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Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista, con una gran versatilidad metabólica y extraordinaria habilidad para crecer en distintos nichos ecológicos. P. aeruginosa es uno de los mayores responsables de infecciones nosocomiales, caracterizado por su resistencia a antibióticos y su gran arsenal de factores de virulencia. Existen múltiples estudios evaluando la relación resistencia a antibióticos-virulencia en cepas clínicas; mientras que los trabajos realizados con Pseudomonas de muestras no-clínicas son nulos o incompletos. Por ello, los dos primeros objetivos de esta tesis fueron estudiar la prevalencia de Pseudomonas en muestras fecales de animales sanos y de niños y en alimentos vegetales; así como determinar su fenotipo de resistencia a agentes antipseudomónicos. La prevalencia de Pseudomonas en animales y en niños fue de 6,5 y 6,7%, respectivamente; mientras que en alimentos vegetales fue de 53,1%. De los 330 aislados obtenidos, P. putida y P. aeruginosa predominaron entre las 20 especies detectadas. El 44,8% de los aislados de Pseudomonas spp. mostró resistencia al menos a uno de los antibióticos testados, destacando aztreonam (41,5%). El fenotipo de multirresistencia se detectó en cuatro aislados (1,2%). P. aeruginosa se aisló en 6,3% de las muestras de niños, en 0,8% de animales y en 17,9% de alimentos vegetales; caracterizadas por su alto porcentaje de sensibilidad antimicrobiana (93,1%). El tercer objetivo fue tipificar molecularmente los aislados de Pseudomonas spp., observándose una alta diversidad clonal mediante PFGE. No se detectaron patrones relacionados entre cepas de distintos orígenes. En las 76 cepas de P. aeruginosa, el serotipo O:6 fue el más frecuente (38%) y también se observó una elevada diversidad clonal (70 patrones de PFGE). Entre las 55 secuencias tipo (ST) detectadas por MLST, 14 de ellas fueron nuevas, y algunos clones (como ST244, ST252, ST253, ST277, ST395 y ST1033) se repitieron entre las cepas aisladas de niños y de alimentos vegetales. Destaca la presencia de clones intercontinentales, como ST155, ST244, ST252, ST274 y ST395, entre las cepas de P. aeruginosa de los distintos orígenes. El estudio de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos también fue un objetivo. Ningún aislado presentó un fenotipo carbapenemasa; sin embargo, las cepas de P. aeruginosa mostraron un gran polimorfismo en la proteína OprD (13 patrones). Se detectó la secuencia de inserción ISPa1635 truncando el gen oprD (GenBank MH050332) en una de las cepas resistentes a imipenem. El quinto objetivo fue estudiar la presencia de factores de virulencia, la producción de biofilm, pigmentos, y la actividad elastasa en cepas de P. aeruginosa. El 80,2% de P. aeruginosa presentó el genotipo exoU-/exoS+; mientras que el genotipo exoU+/exoS-, asociado a una elevada citotoxicidad, se detectó en el 17,1%. Seis P. aeruginosa aisladas de animales sanos carecían de los genes codificantes de los efectores del Sistema de Secreción Tipo 3 y de los genes exoA y rhlC, pero ninguna de estas seis cepas amplificó el gen de la exolisina ExlA, descrito recientemente. Todas las cepas de P. aeruginosa portaban los genes lasA, lasB, aprA, rhlAB, rhlI y rhlR. Los genes lasI y lasR no amplificaron en tres cepas que pertenecían al clon ST155. Se detectaron secuencias de inserción (ISPre2, IS1411, ISPa91 y IS1394) truncando el gen lasR (GenBank MH050329, MH050330, MH050331, MG815635, respectivamente) en cuatro cepas de P. aeruginosa. La producción de biofilm, piocianina y piorrubina, así como la actividad elastasa fue superior a la cepa de referencia PAO1 en el 92, 64, 67 y 76% de las cepas de P. aeruginosa, respectivamente. El sexto objetivo fue estudiar el genoma completo de las cepas de P. aeruginosa pertenecientes al clon ST155. Se observaron distintos mecanismos de resistencia intrínsecos y alteraciones en sus bombas de expulsión activa; así como la presencia de la isla de patogenicidad del plásmido pUM505 que contiene el gen crpP, descrito recientemente Las variantes de CrpP detectadas en estas P. aeruginosa, mostraban mutaciones en las posiciones catalíticas implicadas en la inactivación del ciprofloxacino (identidad 94-99%) y una localización cromosómica. Los últimos objetivos fueron detectar y caracterizar los biosurfactantes producidos por Pseudomonas spp. El 97,3% de las cepas de P. aeruginosa y el 32% de las cepas no aeruginosa, principalmente P. putida y P. mendocina, mostraron producción de biosurfactantes mediante el método CTAB-MB agar. Los tres biosurfactantes purificados de dos P. mendocina y una P. aeruginosa mostraron actividad antimicrobiana frente a S. aureus (rango CMI: 0,21-3,38 mg/mL) y P. aeruginosa (0,11-0,42 mg/mL). Los ramnolípidos de P. aeruginosa se asociaron probablemente a la producción de RhlAB y RhlC; mientras que queda pendiente de resolver la caracterización estructural y genética de los biosurfactantes de P. mendocina. Esta tesis, aporta datos de gran importancia en epidemiología, resistencia a antibióticos y virulencia de Pseudomonas de origen no-clínico con aplicación en salud humana, salud animal y seguridad alimentaria. Y a su vez, la detección de biosurfactantes con actividad antimicrobiana constituye una importante herramienta biotecnológica de aplicación industrial y medioambiental.

Las enterobacterias son patógenos oportunistas que habitualmente se encuentran en la microbiota intestinal humana y de otros mamíferos. Algunas especies de enterobacterias poseen genes codificantes de beta-lactamasas AmpC de manera intrínseca en su cromosoma y determinadas mutaciones en dichos genes puede provocar el aumento de su espectro de acción. Por otra parte, las enterobacterias son capaces de adquirir mecanismos de resistencia a diferentes familias de antibióticos. En los últimos años ha aumentado la preocupación por la diseminación de genes codificantes de carbapenemasas debido a la dificultad en el tratamiento de infecciones por bacterias que los portan. En esta tesis se ha llevado a cabo la detección y caracterización de genes de beta-lactamasas AmpC y de carbapenemasas en enterobacterias, así como el desarrollo de nuevos métodos que permitan su detección. El primer objetivo fue aislar y caracterizar enterobacterias de muestras fecales de individuos sanos. Se obtuvieron 70 aislados en los que se analizó el fenotipo de resistencia y la presencia de fenotipo AmpC y beta-lactamasa de espectro extendido (BLEE). Se detectó un 57% de aislados resistentes a ampicilina, 22 con fenotipo AmpC y 3 con fenotipo BLEE. De los 22 aislados con fenotipo AmpC, se detectó el gen cromosómico ampC especie-específico en 21 aislados (13 Citrobacter freundii complex, 8 Enterobacter cloacae) y al menos dos copias del gen blaCMY-2 localizado en un plásmido conjugativo IncK de 78 Kb, en un aislado de Escherichia coli ST405. La prevalencia de aislados portadores de genes ampC plasmídicos fue del 1,4 %. El segundo objetivo fue la caracterización de enterobacterias de origen clínico. Se estudiaron 81 aislados sospechosos de portar beta-lactamasa AmpC o pertenecientes a especies poseedoras de cAmpC. En 57 de estos aislados se detectaron genes ampC, 8 de ellos de localización plasmídica (E. coli, Citrobacter, Proteus y Klebsiella) y los 49 restantes de localización cromosómica (24 Citrobacter, 16 Enterobacter, 7 Morganella y 2 Proteus). En todos los aislados de ambos orígenes se estudió la presencia de otros genes de resistencia. Los aislados de muestras fecales de individuos sanos con fenotipo BLEE portaban blaSHV-12 (2 aislados) y blaCTX-M-15+blaOXA-1 (1). Se detectó una amplia variedad de genes de resistencia a betalactámicos, así como la presencia de genes de resistencia a aminoglucósidos, sulfamidas, cloranfenicol, tetraciclinas, rifampicina y quinolonas. Se caracterizaron 20 integrones de clase 1 con gran diversidad en sus estructuras y 3 integrones de clase 2. El tercer objetivo fue analizar el polimorfismo de los genes ampC y qnrB cromosómicos de los géneros Citrobacter, Enterobacter y Morganella; así como estudiar su diversidad clonal en los aislados de ambos orígenes. Se detectó un alto grado de polimorfismo de los genes ampC, así como del gen ampR y de las regiones intergénicas ampR/ampC. Se obtuvo un total de 29 variantes de CMY; 15 de ACT, 4 de DHA y 2 de MIR. Entre las variantes detectadas, 43 no habían sido descritas anteriormente, por lo que se incluyeron en GenBank y www.lahey.org/Studies. Los aislados de estos géneros no sólo mostraron una alta variedad en estos genes sino que también mostraron una alta diversidad clonal entre ellos. Además, se detectaron 12 variantes del gen qnrB entre los 18 aislados de Citrobacter qnrB-positivos (5/13 de muestras fecales/clínicas, respectivamente). La variante qnrB50 ha sido descrita por primera vez . El cuarto objetivo planteado fue la caracterización bioquímica de una beta-lactamasa ESAC, así como el estudio del efecto del avibactam en aislados con este fenotipo. El estudio realizado determinó que la deleción Asn289 era la responsable de la generación del fenotipo ESAC, que a su vez no afectó la inhibición de la beta-lactamasa por avibactam. Las alteraciones en la secuencia aminoacídica de las beta-lactamasas ESAC estudiadas no modificaron la acción del inhibidor avibactam. El quinto objetivo planteado fue la caracterización de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos. En este estudio destacan la caracterización completa de los aislados, portadores de beta-lactamasas de interés, procedentes de dos casos clínicos. El primer caso clínico se debía a la infección por un aislado de E. coli ST448/B1 multirresistente que presentó 6 genes codificantes de beta-lactamasas (blaVIM-1, blaKPC-3, blaSHV-12, blaOXA-9, blaTEM-1a y blaCMY-2) así como otros 11 genes de resistencia a distintos antibióticos, y el gen de virulencia fimA. En este aislado se detectó un integrón de clase 1 que no había sido descrito previamente (In916). El segundo caso se trataba de una coinfección por C. freundii y P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos. Ambos aislados poseían el gen blaVIM-2 en integrones de clase 1 con diferentes estructuras y promotores. Este estudio es la primera descripción de C. freundii portador de blaVIM-2 en nuestro país. Finalmente, el sexto objetivo planteado fue la generación de un protocolo de detección fenotípica de carbapenemasas. En este estudio se propone un nuevo algoritmo para la detección fenotípica de carbapenemasas. En este algoritmo se incluyen dos métodos fenotípicos nuevos basados en el uso de inhibidores y permite la diferenciación de los distintos tipos de carbapenemasas, incluyendo OXA-48. Microorganisms of the Enterobacteriaceae family are opportunistic pathogens that normally are part of the human and other mammal intestinal microbiota. Some enterobacteria species possess intrinsic AmpC beta-lactamase genes in their chromosome, and mutations in those genes can cause the increase in their spectrum of action. On the other hand, the enterobacteria are able to acquire resistance mechanisms to different antibiotic families. In the last years, concerns do exist about the spread of carbapenemase genes due to the difficulty to treat infections caused by carbapenemase expressing bacteria. In this thesis, the detection and characterization of AmpC beta-lactamase and carbapenemase genes have been carried out in enterobacteria isolates; as well as the development of new carbapenemase detection methods. The first objective was to isolate and to characterize enterobacteria from healthy human fecal samples. The resistance phenotype and the presence of AmpC and Extended spectrum beta-lactamases (ESBL) were analyzed in the 70 obtained islates. Resistance to ampicillin was detected in 57% of the isolates, 22 with AmpC phenotype and 3 with ESBL phenotype. Among the 22 isolates with AmpC phenotype, the species-specific ampC gene was detected in 21 isolates (13 Citrobacter freundii complex, 8 Enterobacter cloacae). Moreover, at least two copies of the blaCMY-2 gene were localized in an IncK conjugative plasmid of 78 Kb in an Escherichia coli ST405 isolate. The prevalence of enterobacteria with plasmidic ampC genes in healthy humans was of 1,4 %. The second objective was the characterization of enterobacteria from clinical origin. Eighty-one isolates suspicious of harbouring AmpC beta-lactamases or belonging to species that carry cAmpC, were studied. ampC genes were detected in 57 of these isolates, 8 of them of plasmid location (E. coli, Citrobacter, Proteus and Klebsiella) and with chromosomal location in the 49 remaining isolates (24 Citrobacter, 16 Enterobacter, 7 Morganella and 2 Proteus). The presence of other resistance genes was studied in all the isolates from both origins. The ESBL-positive isolates recovered from fecal samples of healthy humans carried blaSHV-12 (2 isolates) and blaCTX-M-15+blaOXA-1 (1) genes. A wide diversity of beta-lactam resistance genes was detected, as well as the presence of resistance genes to aminoglycosides, sulfamides, chloramphenicol, tetracyclines, rifampicin and quinolones. Class 1 integrons were detected in 20 isolates, with diverse gene cassette arrays; class 2 integrons were detected in 3 isolates. The third objective was to analyze the polymorphism in ampC and qnrB genes among the Citrobacter, Enterobacter and Morganella genera, as well as to study the clonal diversity of isolates of both origins. A high degree of polymorphism of ampC genes was detected, as well as in the ampR gene and in the ampR/ampC intergenic regions. A total of 29 CMY variants, 15 ACT, 4 DHA and 2 MIR were detected. Among the detected variants, 43 had not been previously described, for this reason they were included in GenBank and www.lahey.org/Studies. The isolates of these genera, not only showed a high varieties ty in these genes, but also diversity of clones among the isolates. Moreover, 12 qnrB variants were detected among the 18 positive-qnrB-Citrobacter isolates (5/13 of fecal samples/clinical samples, respectively). The qnrB50 variant has been described for the first time in this thesis. The fourth objective was to carry out the biochemical characterization of ESAC betalactamases, as well as to study the avibactam effect on isolates with ESAC phenotype. The study determined that Asn298 deletion was the responsible of ESAC phenotype. This deletion did not affect the beta-lactamase inhibition by avibactam. The changes in aminoacid sequence in the studied ESAC beta-lactamases did not modify the inhibition effect of avibactam. The fifth objective was to characterize the carbapenem resistance mechanisms among carbapenem resistant enterobacteria including two clinical cases of special relevance. The first clinical case was due to an infection by a multiresistant E. coli ST448/B1 that had 6 betalactamase encoding genes (blaVIM-1, blaKPC-3, blaSHV-12, blaOXA-9, blaTEM-1a and blaCMY-2), as well as other 11 resistance genes and the virulence factor fimA gene. This isolate harbored the new class 1 integron In916, non previously reported.The second case was related to a coinfection in a patient by carbapenem resistant C. freundii and P. aeruginosa isolates. Both isolates carried the blaVIM-2 gene into class 1 integrons, but with different structures and promoters among them. This study is the first description of a blaVIM-2-carrying C. freundii isolate in Spain. Finally, the sixth objective was the generation of a phenotypic carbapenemase detection protocol. In this study, a new algorithm for the phenotypic carbapenemase detection is proposed. This algorithm includes two new phenotypic methods that are based on the use of inhibitors and that allows the differentiation of the diverse carbapenemases types, including OXA-48.

El primer informe de la Organización Mundial de la Salud (Ginebra, 30 de abril de 2014) sobre la resistencia microbiana a los antibióticos pone de manifiesto la grave amenaza que supone este hecho para la salud pública en todo el mundo. Este problema no se limita al ámbito hospitalario sino que el uso e, incluso, el abuso de antibióticos en producción animal y en agricultura también ha ocasionado el incremento de la prevalencia de microorganismos resistentes a antibióticos en los distintos nichos ecológicos. Por ello, la actividad científica propuesta en esta tesis se centra en la especie bacteriana Pseudomonas aeruginosa, que es un importante patógeno oportunista causante de infecciones nosocomiales hospitalarias, que desarrolla fenotipos de multirresistencia a los antibióticos y que dada su gran versatilidad metabólica, presenta una extraordinaria habilidad para adaptarse a gran variedad de ambientes y nichos ecológicos (como suelos, aguas o alimentos). El primer objetivo de esta tesis fue estudiar la prevalencia de Pseudomonas spp. en muestras fecales de personas sanas y de caballos sanos y en alimentos, así como analizar el fenotipo de resistencia a antibióticos en dichos aislados. Entre las muestras de personas sanas se detectó un 8,2% de P. aeruginosa totalmente sensibles a los antibióticos anti-pseudomónicos testados; mientras que en ninguna de las muestras de caballos sanos se detectó esta bacteria. Se aislaron 8 especies diferentes de Pseudomonas spp. en el 12,4% de las muestras de alimentos, predominando las especies P. aeruginosa (25% de los aislados) y P. putida (25%). Cabe destacar entre los aislados de alimentos, la elevada resistencia a ticarcilina (85%) y el hallazgo de dos cepas resistentes a imipenem en una misma muestra de pimiento. El análisis de los mecanismos de resistencia a carbapenémicos, la presencia de integrones y la tipificación molecular de los aislados fueron también objetivos de esta tesis. Se observó la ausencia de metalo-beta-lactamasas y un gran polimorfismo en la porina OprD de los aislados de P. aeruginosa no clínicos. La diversidad de mutaciones no se asoció con la resistencia a carbapenémicos; sin embargo, la presencia de una nueva secuencia de inserción, ISPa47, truncando el gen oprD de una cepa alimentaria justificó su resistencia a imipenem. Se detectó una alta variedad de secuencias tipo en las cepas de P. aeruginosa no clínicas, siendo tres de ellas nuevas (ST1059, ST1455 y ST1456), y en algunos casos, asociadas a líneas genéticas de amplia diseminación hospitalaria (como ST253). El segundo objetivo de esta tesis fue caracterizar los mecanismos de resistencia y la tipificación molecular en 214 aislados de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos recogidos en el Hospital San Pedro de Logroño (HSP, 2008-2011) y el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza (HCULB, 2008-2010). Tras seleccionar una cepa por paciente y con perfil de bandas de PFGE diferente, las 148 cepas incluidas, pertenecientes a 140 pacientes, mostraban fenotipos de multirresistencia y se apreciaba una asociación de resistencia entre carbapenémicos, aminoglucósidos y fluoroquinolonas. No se detectaron cepas portadoras de metalo-beta-lactamasas (MBL) en el HSP; sin embargo, el 49% de las cepas de P. aeruginosa del HCULB mostraron fenotipo MBL. En las cepas de ambos hospitales se observó una elevada presencia de integrotes de clase 1 (67% en HSP y 75% en HCULB); aunque se encontró una mayor diversidad y variabilidad de estructuras en los aislados de HCULB. Entre las 14 estructuras diferentes detectadas, todas excepto una, portaban genes de resistencia a aminoglucósidos. El gen blaVIM-2 se detectó en todas las cepas MBL-positivas localizado dentro de cuatro estructuras diferentes de integrón de clase 1. Respecto al análisis de la proteína OprD en las cepas clínicas, también se observó un gran polimorfismo; pero destaca que más del 50% de las cepas presentaban un codon de finalización prematuro, y en cuatro cepas el gen oprD estaba truncado por diferentes secuencias de inserción (ISPa1328, ISPsp4, ISPpu21 e ISPa45, siendo esta última descrita por primera vez en este trabajo). El estudio de MLST realizado en las cepas clínicas integrón-positivas, revela su agrupación en pocas secuencias tipo donde los clones de alto riesgo ST175 y ST235 son predominantes. El tercer objetivo fue analizar la localización cromosómica o plasmídica del gen blaVIM-2 y determinar la estabilidad de la resistencia a carbapenémicos. Aunque en 11 cepas se pudo determinar la asociación del integrón portador del gen blaVIM-2 en la estructura del transposón Tn21, todas ellas mostraron una localización cromosómica del gen. Por último, los integrones portadores del gen blaVIM-2 y la proteína OprD de cuatro cepas P. aeruginosa seleccionadas (3 cepas portadoras del gen blaVIM-2 y una con el gen oprD truncado por ISPa45), presentaron alta estabilidad tras crecimiento de 100 días en ausencia de presión antibiótica.

Salmonella enterica is an important zoonotic pathogen frequently implicated in human foodborne infections. The emergency of clinical isolates resistant to antibiotics involves serious limits for their treatments. The first objective of this thesis was to study the resistance phenotype and its relation with the serotype in 280 S. enterica isolates obtained from Hosp. San Pedro in Logrono (2007-2009) and Hosp. Clinico Universitario Lozano Blesa in Zaragoza (2009-2010). The main serotypes were Typhimurium (52%) and Enteritidis (33%), being S.Typhimurium highly associated with multi-resistance phenotypes, and in particular with resistance to ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, sulphonamides and tetracycline (ACSSuT, 29.5%). Low resistance percentages of resistance to ciprofloxacin or third generation cephalosporins were observed. The second objective was to characterize the mechanisms of resistance to betalactams (and to other antibiotics) in 203 ampicillin-resistant (AMPR) S. enterica isolates obtained from hospitals of five regional communities (including both previously mentioned). Susceptibility to amoxicillin-clavulanic acid (AMCS) was detected in 79 of these isolates, and reduced susceptibility or resistance (AMCI/R) in 124 additional isolates. The blaTEM-1 gene was basically identified among AMPR-AMCS isolates and the blaOXA-1 or blaPSE-1 genes among AMPR- AMCI/R ones. Class 1 integrons were detected in the 59% of AMPR isolates, showing 12 different structures, and the aadA2/blaPSE-1 (55%) and blaOXA-1-aadA1 (32%) being the main ones. Seven class 1 integrons, four of them lacking the 3'-conserved region, harbored the trimethoprim resistance dfr genes. The estX+psp+aadA2+cmlA1+aadA1+qacH+IS440+sul3+orf1+mef(B)?IS26 integron was detected in a S. Typhimurium isolate, and the In37 integron carrying the aac(6')-Ib-cr+blaOXA-1+catB3+arr3 structure and the unusual PcWTGN-10 promoter was also detected in a S. Thompson isolate. The ACSSuT penta-resistance phenotype was associated with the major genotypes blaPSE-1-floR-aadA2-sul1-tet(G) or blaOXA-1-catA-aadA1/strA-strB-sultet (B). The third objective was focused on the characterization of 65 blaPSE-1-positive isolates, all of them S. Typhimurium, obtained in the previous part. The Salmonella Genomic Island type 1 (SGI1), carrying blaPSE-1, floR, aadA2, sul1 and tet(G) genes, was identified in all the strains, and a new variant was detected (GenBank JF775513). All the blaPSE-1-positive strains displayed indistinguishable or closely related pulsotypes (PFGE, XbaI, SpeI enzymes), and were assigned to the sequence type ST19 (Clonal Complex CC1). The detection of virulence genes grouped the strains in three virulotypes. An 89% of them showed the same profile and included the genes located in pathogenicity islands (SPI 1-5), prophage related genes and the virulence plasmid. The fourth objective was to study 11 isolates that showed an extended-spectrum betalactamase (ESBL) or AmpC phenotype. The associated genes were the following ones: blaCTX-M-9 (serotype Virchow, 2 isolates), blaCTX-M-10 (Virchow, 2), blaCTX-M-14a (Enteritidis, 1), blaCTX-M-15 (Gnesta, 1, and S. enterica group C, 1), blaSHV-2 (Livingstone, 1), blaSHV-12 (Enteritidis, 1) and blaCMY-2 (Bredeney, 2). The IncI1 or IncA/C plasmids carried the blaCTX-M-14a, blaCTX-M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 or blaCMY-2 genes. Whereas the blaCTX-M-9 gene, included in the In60 complex integron, and the blaCTX-M-10 gene, located in a phage related environment, were found in non-typeable plasmids. The conjugative transfer of ESBL/AmpC genes was successful in 8 of the 11 strains, co-transferring in most of the cases other additional resistance genes. The stability of the ESBL/AmpC phenotype was evaluated after 100 daily passages in the absence of antibiotic selection pressure. Five of the analyzed strains, carrying the blaCTX-M-14a, blaCTX M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 and blaCMY-2 genes, lost the plasmidic copy of the beta-lactamase gene. In two of these, the complete loss of the IncI1 plasmid harboring the blaCMY-2 or blaSHV-12 genes was observed. Other resistance genes, such as tet(A), tet(B), and the dfrA12- and dfrA16-positive integrons, were lost in two additional strains. The fifth objective was to characterize in detail the single ciprofloxacin resistant isolate (S. Typhimurium Se20) found in this thesis. It belonged to an in vivo selection of fluoroquinolones and aminoglycosides resistance case report, associated with the aac(6')-Ib-cr4 gene acquisition, after a ciprofloxacin treatment during 7 days. After checking by PFGE and MLST that both pre- and post-treatment strains belonged to the same clone, the characterization of the molecular resistance mechanisms involved was performed. The genetic location of the resistance determinants, the plasmids and the in vitro conjugative transference were assessed. This work is the first description of in vivo selection of resistance to fluoroquinolones and aminoglycosides in a qnrS1-positive S. Typhimurium strain mediated by the acquisition of the aac(6')-Ib-cr4 gene and a substitution in the GyrA protein. Finally, the small acc(6')-Ib-cr4-carrying plasmid, named as pMdT1 (GenBank JX457478) was fully characterized. Salmonella enterica es un importante patogeno zoonotico frecuentemente implicado en toxiinfecciones alimentarias y la emergencia de aislados clinicos resistentes a los antibioticos supone graves limitaciones para su tratamiento. Por ello, el primer objetivo de esta tesis fue estudiar el fenotipo de resistencia a antibioticos y su relacion con el serotipo en los 280 aislados de S. enterica recogidos en el Hosp. San Pedro de Logrono (2007-2009) y Hosp. Clinico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza (2009-2010). Los serotipos mayoritarios fueron Typhimurium (52%) y Enteritidis (33%), estando S. Typhimurium altamente asociado con fenotipos de multirresistencia y especificamente con la resistencia a ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfamidas y tetraciclina (ACSSuT, 29,5%). Se detectaron bajos porcentajes de resistencia a ciprofloxacina o cefalosporinas de tercera generacion. El segundo objetivo fue caracterizar los mecanismos de resistencia a beta-lactamicos (y a otros antibioticos) en los 203 aislados de S. enterica resistentes a ampicilina (AMPR) obtenidos en hospitales de cinco comunidades autonomas (incluidos los dos anteriormente indicados). Se detecto sensibilidad a amoxicilina-acido clavulanico (AMCS) en 79 de estos aislados y sensibilidad intermedia o resistencia (AMCI/R) en 124 aislados. El gen blaTEM-1 se identifico fundamentalmente en los aislados con fenotipo AMPR-AMCS y los genes blaOXA-1 o blaPSE-1 en los aislados AMPR-AMCI/R. En el 59% de los aislados AMPR se detectaron integrones de clase 1 con 12 estructuras distintas, siendo mayoritarias las estructuras aadA2/blaPSE-1 (55%) y blaOXA-1-aadA1 (32%). Siete integrones de clase 1, cuatro de ellos carentes de la region 3'- conservada, albergaban genes dfr de resistencia a trimetoprim. El integron estX+psp+aadA2+cmlA1+aadA1+qacH+IS440+sul3+orf1+mef(B)?IS26 se detecto en un aislado S. Typhimurium y el integron In37 de estructura aac(6')-Ib-cr+blaOXA-1+catB3+arr3 con el promotor PcWTGN-10 inusual en un aislado de S. Thompson. Se observo el fenotipo de pentarresistencia ACSSuT, asociado a los genotipos mayoritarios blaPSE-1-floR-aadA2-sul1-tet(G) o blaOXA-1-catA-aadA1/strA-strB-sul-tet(B). El tercer objetivo se centro en caracterizar los 65 aislados blaPSE-1-positivos, todos ellos S. Typhimurium, obtenidos en el objetivo anterior. La Isla Genomica de Salmonella de tipo 1 (SGI1), portadora de los genes blaPSE-1, floR, aadA2, sul1 y tet(G), se detecto en todos los aislados, identificandose una nueva variante de SGI1 (GenBank JF775513). Todas las cepas blaPSE-1-positivas presentaron pulsotipos indistinguibles o altamente relacionados (PFGE, enzimas XbaI, SpeI) y fueron adscritas a la secuencia tipo ST19 (Complejo Clonal CC1). La deteccion de genes de virulencia agrupo a las cepas en tres virulotipos; detectandose el mayoritario en el 89% de las mismas e incluyendo genes localizados en islas de patogenicidad, en el plasmido de virulencia o relacionados con profagos. El cuarto objetivo fue estudiar los 11 aislados que presentaban un fenotipo de betalactamasa de espectro extendido (BLEE) o AmpC y que se asociaron a los genes blaCTX-M-9 (serotipo Virchow, 2 aislados), blaCTX-M-10 (Virchow, 2), blaCTX-M-14a (Enteritidis, 1), blaCTX-M-15 (Gnesta, 1, y S. enterica grupo C, 1), blaSHV-2 (Livingstone, 1), blaSHV-12 (Enteritidis, 1) y blaCMY-2 (Bredeney, 2). Plasmidos de tipo IncI1 o IncA/C portaban los genes blaCTX-M-14a, blaCTX-M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 o blaCMY-2; mientras que el gen blaCTX-M-9, incluido en un integron complejo In60, y el gen blaCTX-M-10, presente en un entorno relacionado con fagos, se encontraron en plasmidos no tipables. La transferencia por conjugacion de los genes BLEE/AmpC resulto positiva en 8 de las 11 cepas estudiadas, cotransfiriendo otros genes de resistencia adicionales en la mayoria de los casos. Se realizaron experimentos de estabilidad del fenotipo BLEE/AmpC tras 100 pases consecutivos en ausencia de presion selectiva antibiotica. Cinco de las cepas analizadas, portadoras de los genes de resistencia blaCTX-M-14a, blaCTX-M-15, blaSHV-2, blaSHV-12 y blaCMY-2, perdieron la copia plasmidica del gen. En dos de estos casos se evidencio la perdida completa del plasmido IncI1 portador del gen blaCMY-2 o blaSHV-12. Otros genes de resistencia, tales como tet(A), tet(B), y los integrones portadores de los genes dfrA12 y dfrA16, se perdieron en dos cepas adicionales. El quinto objetivo fue la caracterizacion en profundidad del unico aislado (S. Typhimurium Se20) resistente a ciprofloxacina obtenido en esta tesis. Correspondio a un caso clinico de seleccion in vivo de resistencia a fluoroquinolonas y aminoglucosidos, asociado a la adquisicion gen aac(6')-Ib-cr4, tras 7 dias de tratamiento con ciprofloxacina. Tras comprobar mediante PFGE y MLST que las cepas pre- y post-tratamiento pertenecian al mismo clon, se realizo la caracterizacion de los mecanismos moleculares de resistencia implicados. Se determino la localizacion genetica de los determinantes de la resistencia, detectando los plasmidos portadores, y se comprobo mediante experimentos in vitro la transferencia por conjugacion de los mismos. Este trabajo supone la primera evidencia de seleccion in vivo de resistencia a fluoroquinolonas y aminoglucosidos en S. Typhimurium portadora del gen qnrS1 y aac(6')-Ib-cr4 y con mutaciones en la proteina GyrA. Por ultimo, se caracterizo el plasmido de pequeno tamano portador del gen aac(6')-Ib-cr4, que se denomino pMdT1 (GenBank JX457478).