion body-Proteine oder synthetische Proteine führte nicht zu einer befriedigenden Spezifität. The attempt to clone an adenylyl cyclase (AC) from Paramecium by homology cloning lead to a gene of 2595bp. The open reading frame coded for 98 kDa Protein. Database analysis revealed a multi domain protein with six transmembrane spans in the N-terminal region including a canonical voltage sensor with seven positive charges and similarity to a potassium ion channel. The cytosolic carboxy-terminal region represents a class III AC-domain with similarity to homodimeric bacterial ACs such as from Anabaena or Stigmatella. 30 amino acids upstream of the C-terminus a domain with similarity to a tetratricopeptide repeat unit (TPR) is indicated. The complete Paramecium AC gene was resynthesized with a mammalian codon usage due to the aberrant genetic code in this ciliate. The functional expression of the holoenzyme or of cytosolic protein regions was impossible. Different expression systems were used such as: E.coli, HEK293, Rapid Translation System RTS500TM, Streptomyces lividans, Sf9-, CHO- and OK-cells. A transport of the expression product into the plasma membrane by fusion to the N-termini of the K+-channels rSK2 and Kir2.1 or to the ER-export-signal FCYENE of Kir2.1 was unsuccessful. The production of antibodies against the catalytic domain or an N-terminal hexadeca-peptide did not yield the specificity required for immunolocalization studies.

Untersucht wurde die an eine N-terminale Ionenkanaldomäne gekoppelte singuläre Adenylatcyclase (AC) aus Plasmodium falciparum. Die Arbeit beschreibt zunächst die Zuordnung der Exons, dann die Herstellung eines synthetischen Gens zur optimierten heterologen Expression. Die AC-Domäne wurde mit einem Baculovirus-Sf9-Expressionssystem als aktives Enzym exprimiert und durch Affinitätschromatographie gereinigt. Das Enzym verwendete ausschließlich ATP als Substrat, Guanylatcyclaseseitenaktivität war nicht meßbar. Kofaktor war Mn2+, Mg2+ unterstützte die Katalyse nicht. Die kinetische Charakterisierung deutet auf eine Homodimerbildung hin. Forskolin, ein Stimulator der meisten Säuger-ACn, zeigte keinen Effekt. Die Anwesenheit eines C-terminalen Tetratricopeptids (TPR) ist für die Bildung des löslichen aktiven Enzyms notwendig. Das Holoenzym war in Sf9-Zellen nicht aktiv exprimierbar, fluoreszenzmarkierte Konstrukte des Holoenzyms und der Kanaldomäne zeigten in anderen Metazoenzellen (CHO) eine intrazelluläre Retention. Fehlende Ionenströme bei der Expression des Holoenzyms in Oozyten lassen ebenso Retentionsprobleme vermuten. Dagegen scheint nach vorläufigen Ergebnissen bei heterologer Expression in Paramecium ein corticaler Transport des Holoenzyms möglich zu sein. Mit einem gereinigten Peptidantikörper gegen den C-Terminus wurde eine Immunlokalisation in Plasmodien durchgeführt. Dabei wurden vermutlich die Food vacuoles von späten Trophozoiten markiert. Westernblots hiervon erbrachten zwei spezifische Signale, welche jedoch ein größeres als das erwartete Molekulargewicht hatten. Durch Homologieklonierung (Tetrahymena-Genbankscreen) und Homologiesuchen (BLAST) wurden zusätzliche AC-Isoformen aus der Gruppe der Alveolata (Tetrahymena, Cryptosporidium, Toxoplasma und weitere Plasmodiumspezies) gefunden, konservierte Strukturen werden anhand von Sequenzvergleichen diskutiert. This thesis describes studies of the singular ion channel adenylyl cyclase (AC) from Plasmodium falciparum. At the beginning the exon determination is described, subsequently a synthetic gene was manufactured for optimized heterologous expression. The isolated AC-domain was generated as an active enzyme in an Sf9-baculovirus expression system and purified by affinity chromatography. The exclusive substrate was ATP, guanylyl cyclase side-activity was not detected. Mn2+ was required as metal-cofactor, Mg2+ did not support activity. From the kinetic data a homodimerisation of the catalyst could be infered. Forskolin, a potent stimulator of most mammalian ACs, had no effect on enzyme activity. The C-terminal tetratricopeptide (TPR) was indispensable for formation of a soluble active enzyme. It was not possible to express the holoenzyme as an active entity in Sf9-cells, fluorescence tagged constructs of the channel domain alone or the holoenzyme were retained intracellularly in CHO-cells. The lack of a measurable ion conductance upon expression of the holoenzyme in Xenopus oocytes also indicated retention problems. In contrast to this, preliminary results from expression experiments in Paramecium indicate some transport of the holoenzyme to cortical regions. Immunolocalisaton in Plasmodium parasites was performed with a purified peptide antibody against the C-terminus of the holoenzyme. In late trophozoites food vacuoles appeared to be labeled. Western blotting of this parasite stage revealed two specific bands, both with a higher than expected molecular weight. Additional AC-isoforms from the parvkingdom of alveolata (Tetrahymena, Cryptosporidium, Toxoplasma and several members of the species Plasmodium) were detected by homology cloning (Tetrahymena libary screen) and homology searches (BLAST), conserved domains are discussed by sequence alignments.