Search

Exploring the molecular mechanism how pathogens successfully colonize on their host plant is crucial for developing sustainable strategies to decrease crop yield losses. Fungal colonization on plants depends upon the ability to manipulate the immune defense response of the plant. Pattern recognition receptors (PRR) recognize molecules associated with the invading pathogen, so called pathogen associated molecule pattern (PAMP), which leads to activation of immune responses (PAMP-triggered immunity; PTI). One of the earliest observable aspects of plant defense, is the production of reactive oxygen species in the apoplast (ROS burst), generated by the NADPH oxidase. For pathogens to overcome this response, they secrete molecules, called effectors, which suppress local and systemic defense responses. ROS burst screening of Ustilago maydis effectors by heterologous expression in Nicotiana benthamiana revealed a group of putative effectors that show ROS burst inhibition. For this purpose, out of 288 Ustilago maydis effectors that were expressed without signalpeptide in Nicotiana benthamiana plants, 34 were identified to interfere with the plant defense by inhibiting ROS accumulation upon PAMP perception. The main purpose of this study was to elucidate the mode of action of four identified Ustilago maydis effectors ROSIE1-4 (Ros-burst Inhibiting Effectors 1-4). To illuminate potential ways effectors mediate ROS burst inhibition, ROSIE 1-4 were transiently expressed in Nicotiana benthamiana plants without signalpeptide and with epitope tags. Potential interacting proteins were identified by mass spectrometry after co-immunoprecipitation. Comparative analysis of the MS data revealed 21 plant proteins that showed to be potentially specifically in the complex with one or more of the tested effector candidates. To gain more insight into their involvement in PTI, virus induced gene silencing of putative host targeted proteins were tested in Nicotiana benthamiana and the efficiency of silencing was verified by performing qPCR to monitor the decrease of gene expression. Interestingly, 8 potentially interacting proteins were showing a significantly increase or decrease of ROS activity upon PAMP treatment when silenced in plants, which suggest that they genetically behave as negative or positive regulators in PAMP-triggered immunity. Furthermore, subcellular localization assays linked to ROS-burst assays provided important information about the place of action of observed ROSIE´s within the cell. Ectopic expression of the effectors fused to various mislocalisation tags, showed that ROSIE 1 is highly active in the nucleus and the cytosol, while ROSIE 4 acts likely at the cytosolic side of the plasma membrane upon PAMP perception in plants. In contrary, ROSIE 2 and ROSIE 3 demonstrate a strong suppression of ROS in all tested cellular compartments. The U. maydis deletion strains of ROSIE 2 and ROSIE 3 genes did not show any visible virulence defect. A slight but not significant loss of gall formation was however observed for the deletion strain of ROSIE 1. In summary, this master thesis demonstrates that several plant proteins that are potentially in a complex with ROS-burst inhibiting effectors, either having a positive or negative influence on PTI-signaling in plants adding novel players of the plant Immune network to the puzzle. Additionally, the results shed new light on how the biotrophic fungus U. maydis dampens PTI., Das Erforschen von molekularen Mechanismen die es dem phytopathogenen Pilzen ermöglichen erfolgreich Wirtspflanzen zu kolonisieren, ist ein entscheidender Faktor für die Entwicklung von effektiven Strategien zur Verringerung von Nutzpflanzenbefall. Eine pilzliche Kolonisation bedingt dabei das pflanzlich Immunsystem zu manipulieren und zu überwinden. Die basalen induzierten Abwehrmechanismen einer Pflanze werden durch das Erkennen pathogen assoziierter Molekülen (PAMP-pathogen associated molecule pattern) über spezifische pflanzliche Rezeptoren (PRR-pattern recognition receptor) aktiviert, was letztendlich eine Immunantwort (PTI-PAMP triggered immunity) auslöst. Eine der frühesten Abwehrmaßnahmen stellt die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies im Apoplast (ROS burst) dar, die mit Hilfe der NADPH-Oxidase erzeugt werden. Um diese Erkennungskaskade zu unterbrechen, sekretieren Pathogene kleine Proteinmoleküle in das Wirtsgewebe, die sogenannten Effektoren, die in der Lage sind pflanzenseitig die Immunität zu unterdrücken und den Metabolismus zu manipulieren. Mit Hilfe eines ROS – Burst Screens in dem Ustilago maydis Effektoren ohne Signalpeptid in Nicotiana benthamiana Pflanzen, produziert wurden, konnte eine Gruppe potenzieller Effektoren identifiziert werden, welche die Bildung von ROS unterdrücken. Dafür wurden 288 Ustilago maydis Effektoren getestet, wobei 34 verschiedene Effektoren eine ROS Akkumulation verhindern konnten. Ziel dieser Studie war es vier dieser Effektorenkandidaten von Ustilago maydis, ROSIE1-4 (ROS-burst Inhibiting Effector 1-4) im Zusammenhang mit der Unterdrückung von ROS Bildung näher zu charakterisieren. Im ersten Schritt wurden zur Identifizierung möglicher interagierender Proteine, diese in Nicotiana benthamiana exprimiert. Potenziell interagierende Proteine wurden durch Massenspektrometrie nach einer Ko-immunpräzipitation identifiziert und davon wurden 21 für weitere Analysen ausgewählt. Um mehr über die Rolle dieser pflanzlichen Proteine in Bezug auf die PTI zu erfahren, wurden ihre Gene durch Virus-induziertes Gen-Silencing in Nicotiana benthamiana gesilenced und ihre transkriptionelle Stilllegung mit qPCR auch überprüft. Die jeweils in einem möglichen Zielgen stillgelegten Pflanzen wurden für ROS-burst assays mit PAMPs behandelt. Interessanterweise führte die transkriptionelle Reduktion bei 8 Genen zu einer signifikanten Zunahme bzw. Abnahme der ROS Aktivität nach PAMP Behandlung in der Pflanze. Dieses deutet darauf hin, dass sich die mit den ROS-burst interferierenden Effektoren im Komplex befindlichen Wirtsgene mögliche positive oder negative Regulatoren in der ROS-burst vermittelten pflanzlichen Abwehr sind. Darüber hinaus lieferte ein subzellulärer Lokalisierungstest in Kombination mit ROS burst assays wichtige Informationen über den Ort ihrer Wirksamkeit innerhalb einer Zelle. Nach Flagellinbehandlung konnte beobachtet werden, dass ROSIE 1 bei der ektopischer Expression in verschiedene Zellkompartimente hochaktiv im Kern und im Zytosol ist, während ROSIE 4 seine stärkste Aktivität in der Plasmamembrane zeigte. Hierbei konnte auch gezeigt werden, dass ROSIE 2 und ROSIE 3 eine starke Unterdrückung von ROS in allen getesteten Zellkompartimenten aufweisen. Ustilago maydis Deletions-Mutanten der entsprechenden Effektor Gene, zeigten keinen sichtbaren Virulenzdefekt. Allerdings konnte für ROSIE 1 eine leichte Abnahme der Gallenbildungsrate in der Pflanze festgestellt werden. In dieser Masterarbeit konnten mehrere Pflanzenproteine identifizieren werden, die mit ROS-burst inhibierenden Effektoren interagieren und einen direkten positiven oder negativen Einfluss auf das Pflanzenabwehrsystem haben. Diese Ergebnisse werfen ein neues Licht auf mehrere verschiedene Pflanzenproteine und deren Involvierung in die ROS-burst vermittelte pflanzliche Abwehr.

As the gall-inducing smut fungus Ustilago maydis colonizes maize (Zea mays) plants, it secretes a complex effector blend that suppresses host defense responses, including production of reactive oxygen species (ROS) and redirects host metabolism to facilitate colonization. We show that the U. maydis effector ROS burst interfering protein 1 (Rip1), which is involved in pathogen-associated molecular pattern (PAMP)-triggered suppression of host immunity, is functionally conserved in several other monocot-infecting smut fungi. We also have identified a conserved C-terminal motif essential for Rip1-mediated PAMP-triggered suppression of the ROS burst. The maize susceptibility factor lipoxygenase 3 (Zmlox3) bound by Rip1 was relocalized to the nucleus, leading to partial suppression of the ROS burst. Relocalization was independent of its enzymatic activity, revealing a distinct function for ZmLox3. Most importantly, whereas Zmlox3 maize mutant plants showed increased resistance to U. maydis wild-type strains, rip1 deletion strains infecting the Zmlox3 mutant overcame this effect. This could indicate that Rip1-triggered host resistance depends on ZmLox3 to be suppressed and that lox3 mutation-based resistance of maize to U. maydis requires functional Rip1. Together, our results reveal that Rip1 acts in several cellular compartments to suppress immunity and that targeting of ZmLox3 by Rip1 is responsible for the suppression of Rip1-dependent reduced susceptibility of maize to U. maydis., The research leading to these results has received funding from the European Research Council under the European Union’s Seventh Framework Program ERC-2013-STG, Grant Agreement: 335691, the Austrian Science Fund (FWF): [I 3033-B22], the Austrian Academy of Sciences (OEAW) and the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Germany’s Excellence Strategy (EXC 2070-390732324). A.P.S. was supported by the Development and Innovation Office of Hungary (GINOP-2.3.2-15-2016-00032).