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Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2016. Os nematoides das galhas (NGs), Meloidogyne spp., estão entre os patógenos mais importantes economicamente por infectarem raízes de cafeeiro em vários países das Américas. Os objetivos do estudo foram desenvolver marcadores específicos do tipo SCAR para a detecção de duas espécies importantes do cafeeiro na América Central: Meloidogyne arabicida e M. izalcoensis (Tylenchida: Meloidogynidae), e avaliar a variabilidade genética e a agressividade de sete populações de M. paranaensis, uma das espécies de NGs mais destrutivas para o cafeeiro, em Coffea spp., com genes de resistência a Meloidogyne spp. No primeiro estudo, fragmentos polimórficos amplificados através de reações de PCR-RAPD foram selecionados e transformados em marcadores específicos do tipo SCAR. A amplificação dos primers desenvolvidos produziram fragmentos específicos de 300 pb e 670 pb para as espécies M. arabicida e M. izalcoensis, respectivamente. A especificidade dos primers também foi validada para um único indivíduo J2, macho ou fêmea, além de populações de campo, contendo mistura de espécies. Portanto, estes resultados demonstraram a eficácia destes marcadores SCAR para a identificação das espécies M. arabicida e M. izalcoensis, contribuindo para o diagnóstico específico dos NGs nas Américas. No segundo estudo, sete populações de M. paranaensis foram identificadas pela caracterização bioquímica e molecular. Os estudos filogenéticos mostraram que apesar da existência de três fenótipos de esterase (Est P1, P2 e P2a), uma baixa variabilidade genética foi observada, até mesmo em regiões distintas do DNA. A análise molecular mostrou que existe divergência genética na população de perfil P2a da Guatemala, em relação às populações do Brasil (Est P1 e P2). Essa população nos estudos de patogenicidade às cultivares suscetíveis de C. arabica mostrou-se uma das mais agressivas. Nos estudos de agressividade/virulência de M. paranaensis em Coffea spp. foram realizados dois ensaios. No primeiro, foram usadas duas cultivares, C. arabica (cv. Catuaí IAC 81) e C. canephora (cv. Clone 14), e foi confirmada a alta suscetibilidade da cv. Catuaí IAC 81 com FR > 30 e alta resistência da variedade clonal “Clone 14” com FR < 0,2, em relação a diferentes populações de M. paranaensis. Ou seja, nenhuma população foi virulenta ao ‘Clone 14’ e as populações Par 3 da Guatemala, Par 5 Piumbí-MG e Par 4 Rolândia- PR foram as mais agressivas ao ‘Catuaí IAC 81’. No segundo ensaio foram testados quatro padrões de resistência em relação a sete populações de M. paranaensis: Catuaí Vermelho x Amphillo MR2161 (C. arabica), porta enxerto Apoatã IAC 2258 (C. canephora), Híbrido do Timor UFV 408-01(E1 6-6 II) e cv. IPR 100 (C. arabica), e o controle suscetível cv. ‘Mundo Novo 379-19’. Quanto à agressividade na cultivar Mundo Novo, as populações Par 2 Herculândia-SP, Par 3 da Guatemala e Par 5 Piumbí-MG foram as mais agressivas. Nenhuma população de M. paranaensis foi virulenta às quatro cultivares resistentes: Apoatã IAC 2258, Catuaí Vermelho x Amphillo MR2161(E1 16-5 III), IPR 100 e Híbrido do Timor UFV 408-01 (E1 6-6 II), apresentando uma segregação de 15%, 0%, 26% e 31%, respectivamente. Esses resultados são promissores, pois validam a resistência de diferentes fontes genéticas de Coffea spp., para a espécie M. paranaensis. Root-knot nematodes (RKN), Meloidogyne spp., are amongst the most economically important plant parasitic nematodes infecting coffee (Coffea spp.) in several countries in the Americas. The objectives of this study were to developed a polymerase chain reaction (PCR)-based assay for specific detection of two RKN species, Meloidogyne arabicida and M. izalcoensis (Tylenchida: Meloidogynidae), major pathogens of coffee crops in Central America and to assess the genetic variability and aggressiveness of seven populations of M. parananesis, one of the most destructive RKN species in coffea, Coffea spp., which harbors resistance to Meloidogyne spp. In the first study Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) fragments specific for these two species were converted into sequence characterized amplified region (SCAR marker). PCR amplification using SCAR primers produced a specific fragment of expected size (e.g., 300 base pairs and 670 bp) in M. arabicida and M. izalcoensis, respectively. SCAR primers also allowed successful amplification of DNA from single infective juveniles, males, females and on field-isolated populations, containing mixtures of species. Therefore, these results demonstrate the effectiveness of these SCAR markers developed for identification M. arabicida and M. izalcoensis species and may contribute to specific diagnosis of these RKN in the Americas. In the second study, seven populations of M. paranaensis were identified by biochemical and molecular characterization. Phylogenetic studies have shown that despite the existence of three esterase phenotypes (Est P1, P2, P2a), a low genetic variability was observed, even in different DNA regions. Molecular analysis showed that there is a genetic difference between population P2a from Guatemala compared to other M. paranaensis populations from Brazil containing Est P1 and P2 profiles. In addition, population P2a was the most aggressive in pathogenicity assays with susceptible C. arabica cultivars. Two assays were carried out to study the aggressiveness/virulence among M. paranaensis populations against Coffea genotypes. In the first assay using different M. paranaensis populations against C. arabica (cv. Catuaí IAC 81) and C. canephora (cv. Clone 14), a high susceptibility pattern of cv. Catuaí IAC 81 was confirmed with RF> 30, as well as a high resistance phenotype for the clonal variety "Clone 14" with RF

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2011. Meloidogyne incognita é uma das espécies de nematoide das galhas mais polífagas que ocorrem no Brasil e no mundo. Oito representantes de M. incognita incluindo os dois fenótipos enzimáticos (esterase e malato desidrogenase: I1N1, I2N1) e quatro isolados de espécie cripta (Meloidogyne sp.1 - S2N1), representando um tipo citológico (3n = 40-46) e quatro raças fisiológicas foram estudados. Meloidogyne hispanica (H3N1, 2n = 32-36) e dois isolados atípicos de Meloidogyne sp. 2 (S2N3, 3n = 40-44) foram incluídas neste estudo. Todos os isolados foram testados com três marcadores moleculares espécie-específico do tipo SCAR, desenvolvidos para M. incognita. Os pares de primers B06F/R, miF/R e incK14F/R amplificaram três fragmentos espécie-específico de 1,200 bp, 955 bp e 399 bp, respectivamente, para os oito isolados de M. incognita e quatro de Meloidogyne sp. 1, não ocorrendo para os isolados pertencentes a M. hispanica e Meloidogyne sp. 2. A variabilidade genética de todos os isolados de Meloidogyne spp. usados neste estudo foi avaliada por meio dos marcadores RAPD e ISSR. Análises filogenéticas das matrizes resultantes usando (UPGMA, Maximum Parsimony e Bayesian inference) produziram árvores com a mesma topologia geral na relação entre as espécies. Dois grupos monofiléticos foram observados: grupo I, consistindo de isolados de M. hispanica e Meloidogyne sp.2 atípicos e grupo II agrupando-se todos os isolados de M. incognita e Meloidogyne sp.1 (S2N1). Considerando abordagens morfométricas, morfológicas e moleculares, foi possível concluir que os três fenótipos enzimáticos (I1N1, I2N2 e S2N1) caracterizam a espécie M. incognita. Nenhuma correlação foi detectada entre os fenótipos isoenzimáticos, as raças dos isolados e a topologia da árvore. Morfologicamente, os isolados de (S2aN3) diferem de M. incognita e M. hispanica pelas características do estilete das fêmeas. Os resultados deste estudo sugerem que os dois isolados com fenótipo S2aN3 pertencem à espécie ainda não identificada, mas geneticamente relacionada à M. hispanica. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT Meloidogyne incognita is one of the most polyphagous species of root-knot nematode occurring in Brazil and worldwide. Eight M. incognita representing two enzymatic phenotypes (esterase and malate desydrogenase: I1N1, I2N1) and four cryptic isolates of Meloidogyne sp.1 (S2N1), representing one cytological type (3n=40-46), and four host races were studied. Meloidogyne hispanica (H3N1, 2n=32-36) and two isolates of an atypical Meloidogyne sp.2 (S2N3, 3n= 40-44) were included in this study. All isolates were tested with three species-specific molecular markers, i.e., SCARs, developed for M. incognita. The pairs of primers B06F/R, miF/R and incK14F/R amplified three species-specific fragments of 1,200 bp, 955 bp and 399 bp, respectively, and were observed for the eight isolates of M. incognita and four of Meloidogyne sp.1, and not for those belonging to either M. hispanica or Meloidogyne sp.2. Overall genetic variability of Meloidogyne isolates in this study was evaluated using RAPD and ISSR markers. Phylogenetic analyses of the resulting matrices using UPGMA, Maximum Parsimony and Bayesian inference produced trees with the same general topology with respect the relationships among species. Two strongly supported monophyletic clades were observed: clade I, consisting of M. hispanica isolates and the atypical Meloidogyne sp.2, and clade II, clustering together all M. incognita isolates and Meloidogyne sp.1 (S2N1). Considering morphometrical, morphological and molecular approaches, it was possible to conclude that the three enzymatic phenotypes (I1N1, I2N2 and S2N1) characterized M. incognita. No strict correlation could be detected between either, the isoenzymatic phenotypes or the races of the isolates, and the tree topology. Morphologically, the S2N3 isolates differ from M. incognita and M. hispanica by female stylet features. The results of this study suggested that the two isolates with phenotypes S2aN3 belong to unidentified species closely related to M. hispanica.

Meloidogyne mayaguensis foi detectado pela primeira vez no estado de Goiás, em duas propriedades (Formosa e Luziânia), causando dano em pomares comerciais de goiaba (Psidium guajava) cv. Paluma de um ano de idade e de 14 anos, respectivamente. Plantas infectadas pelo nematóide mostraram redução de crescimento, clorose generalizada, deficiência nutricional e redução qualitativa e quantitativa de produção. As raízes severamente infestadas apresentaram-se pouco desenvolvidas e deformadas pela presença de múltiplas galhas de tamanho variado. Mamoeiros (Carica papaya) cv. Formosa, plantados em consórcio com as goiabeiras na propriedade de Formosa, apresentaram numerosas galhas no sistema radicular, embora, nenhum sintoma secundário de meloidoginose tenha sido observado na parte aérea. A produção de frutos dos mamoeiros foi alta, evidenciando tolerância dessa cultivar ao nematóide. O fenótipo M2 para a isoenzima esterase (Rm: 0,7, 0,9) foi detectado e M. mayaguensis identificado em ambas as culturas e propriedades. As análises com marcadores moleculares espécie-específica usando primers que amplificam regiões intergênicas do DNA ribossomal e do DNA mitocondrial também confirmaram esse diagnóstico. Levantamento realizado, em outras localidades da fazenda em Formosa mostrou a presença de Meloidogyne javanica em baixa população, corroborando a idéia de introdução de M. mayaguensis na área, através do plantio de mudas infectadas, oriundas da região de Petrolina. Na propriedade em Luziânia, o nematóide é provavelmente de ocorrência natural, considerando-se a idade das plantas e o número reduzido de goiabeiras infectadas.