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Orientador: Margareth Castro Ozelo Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: Uma complicação decorrente do tratamento da hemofilia é a formação de anticorpos neutralizadores da atividade coagulante do fator VIII ou IX (inibidores). Diversos fatores estão relacionados com o desenvolvimento desses inibidores em indivíduos com hemofilia, incluindo fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores genéticos, a mutação associada ao diagnóstico da hemofilia é um fator de risco bem documentado. Recentemente foi observada a maior ocorrência de inibidores em indivíduos da etnia negra. O objetivo deste trabalho foi analisar os aspectos genéticos e não genéticos envolvidos no desenvolvimento de inibidores. Foram incluídos nesse estudo 411 pacientes hemofílicos, sendo 321 com hemofilia A (HA) (238 famílias) e 99 com hemofilia B (HB) (59 famílias). A presença de inibidores foi constatada apenas entre os pacientes HA graves. Do total de 220 HA graves desse estudo, 46 (20,9%) apresentaram inibidor detectado em pelo menos uma ocasião após sua inclusão no estudo. Mutações consideradas de alto-risco para o desenvolvimento de inibidores foram identificadas em 125/220 pacientes HA graves (58,8%), e 33 deles desenvolveram inibidores (26,4%). Considerando o grupo étnico de acordo com traços físicos e ancestralidade, 38% dos pacientes HA graves foram classificados como negros. A incidência de inibidores foi maior nesse grupo de pacientes (31% do total de pacientes HA graves classificados como negros) quando comparada aos pacientes caucasóides (20% do total de pacientes HA graves classificados como caucasóides). Recentemente, foi observado que a maior incidência de inibidores em uma população norte-americana de pacientes com HA, estava relacionada com a presença de determinados haplótipos no gene do fator VIII. Esta observação poderia ser explicada pelo fato dos as proteínas expressas pelos haplótipos que aparecem exclusivamente entre a população negra (denominados H3 e H4), estarem ausentes nos concentrados de fator VIII recombinantes utilizados rotineiramente no tratamento desses pacientes. Em nossa análise a presença desses haplótipos não está relacionada com a maior freqüência de inibidor na população negra desse estudo. Além disso, a distribuição dos diferentes haplótipos do gene do fator VIII, classificados de H1 a H6, foi distinta entre todos os grupos étnicos brasileiros e norte-americanos. Essa observação pode ser explicada pela origem distinta entre os negros que imigraram da África para o Brasil e para a América do Norte, assim como o alto índice de miscigenação de nossa população. Em outra fase desse estudo, foi realizada a análise comparativa da expressão gênica a partir de amostras de RNA mensageiro (RNAm) extraídas em pool leucocitário de pacientes com HA grave, com ou sem a presença de inibidores. Na avaliação que incluiu numa primeira análise pacientes de uma mesma família discordante para a presença de inibidor e, em uma segunda fase, indivíduos não relacionados, foram observados 50 genes mais expressos e 16 genes menos expressos em pacientes com inibidor em comparação aos sem inibidor. Dentre esses genes foram selecionados dez, levando-se em conta sua participação na resposta imune ou sua correlação prévia com o desenvolvimento de inibidores em outros estudos. Pela técnica de PCR em tempo real, observou-se que os genes da interleucina 8 (IL-8) e da cistatina F (CST7) demonstraram ser mais expressos em pacientes com inibidor, enquanto que o gene da interleucina 10 (IL-10) foi menos expresso nesse grupo de pacientes. Dessa forma, nossos resultados fortalecem a idéia de que o mecanismo de desenvolvimento de inibidores em hemofilia é complexo e ainda não totalmente esclarecido e que existe um grande envolvimento de diversos genes relacionados com sistema imune na formação desses inibidores. O estudo em diferentes populações é uma importante etapa para o entendimento dos fatores de risco para o desenvolvimento de inibidores. Esse foi o primeiro trabalho realizado no Brasil incluindo pacientes de diversas regiões e analisando simultaneamente diferentes fatores e seu envolvimento com o desenvolvimento de inibidores. A determinação desses fatores de risco ajudará no futuro a determinar um tratamento diferenciado para o controle e sobretudo prevenção do desenvolvimento de inibidores Abstract: The most serious complication of the treatment of hemophilia is the development of neutralizing antibodies to coagulation activity of factor VIII or IX (inhibitors). Several risk factors are related to the development of these inhibitors in patients with hemophilia, including genetic and environmental factors. Among genetic factors, the mutation associated with the diagnosis of hemophilia is a risk factor well documented. Recently, it was observed a higher incidence of inhibitors in African ancestry patients. The aim of this study was to analyze the genetic and non-genetic factors involved in the development of inhibitors. The study included 411 hemophilia patients, of which 321 with hemophilia A (HA) and 99 with hemophilia B (HB), belonging to a total of 238 and 59 families, respectively. The inhibitors were observed only in severe HA patients. From the 220 severe HA, 46 (20.9%) had inhibitor. The high risk mutation for the development of inhibitors were identified in 125 / 220 (58.8 %) severe HA patients, and 33 (26.4 %) of them developed inhibitors. Considering the ethnic group according to physical traits and ancestry, 38 % of severe HA patients were classified as black. The incidence of inhibitors is higher in this group of patients (31%) when compared to Caucasian patients (20%). The higher risk of inhibitor among African-Brazilians, could not be explained by the presence of the distinct factor VIII haplotypes, such as H3 and H4, as suggested in previous study. In fact, the prevalence rates of these haplotypes were distinct between Brazilians and North Americans, probably due to the fact that migrations of blacks to Brazil and to North America were originated from different geographic areas of Africa. In another phase of this study, we performed a comparative analysis of gene expression in samples of messenger RNA (mRNA) extracted from leukocytes of inhibitor and non-inhibitor patients with severe HA was performed. The evaluation consisted of an initial analysis of severe HA patients siblings, or from the same family, discordant for inhibitor development and in a second phase a group of unrelated individuals. Using the bioarrays technology 50 genes were upregulated and 16 were downregulated in inhibitor patients compared with non-inhibitor patients. Ten genes were selected among them, which are involved in immune response and were related to inhibitors development in other studies. It was observed by real time PCR that the genes for interleukin 8 (IL-8) and cystatin F (CST7) were upregulated and for interleukin 10 (IL-10) was downregulated in inhibitor patients. In conclusion, our results strengthen the idea that the mechanism of inhibitor development in hemophilia is complex, not clear and there is a large involvement of several genes related to the immune system in the development of these inhibitors. The study in different populations is important to understand the risk factors for the development of inhibitors. This is the first work in Brazil, to study patients from various regions and to performe analysis of different factors and their involvement in the development of inhibitors. The determination of these risk factors will help in the future to determine differential treatment for the control and in particular, for preventing the development of inhibitors Doutorado Clínica Médica Doutor em Clínica Médica

A detailed genome mapping analysis of 213,636 expressed sequence tags (EST) derived from nontumor and tumor tissues of the oral cavity, larynx, pharynx, and thyroid was done. Transcripts matching known human genes were identified; potential new splice variants were flagged and subjected to manual curation, pointing to 788 putatively new alternative splicing isoforms, the majority (75%) being insertion events. A subset of 34 new splicing isoforms (5% of 788 events) was selected and 23 (68%) were confirmed by reverse transcription-PCR and DNA sequencing. Putative new genes were revealed, including six transcripts mapped to well-studied chromosomes such as 22, as well as transcripts that mapped to 253 intergenic regions. in addition, 2,251 noncoding intronic RNAs, eventually involved in transcriptional regulation, were found. A set of 250 candidate markers for loss of heterozygosis or gene amplification was selected by identifying transcripts that mapped to genomic regions previously known to be frequently amplified or deleted in head, neck, and thyroid tumors. Three of these markers were evaluated by quantitative reverse transcription-PCR in an independent set of individual samples. Along with detailed clinical data about tumor origin, the information reported here is now publicly available on a dedicated Web site as a resource for further biological investigation. This first in silico reconstruction of the head, neck, and thyroid transcriptomes points to a wealth of new candidate markers that can be used for future studies on the molecular basis of these tumors. Similar analysis is warranted for a number of other tumors for which large EST data sets are available. Univ São Paulo, Fac Med, Inst Psiquiatria, Neurosci Lab,Dept Psiquiatria, BR-05403010 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Fac Med, Dept Bioquim, BR-05403010 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Fac Med, Lab Bioinformat, Inst Quim, BR-05403010 São Paulo, Brazil Univ São Paulo, Fac Med, Disciplina Oncol, Dept Radiol, BR-05403010 São Paulo, Brazil Universidade Federal de São Paulo, Mol Endocrinol Lab, Dept Med & Morfol, São Paulo, Brazil Hosp Canc AC Camargo, Dept Cirurg Cabeca & Pescoco & Otorrinolaringolog, São Paulo, SP, Brazil Univ Estadual Campinas, Inst Biol, Dept Genet & Evolucao, Lab Biol Mol & Genom Hemoctr, Campinas, SP, Brazil Univ Estadual Campinas, Inst Biol, Dept Genet & Evolucao, Lab Genom & Expressao, Campinas, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Dept Biol, Inst Biociencias, Araraquara, SP, Brazil Fac Med Sao Jose Rio Preto, Dept Biol Mol, Sao Jose de Rio Preto, SP, Brazil Univ Estadual Paulista, Escola Farm, Dept Ciencias Biol, Araraquara, SP, Brazil Universidade Federal de São Paulo, Mol Endocrinol Lab, Dept Med & Morfol, São Paulo, Brazil Web of Science

Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Andrey dos Santos, Maria Laura Costa do Nascimento Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Considerando a extrema importância da utilização do DNA fetal livre na circulação materna (cffDNA) para diagnóstico pré-natal não invasivo e o elevado custo dos kits comerciais, o presente estudo, avaliou três métodos de extração de cffDNA com intuito de estabelecer uma técnica eficiente e de baixo custo. Para avaliar a eficiência e a qualidade de três técnicas de extração de DNA, foi utilizado o valor médio de ct gerado pelo equipamento de qPCR das amostras extraídas em cada método e comparado com o valor médio obtido pelas amostras extraídas pelo kit comercial. Além da análise para o polimorfismo na região promotora do gene uridina difosfato-glicuronil transferase (UGT1A1). Foram utilizadas amostras de plasma de 200 gestantes com idade gestacional a partir de 8 semanas. Os resultados indicam que as amostras extraídas apresentaram uma eficiência de 94% para extração de DNA fetal por kit comercial; 88% de eficiência para o método Triton-x100/Heat/Phenol (THP); 75% de eficiência para o método por Iodeto de Sódio (NaI) e 83% para o método por Tampão de Proteinase K (Tp Prot K). A análise para o polimorfismo na região promotora do gene UGT1A1 permitiu verificar a necessidade de um refinamento das técnicas, nas etapas iniciais como coleta do sangue materno e separação do plasma, para diminuir a contaminação por DNA materno. Além das análises utilizando marcadores moleculares, foi demonstrado as diferenças nos custos gerados em cada método utilizado que chegou a 100x mais baixo quando comparado ao kit comercial. Os métodos testados ainda necessitam de adequações, mas os resultados obtidos até o presente momento, demonstram uma grande possibilidade de estes serem implantados na Unidade de saúde pública e assim, tornar-se acessível a um número maior na população Abstract: Brazil has a great potential in the development of research for the prenatal diagnosis noninvasive, through the Cell free fetal DNA (cffDNA) analysis. However, in Brazil this methodology is accessible only to a small portion of the population because it is a technical costly yet. The aim of this study was to test different types of protocols for the extraction cffDNA and determine which provides the better quality and yield of the DNA sample associated with low cost. Plasma sample from 200 pregnant women with gestational age from 8 weeks were evaluated by different protocols: The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen,UK), Triton/Heat/Phenol(THP), proteinase K/phenol and NaI/PEG8000. The quality of the purified DNA were checked by SYBR green qPCR for SRY gene and the analysis for polymorphism in the promoter region of the UGT1A1 gene. The results showed that the extracted sample by commercial kit (Qiagen) had 94% efficiency; THP method 88%; NaI method 75% and proteinase K/phenol method 83%. The analysis for the polymorphism in the promoter region of the UGT1A1 gene showed the necessity of a improvement of the maternal blood collection and plasma separation, to decrease the contamination by maternal DNA. The costs generated by each method that came to 100x lower when compared to the commercial kit. Although preliminary, these data demonstrate that THP and proteinase K/phenol protocols presented a great potential to be adopted as cost-effective and usefull techniques for extracting cffDNA which makes the cost of molecular examination more accessible to low-income populations Mestrado Clínica Médica Mestra em Clínica Médica CAPES 01P-04520-2013

Orientador: Eduardo Rochete Ropelle Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O hipotálamo é uma estrutura do sistema nervoso central responsável por controlar diversas funções orgânicas. Recentes estudos apontam para uma intrigante relação entre o hipotálamo e o metabolismo do músculo esquelético. No presente estudo, demonstramos que a ação central da Interleucina 6 (IL6) é capaz de sensibilizar a musculatura esquelética aumentando oxidação de ácido graxo (OAG) em camundongos. Identificamos que essa ação ocorre através da ativação da via ERK 1/2 hipotalâmica, uma vez que a infusão intracerebroventricular (ICV) do inibidor farmacológico da ERK1/2, o PD98059, aboliu o efeito causado IL6 sobre OAG no músculo esquelético. Para avaliar a relevância fisiológica destes achados, observamos que o exercício físico foi capaz de estimular a via IL6/ERK1/2 no hipotálamo ventromedial (VMH) e ativar a OAG no músculo esquelético. Por outro lado, a inibição da ação central da IL6 através da injeção ICV do anticorpo anti-IL6 em camundongos, atenuou o efeito do exercício sobre a OAG no músculo. Adicionalmente, camundongos IL6 knockout (IL6KO), apresentaram deficiência na OAG no músculo quando submetidos ao exercício. Ao passo que a infusão exógena do recombinante da IL6 via ICV, restaurou o feito sobre ativação da OAG muscular nos animais IL6KO. Finalmente, identificamos que a comunicação entre o hipotálamo e o músculo esquelético ocorre através da via ?2AC adrenérgica, pois o uso do inibidor desta via, a Ioimbina, aboliu ativação da OAG promovido pela injeção ICV do recombinante de IL6, a mesma resposta observamos em camundongos duplo knockout para receptores adrenérgicos ?2AC. Coletivamente, estes resultados mostram que a via IL6/ERK1/2 hipotalâmica participa da OAG muscular em camundongos Abstract: The hypothalamus is a structure of the central nervous system responsible for controlling various organic functions. Recent studies point to an intriguing relationship between the hypothalamus and skeletal muscle metabolism. In this study, we demonstrated that the central action of interleukin 6 (IL6) is able to sensitize the increasing skeletal muscle fatty acid oxidation (FAO) in mice. We identified that this action occurs through the activation of the ERK 1/2 hypothalamic, since the infused intracerebroventricularly (ICV) of the pharmacological inhibitor of ERK1 / 2, PD98059, abolished the effect of IL6 central FAO in skeletal muscle. To evaluate the physiological relevance of these findings, we observed that exercise was able to stimulate via IL6 / ERK1 / 2 in the ventromedial hypothalamus (VMH) and activate the FAO in skeletal muscle. On the other hand central inhibition action of IL6 through ICV injection of anti-IL-6 antibody in mice attenuated the effect of exercise on muscle FAO. Additionally, IL6 knockout mice (IL6KO) showed deficiency in OAG in muscle when subjected to exercise. Whereas exogenous infusion of recombinant IL6 ICV restored the effect on activation of muscle FAO in IL6KO animals. Finally, we identified that the communication between the hypothalamus and skeletal muscle occurs through ?2AC adrenergic pathway, since the use of the inhibitor of this pathway, yohimbine, abolished FAO activation promoted by ICV injection of recombinant IL6, the same response observed in mice double knockout ?2AC adrenergic receptors. Collectively, these results show that the pathway IL6 / ERK1 / 2 hypothalamic participates in the FAO muscle in mice Mestrado Clínica Médica Mestra em Ciências FAPESP 2012/23006-1