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The aim of this study is to examine the theoretical foundation of OLGs regarding their importance for early life, possible functions and the difficulty of creating OLGs. Due to the similarity between the conservation of alternative reading frames, a toy model of sequence space exploration is studied to determine the tradeoff between sequence conservation and coding flexibility. The difficulty of evolving OLGs is estimated by studying artificially created OLGs., In dieser Dissertation wird die Bedeutung von überlappenden Genen (OLGs) bezüglich des Ursprungs des Lebens, möglicher biologischer Funktionen und ihrer evolutiven Entstehung erforscht. Auf Grund der Ähnlichkeit der Konservierung verschiedener Leserahmen wird ein Modell zur Analyse des Sequenzraums entwickelt, um die Balance zwischen Konservierung und Flexibilität zu beschreiben. Durch die Analyse von künstlich erzeugten OLGs wird die Schwierigkeit der Entstehung von OLGs abgeschätzt.

Thermophilic spore counts in milk powders determine the microbial product quality. Tracking of the thermophilic spore population during powder production and the identification of a specialised phenotype of prevalent process isolates in this work examined the origin of elevated thermophilic spore levels. Phylogenetic relations at the genome level and the adaptation experiment focussed on determinants for the settlement of specific in-plant persisters into the production plant., Thermophile Sporenbildner bestimmen die mikrobiologische Produktqualität von Milchpulver. Die erhöhten Sporenzahlen wurden in dieser Arbeit anhand der Dynamik der thermophilen Sporenpopulation während der Pulverherstellung und der Identifizierung eines spezialisierten Phänotyps von Prozessisolaten ergründet. Die phylogenetischen Abgrenzung, sowie das Adaptionsexperiment untersuchen Determinanten für die Ansiedelung spezifischer persistierender Stämme in die Produktionsanlage.

Während der kühlen Lagerung von Rohmilch findet die Produktion von hitzeresistenten Peptidasen durch Pseudomonas statt, welche zum Verderb von Milchprodukten führen. Hohe Keimzahlen unabhängig von der Lagerdauer indizieren Hof-spezifische Einflussfaktoren. Diese sowie die Auswirkung des Milchtransports zur Molkerei auf die Pseudomonas-Belastung wurden untersucht. Zudem fand die Charakterisierung dreier neuer, aus Rohmilch bzw. Milchhalbfabrikaten isolierter Pseudomonas-Spezies statt., During cold-storage of raw milk, peptidases are produced by Pseudomonas, which may lead to milk spoilage. High cell counts independent from storage duration indicate farm-specific influencing factors. Those as well as the impact of milk transportation to the dairies on Pseudomonas loads were analyzed. Additionally, the characterization of three novel Pseudomonas species was performed, which were isolated from raw milk, or rather semi-finished milk products.

Die Zusammensetzung von Rohmilchmikrobiota ist äußerst komplex und hat einen enormen Einfluss auf die Qualität von Milchprodukten. Die DNA-Extraktion und die Erstellung der Sequenzierbibliothek wurden optimiert, um Rohmilchmikrobiota zu sequenzieren. Darauf aufbauend wurde der Einfluss hofseitiger Faktoren auf die Biodiversität und Abundanz von verderbs- und hygieneassoziierten Keimgruppen in Rohmilch analysiert. Eine neue Gattung der Aerococcaceae und eine neue Raineyella-Art wurden beschrieben., The composition of raw milk microbiota is highly complex, contributing to the quality of dairy products. DNA extraction and sequencing library preparation were optimized to sequence raw milk microbiota. Based on this, the impact of farm-specific factors on the biodiversity and abundance of spoilage- and hygiene-associated bacteria in raw milk was analyzed. A new genus of the Aerococcaceae and a new Raineyella species were described.

The aim of this thesis was to identify novel intergenic as well as overlapping genes in the human pathogens Escherichia coli LF82 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. For this purpose, various high-throughput methods including transcriptome sequencing as well as ribosome profiling were implemented for both organisms. The identified gene candidates were further characterized both bioinformatically and experimentally by additional experiments, e.g., mass spectrometric analyses., Ziel dieser Arbeit war es, sowohl neue intergenische als auch überlappende Gene in den Humanpathogenen Escherichia coli LF82 und Pseudomonas aeruginosa PAO1 zu identifizieren. Hierfür wurden verschiedenste Hochdurchsatz-Methoden wie z.B. Transkriptom-Sequenzierung und ribosome profiling für beide Organismen implementiert. Die identifizierten Gen-Kandidaten wurden sowohl bioinformatisch als auch experimentell durch zusätzliche Experimente wie z.B. massenspektrometrische Analysen näher charakterisiert.

Psychrotolerant pseudomonads can secrete the heat-stable AprX peptidase in raw milk and thus affect the quality of UHT milk. Using 129 Pseudomonas strains, the correlation of genetic organization of the aprX-lipA2 operon and proteolytic activity was investigated. The regulatory influence of temperature, growth phase, and different operon genes on AprX biosynthesis was analyzed. A multiplex qPCR assay for quantification and differentiation based on proteolytic activity of Pseudomonas species in raw milk was developed., Psychrotolerante Pseudomonaden können die hitzestabile AprX Peptidase in Rohmilch sekretieren und somit die Qualität von H-Milch beeinträchtigen. Anhand von 129 Pseudomonas Stämmen wurde der Zusammenhang von genetischer Organisation des aprX-lipA2 Operons und der proteolytischen Aktivität untersucht. Der regulatorische Einfluss von Temperatur, Wachstumsphase und verschiedener Operongene auf die AprX Biosynthese wurde analysiert. Ein Multiplex qPCR Assay zur Quantifizierung und Unterscheidung anhand der proteolytischen Aktivität von Pseudomonas Spezies in Rohmilch entwickelt.

Based on the evaluation of publicly available RIBO-Seq data for E. coli K12, recommendations were made to improve the experimental approach for detection of potential overlapping genes (OLGs). Their existence within diverse prokaryotic species was verified by comparative analyses of RIBO-Seq data including those focusing on sequence evolution as an indicator for functionality. Last, a RIBO Seq experiment was performed for Bacteroides thetaiotaomicron to potentially identify OLGs., Publizierte E. coli K12 RIBO-Seq Datensätze wurden mit dem Ziel analysiert, Empfehlungen für die experimentelle Detektion von überlappenden Genen (OLGs) zu entwickeln. Zusätzlich wurden OLGs in diversen prokaryotischen RIBO-Seq Datensätzen nachgewiesen, deren Sequenzen auf der Grundlage ihrer evolutionären Entwicklung weitergehend verifiziert wurden. Es wurde ein RIBO-Seq Experiment für B. thetaiotaomicron durchgeführt, um auch in diesem Organismus OLGs zu detektieren.

The genome of Escherichia coli O157:H7 EDL933 (EHEC) harbors 5498 annotated genes. This study shows that transcription of additional open reading frames (ORFs) overlapping annotated genes in a different reading frame starts at defined positions and seems to be regulated by environmental conditions. Even more, overexpression of 53 overlapping ORFs yields phenotypes indicating protein-dependent functionality. Therefore, overlapping open reading frames are transcribed and translated non-randomly, demonstrating the presence of numerous novel protein-coding genes in EHEC., Im Genom von Escherichia coli O157:H7 EDL933 (EHEC) sind 5498 Gene annotiert. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass weitere offene Leserahmen (ORFs) in anderen Leserahmen definierte Transkriptionsstarts besitzen, die vermutlich durch Umweltbedingungen reguliert werden. Außerdem führt die Überexpression von 53 überlappenden ORFs zu Phänotypen, was auf ein protein-kodierendes Potential hinweist. Deshalb kann angenommen werden, dass überlappende offene Leserahmen gezielt transkribiert und translatiert werden. Dies zeigt, dass im Genom von EHEC zahlreiche neue protein-kodierende Gene vorhanden sind.

Die Mikrobiota von Rohmilchen und Milchhalbfabrikaten wurde von 15–16 Gattungen dominiert. Pseudomonas war die häufigste Gattung. Gruppen- und gattungsspezifische Ausprägungen der lipolytischen und proteolytischen Aktivität konnten teilweise ermittelt werden. Die Aktivität der Pseudomonas-Isolate ist vermutlich auf das apr-Operon zurückzuführen. Das apr-Operon wurde in 29 Pseudomonas-Arten nachgewiesen und spiegelt die Phylogenie der Gattung wider. Viele Pseudomonas-Isolate konnten keiner bekannten Art zugeordnet werden. Vier neue Pseudomonas-Arten wurden beschrieben., The microbiota of raw milks and semi-finished milk products was dominated by 15–16 genera. The genus Pseudomonas was the most prevalent. Group and genera related tendencies of the lipolytic and proteolytic activity could be partially detected. The activity of Pseudomonas isolates is most probably based on the apr operon. The apr operon could be detected in 29 Pseudomonas species and reflects the phylogeny of the genus. Many Pseudomonas isolates could not be assigned to any known species. Four novel Pseudomonas species have been described.

In the last years, more and more novel bacterial small genes were discovered in intergenic regions. However, genes in alternative open reading frames overlapping to annotated genes are usually excluded by genome annotation programs. In this thesis, 2,180 novel EHEC ORFs overlapping to annotated mother genes were analyzed. Most overlapping ORFs are completely embedded in the mother gene, taxonomically restricted and structurally similar to small proteins discovered in previous studies. They emerge by gradual or discontinuous evolution. One candidate gene, asa, was experimentally characterized., In den letzten Jahren werden immer mehr kleine Gene in intergenischen Regionen von bakteriellen Genomen entdeckt, wohingegen Gene in alternativen offenen Leserahmen ausgeschlossen werden. In dieser Doktorarbeit wurden 2.180 neue EHEC ORFs, die zu annotierten Genen überlappen, analysiert. Die meisten überlappenden ORFs sind vollständig in das Muttergen eingebettet, jung und kodieren Proteine, die strukturell ähnlich zu kleinen neuen Proteinen aus früheren Studien sind. Die ORFs entstehen durch graduelle oder diskontinuierliche Evolution. Ein Kandidatengen, asa, wurde experimentell charakterisiert.

This thesis aims at the characterization of cow`s milk microbiota, i.e. the diversity, variance and stability of raw milk microflora on farm level monitored over 15 months, the microbial composition of retail microfiltered extended shelf life milk (ESL) with special reference to spoilage bacteria limiting shelf life as well as the description of hitherto unknown bacteria originating from raw milk of this study and the dairy environment., Vorliegende Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von Kuhmilch-Mikrobiota. Zum einen wurde die Varianz, Diversität und Stabilität der Rohmilchflora eines Bauernhofes über einen Zeitraum von 15 Monaten analysiert, des Weiteren wurde die Mikroflora von mikrofiltrierter ESL Milch mit Schwerpunkt auf haltbarkeitslimitierende Bakterien untersucht. Außerdem erfolgte eine Neubeschreibung von Bakterien, welche aus Rohmilch im Rahmen dieser Studie bzw. aus dem Umfeld einer Molkerei gewonnen wurden.

Die Optimierung einer verbreiteten Methode zur Herstellung von Bibliotheken für die Genomsequenzierung wurde entwickelt und auf die Genomsequenzierung angewandt. Außerdem werden strikte Spezies-Grenzwerte für die weitläufig verwendeten Indices ANIb sowie ANIm vorgeschlagen und für die Genomospezies-Abgrenzung innerhalb der Gattung Pseudomonas und B. cereus s.l. verwendet. Zudem wird geklärt, inwieweit sich B. cereus s.l. Virulenzfaktoren auf Basis ihrer Präsenz/Absenz Muster als Spezies-Marker eignen. Abschließend wird ein neues nomenklatorisches System für diese bakterielle Gruppe vorgestellt., First, optimizations to a popular library preparation procedure for whole-genome sequencing are described and were used for genome sequencing. Then, strict species thresholds for the widely used genomic indices ANIb and ANIm are proposed. Based on these, several similarity indices are applied to delineate genomospecies within the genus Pseudomonas and B. cereus s.l. Furthermore, it is clarified whether the presence/absence patterns of over a dozen B. cereus s.l. virulence factors can be used as species discriminating criteria. Finally, a new nomenclatural system for the B. cereus s.l. group is introduced.

Die Zusammensetzung von Rohmilchmikrobiota ist äußerst komplex und hat einen enormen Einfluss auf die Qualität von Milchprodukten. Die DNA-Extraktion und die Erstellung der Sequenzierbibliothek wurden optimiert, um Rohmilchmikrobiota zu sequenzieren. Darauf aufbauend wurde der Einfluss hofseitiger Faktoren auf die Biodiversität und Abundanz von verderbs- und hygieneassoziierten Keimgruppen in Rohmilch analysiert. Eine neue Gattung der Aerococcaceae und eine neue Raineyella-Art wurden beschrieben., The composition of raw milk microbiota is highly complex, contributing to the quality of dairy products. DNA extraction and sequencing library preparation were optimized to sequence raw milk microbiota. Based on this, the impact of farm-specific factors on the biodiversity and abundance of spoilage- and hygiene-associated bacteria in raw milk was analyzed. A new genus of the Aerococcaceae and a new Raineyella species were described.

Psychrotolerant pseudomonads can secrete the heat-stable AprX peptidase in raw milk and thus affect the quality of UHT milk. Using 129 Pseudomonas strains, the correlation of genetic organization of the aprX-lipA2 operon and proteolytic activity was investigated. The regulatory influence of temperature, growth phase, and different operon genes on AprX biosynthesis was analyzed. A multiplex qPCR assay for quantification and differentiation based on proteolytic activity of Pseudomonas species in raw milk was developed., Psychrotolerante Pseudomonaden können die hitzestabile AprX Peptidase in Rohmilch sekretieren und somit die Qualität von H-Milch beeinträchtigen. Anhand von 129 Pseudomonas Stämmen wurde der Zusammenhang von genetischer Organisation des aprX-lipA2 Operons und der proteolytischen Aktivität untersucht. Der regulatorische Einfluss von Temperatur, Wachstumsphase und verschiedener Operongene auf die AprX Biosynthese wurde analysiert. Ein Multiplex qPCR Assay zur Quantifizierung und Unterscheidung anhand der proteolytischen Aktivität von Pseudomonas Spezies in Rohmilch entwickelt.