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La retina de los peces óseos, a diferencia de la retina de los mamíferos, posee células progenitoras multipotentes que proliferan a lo largo de toda la vida del animal, originando todos los tipos celulares retinianos, que se agregan al tejido diferenciado a medida que éste crece. Este crecimiento ocurre en una región histológicamente distinguible, ubicada entre la retina neural y el epitelio ciliar, denominada zona ciliar marginal (CMZ), cuyas células poseen capacidad proliferativa. Esta zona representa un anillo de tejido, alrededor de la retina madura, donde existe un gradiente de diferenciación celular, que comprende tanto stem cells (más periféricas) como células progenitoras ya comprometidas con determinados fenotipos retinianos (más centrales). Una característica sorprendente de la retina adulta de pez es que posee la capacidad de regenerarse completamente en respuesta al daño. Por consiguiente, la retina de este vertebrado ofrece características únicas para el estudio de los factores extracelulares e intracelulares que dirigen la proliferación celular y que llevan a la regeneración del tejido adulto. Tanto algunas neuronas como células gliales de la retina, así como también las células del epitelio pigmentario, liberan ATP hacia el espacio extracelular, donde éste, o sus productos de hidrólisis, actúan como neurotransmisores, o neuromoduladores, a través de su unión a receptores purinérgicos específicos. La liberación de ATP puede producirse en respuesta a diversos estímulos fisiológicos, ya sea mecánicos, químicos, osmóticos o eléctricos, o en respuesta a condiciones patológicas como la hipoxia, deshidratación, neurodegeneración o frente a una lesión. Los nucleótidos extracelulares, además de interactuar de manera autócrina o parácrina con receptores purinérgicos de membrana, son hidrolizados por ectonucleotidasas presentes en la membrana plasmática. Entre estas enzimas, una familia importante se denomina ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa (E-NTPDasa). La actividad de estas enzimas no sólo garantiza la finalización del estímulo inducido por los nucleótidos extracelulares, sino que además posibilita la conversión de unos nucleótidos en otros, por ejemplo, ATP a ADP, éste a AMP y luego a adenosina, o UTP a UDP. Estos productos de hidrólisis, a su vez, presentan diferente afinidad por distintos receptores, provocando diversas respuestas intracelulares. El conjunto de nucleótidos y nucleósidos extracelulares, receptores y NTPDasas se conoce como sistema de señalización purinérgica. En esta tesis doctoral, se realizó una caracterización detallada del posible rol regulatorio de las señales purinérgicas sobre la capacidad proliferativa y regenerativa de la retina adulta de pez cebra en respuesta al daño. Se utilizaron dos modelos de daño de tipo citotóxico, uno que provoca una lesión parcial del tejido, generando muerte celular solamente en las capas internas de la retina (interneuronas y células ganglionares), y otro que causa una lesión global, que involucra a todos los tipos celulares retinianos, incluyendo a los fotorreceptores. En primer lugar, se describió que una lesión citotóxica con ouabaína, ya sea parcial o global, indujo la activación mitótica de las células proliferativas presentes tanto en el tejido maduro diferenciado como en la CMZ, alcanzándose un pico de máxima proliferación a los 7 días luego de la lesión. Además, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de esta activación mitótica luego de la inducción de ambos tipos de lesión, ya que el tratamiento con un exceso de enzimas que hidrolizan nucleótidos extracelulares disminuyó significativamente el máximo aumento de proliferación celular. Asimismo, el tratamiento con MRS2179 (un antagonista de los receptores purinérgicos metabotrópicos P2Y1 con alta afinidad por el ADP) disminuyó significativamente el pico de proliferación celular inducido por la lesión (tanto parcial como global) de la retina. Es interesante destacar que retinas no lesionadas y tratadas con un análogo poco hidrolizable del ADP presentaron un aumento significativo de la actividad proliferativa tanto en las capas de tejido maduro como en la CMZ. Estos resultados indicaron que el ADP es una señal suficiente para inducir activación mitótica de los precursores retinianos aún en ausencia de daño. El efecto del ADP en el tejido intacto fue también inhibido completamente por un antagonista del receptor P2Y1. Se observó también que los nucleótidos extracelulares son fundamentales para la reparación del tejido, ya que retinas lesionadas y posteriormente tratadas con apirasa o MRS2179 mostraron un mayor grado de desorganización tisular y desaparición nuclear en todas las capas retinianas, en comparación con retinas lesionadas. El grado de regeneración de las retinas dañadas y sometidas posteriormente a los tratamientos mencionados exhibió un retardo con respecto al tejido lesionado y en regeneración en presencia de señalización purinérgica endógena. Asimismo, se observó que el tratamiento de retinas lesionadas con ARL67156, un inhibidor selectivo de las ecto-ATPasas, disminuyó significativamente el incremento de proliferación celular, evidenciando la importancia de la actividad de las NTPDasas en la regulación de la proliferación celular inducida por la lesión del tejido. Por otra parte, se evidenció un importante rol de los nucleótidos extracelulares en la regulación de la muerte celular inducida por la lesión, ya que la remoción enzimática de estos nucleótidos incrementó significativamente este proceso. Este efecto fue reproducido al bloquear los receptores P2Y1, sugiriendo un rol neuroprotector del ADP, particularmente sobre los fotorreceptores retinianos. Estos resultados sugirieron que las señales purinérgicas son capaces de atenuar significativamente los efectos de la lesión citotóxica sobre la muerte neuronal y glial. Posteriormente, se observó que el nivel de expresión del ARNm de las NTPDasas 1, 2mq, 2mv, y 3 aumentó significativamente luego de inducida la lesión. En concordancia, el patrón espacial de expresión de la proteína NTPDasa2 sufrió importantes cambios luego de la inducción de la lesión. Finalmente, se describió la expresión del receptor P2Y1 en la retina de pez cebra. El nivel de su ARNm, así como su expresión proteica, aumentaron de manera significativa luego de inducida la lesión citotóxica con ouabaína. Se observó además, mediante la técnica de western blot, un cambio en el patrón de expresión en las etapas de degeneración y proliferación, luego de lesionar el tejido retiniano. En conjunto, estos resultados demuestran un rol fundamental, necesario y suficiente del sistema de señalización purinérgica en el control de los mecanismos de proliferación y muerte celular que ocurren durante el proceso de regeneración de la retina adulta de pez cebra. Teleost fish retina, in contrast with mammal retina, has multipotent progenitor cells that proliferate throughout the animal life, giving rise to all cell types of mature retina, which are added to the differentiated tissue whereas it grows. Moreover, teleost fish retina has a ciliary marginal zone (CMZ) with proliferative capacity, localized around the mature retina, where there is a gradient of cell differentiation, including stem cells, progenitor cells committed to specific retinal phenotypes, and fully differentiated neurons. Remarkably, in teleost fish mechanical, chemical, laser or light damage of the mature retina activates regenerative mechanisms. Regeneration and growth that occur in the adult teleost retina by neurogenesis have been helpful in identifying molecular and cellular mechanisms underlying cell proliferation and differentiation. In the retina, ATP is released from neurons and glia (and also from the retinal pigmented epithelium) to the extracellular milieu where this nucleotide, or its hydrolysis products, acts as a neurotransmitter or neuromodulator by binding to purinergic receptors. ATP release can occur in response to physiological stimuli or to pathological conditions, including retinal damage. Extracellular nucleotides such as ATP, ADP, and UTP are extracellularly dephosphorylated by ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) localized in the cell membrane. The activity of these enzymes not only guarantees the completion of a specific stimulus, but allows the conversion of some agonists to other, with different specificity for different receptors. Extracellular nucleotides and nucleosides, receptors and NTPDases are known as purinergic signaling system. In the present work, we performed a characterization of the possible regulatory role of purinergic signals on the capacity of the zebrafish retina to regenerate in response to damage. We use two different models of cytotoxic lesion: a partial lesion, which produces damage only in the inner layers of the retina, and a global injury, which involves all retinal layers, including photoreceptors. We described that cytotoxic lesion with ouabain, either partial or global, increases cell proliferation both in the mature retina and in the CMZ, with a maximum at 7 days post injury (dpi). Moreover, we demonstrated an important role for extracellular nucleotides in regulating injury-induced cell proliferation, regardless the magnitude of the injury, because treatment with enzymes that hydrolyze extracellular nucleotides significantly decreased the peak of cell proliferation. In addition, treatment with MRS2179 (an ADP-activated P2Y1 receptor selective antagonist) provoked a significant decrease in the injury-induced cell proliferative peak normally observed 7 dpi both in the CMZ and the mature retina. Interestingly, ADPβS significantly increased cell proliferation in intact retinas both at the CMZ and mature retina. Moreover, the selective antagonist MRS2179 of the metabotropic ADP- activated receptor P2Y1 significantly inhibited the increment in cell proliferation induced by ADPβS. We also demonstrated that extracellular nucleotides play a crucial role in retinal repair, since retinas treated with apirase or MRS2179 after lesioning were damaged at a higher level than control ouabain-treated retinas. Additionally, we observed that treatment with ARL67156, which has been shown to inhibit NTPDase activity, significantly reduced injury-induced cell proliferation, showing a role for the enzymes that catalyze the extracellular hydrolysis of ATP as well as other nucleotides in controlling cell proliferative activity in lesioned retinas. On the other hand, we described an important role for purinergic signals in regulating cell death induced by injury, since scavenging of extracellular nucleotides significantly increased cell death. This effect is partially reproduced by blocking P2Y1 receptors suggesting a neuroprotective function for ADP. Furthermore, lesioned retinas showed a significant increase of NTPDase1, 2mq, 2mv and 3 following injury. In accordance with this result, expression pattern of NTPDas2 changed after injury. Lesioned retinas also showed a significant increase of P2Y1 receptor mRNA expression relative to undamaged retinas in the proliferative phase. P2Y1 receptor protein, when assessed by western blot and immunocytochemistry, showed a lesion-induced change in its expression pattern as well as an increase and modified distribution on damaged retinal layers. In summary, this study demonstrated a crucial role for endogenous purinergic signals regulating cell proliferation, as well as cell death, induced by a cytotoxic injury of the adult zebrafish retina, which underlays retinal repair. Fil: Battista, Ariadna Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.