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Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2020/2021. Máster en Química Aplicada El síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) afecta a las granjas de producción porcina a nivel mundial, causando anorexia, fiebre y dificultad respiratoria en cerdos en crecimiento; mientras que en cerdas adultas se caracteriza por la disfunción reproductiva y abortos. Las vacunas comerciales disponibles actualmente sólo son capaces de proporcionar una protección parcial frente al virus del PRRS (PRRSV) debido a su capacidad de mutación y la amplia variedad de cepas existente. Por ello se ha planteado la administración de vacunas encapsuladas en nanopartículas (NPs) que puedan favorecer su aplicación por vía mucosal consiguiendo así potenciar la respuesta inmune en el hospedador. El ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA) es un copolímero ampliamente utilizado para la síntesis NPs poliméricas con aplicaciones biomédicas debido a sus propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad. En este trabajo se encapsuló una vacuna viva atenuada frente al PRRSV en NPs de PLGA mediante el método de coprecipitación. Las NPs fueron caracterizadas por diversas técnicas como microscopía electrónica de barrido (SEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y espectroscopía ultravioleta-visible. Debido a que la célula diana del virus es el macrófago alveolar pulmonar, para realizar los experimentos in vitro se aislaron monocitos de sangre periférica para su posterior diferenciación a macrófagos. Estas células fueron infectadas con NPs y con virus vacunal. Los resultados mostraron una eficiencia de encapsulación del virus cercana al 70%. Se obtuvieron NPs de tamaño en el rango de 100 a 450 nm que permitieron la encapsulación del virus y su posterior fagocitosis por los macrófagos. Aunque se confirmó que las NPs eran exitosamente fagocitadas por lo macrófagos derivados de monocitos utilizando NPs cargadas con el colorante Rojo de Nilo, mediante citometría de flujo se observó un porcentaje de infección bajo a partir de las NPs cargadas con el virus vacunal, probablemente asociado al uso de un virus atenuado. Asimismo, se caracterizaron las propiedades citotóxicas de las NPs en la aplicación en cultivo celular. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is an economically important viral disease for the pig industry worldwide. In growing pigs it causes anorexia, fever, respiratory distress, while in pregnant sows it is characterized by reproductive dysfunction and abortions. Current vaccines fail to completely prevent PRRS outbreaks since new variants are constantly emerging. Microencapsulation of vaccine agents is seen as an attractive alternative as it allows it mucosal administration as well as to enhance the host immune response. Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a copolymer widely used for the synthesis of polymeric NPs with biomedical applications as it is biocompatible and biodegradable. In the present work, we entrapped attenuated PRRSV within PLGA nanoparticles by the coprecipitation technique. The NPs were characterized by a number of techniques, including scanning electron microscope (SEM), dynamic light scattering (DLS) and ultraviolet-visible spectroscopy. For in vitro studies, monocytes were isolated from porcine peripheral blood for further differentiation into macrophages. The vaccine virus, either encapsulated in NPs or unencapsulated, was inoculated into macrophages. The results showed that the entrapment efficiency of PRRSV loaded NPs was about 70% with NPs presenting a size that allows the virus to be encapsulated and phagocytosed by macrophages. Although NPs were confirmed to be successfully phagocytosed by using Nile Red dye loaded NPs, a low infection rate was observed by flow cytometry using vaccine virus loaded NPs, probably associated to the use of an attenuated virus. Furthermore, toxicity of the NPs was detected in cell culture.

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS, del inglés Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) es una enfermedad vírica caracterizada por inducir una respuesta inmune errática en el hospedador y es considerada como una de las enfermedades más importantes en la industria del porcino debido a las importantes pérdidas económicas que provoca. A pesar de que varios estudios se han realizado con el objetivo de elucidar la respuesta inmune provocada frente al virus del PRRS (PRRSV, del inglés PRRS virus) todavía quedan muchos aspectos por entender. El PRRSV se replica, principalmente, en los macrófagos alveolares porcinos (MAPs) y, en menor medida, en macrófagos de otros órganos y en las células dendríticas, describiéndose la replicación del virus tanto en pulmón como en los órganos linfoides de cerdos infectados con el PRRSV, y sugiriéndose que estos órganos tendrían un importante papel en la patogenia de esta enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los estudios centrados en analizar la respuesta inmune provocada tras una infección con el PRRSV se han realizado principalmente sobre muestras de suero y de pulmón. El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el papel de la expresión de citoquinas y los fenómenos de apoptosis en los órganos linfoides en la patogenia del PRRS. Para llevar a cabo este estudio, se utilizaron veintiocho lechones, de cinco semanas de edad, que fueron inoculados con el aislado 2982 del PRRSV, y sacrificados a 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días post-inoculación (dpi). Cuatro lechones, de las mismas características, fueron usados como control, inoculándolos con medio estéril, y sacrificándolos al final del experimento. De todos los animales se tomaron muestras de pulmón, tonsila y nódulos linfáticos que fueron fijadas en formol tamponado al 10 %, en solución de sales de Zinc, y en solución de Bouin, para el estudio histopatológico e inmunohistoquímico. En nuestro estudio evaluamos la expresión de IL-1¯, IL-6 y TNF-¯ en la tonsila, y en los nódulos linfáticos retrofaríngeo y mediastínico de cerdos infectados con el PRRSV, encontrando una expresión diferente de cada citoquina en función del órgano analizado, lo que muestra un comportamiento diferente del PRRSV en los órganos linfoides. Este hallazgo podría estar relacionado con la falta de una respuesta inmune eficaz del hospedador frente al PRRSV. Así, mientras que en la tonsila la expresión de estas citoquinas proinflamatorias fue muy pobre, en el nódulo linfático mediastínico se observó un incremento de la expresión de TNF-¯ e IL-1¯, siendo la IL-6 la citoquina más expresada en el nódulo linfático retrofaríngeo El antígeno del PRRSV se observó fundamentalmente en la médula o paracorteza de los órganos linfoides analizados, encontrando tanto en la tonsila como en el nódulo linfático retrofaríngeo una expresión bimodal, con un primer pico a los 3 dpi y un segundo a los 14 dpi, mientras que en el nódulo linfático mediastínico observamos un pico de expresión al comienzo del experimento disminuyendo posteriormente hasta el final del mismo. Las células inmunomarcadas tanto para el PRRSV como para las citoquinas proinflamatorias fueron principalmente macrófagos...

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino representa uno de las enfermedades más importantes de la industria porcina. Este síndrome se caracteriza por inducir una neumonía interstiticial en cerdos de transición y de engorde, así como fallo reproductivo en cerdas gestantes. El PRRS está causado por un virus ARN, conocido como virus del PRRS (VPRRS), perteneciente a la familia Arteriviridae, orden Nidovirales. Entre los principales aspectos que quedan por conocer de la enfermedad se encuentra la alteración de la respuesta inmune y el papel que las citoquinas desempeñan en la patogenia del PRRS. Así, el objetivo general de esta tesis consistió en evaluar los cambios de la expresión sérica y tisular de diferentes citoquinas y su relación con la respuesta inmune desarrollada frente al VPRRS. Veintiocho cerdos, libres del VPRRS, fueron inoculados intramuscularmente con el aislado de campo 2982 del VPRRS. Otros cuatro cerdos, de idénticas características, fueron utilizados como control, sacrificándose al final del estudio. De estos animales se tomaron muestras de sangre y de diferentes órganos a los 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 y 24 días post-inoculación (dpi) para la determinación de las subpoblaciones de linfocitos y la expresión de proteínas de fase aguda (PFAs) y citoquinas. En nuestro estudio, el recuento de células CD21+ aumentó tanto en células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) como en el nódulo linfático traqueobronquial entre los 17 y los 24 dpi, coincidiendo con un incremento del título de anticuerpos específicos. Asimismo se observó un aumento de las células T CD4-CD8high y CD4+CD8+. El recuento de células T CD4-CD8low estaba disminuido en todos los órganos examinados, mientras que las células T CD4+CD8- disminuyeron únicamente en el bazo. La disminución de la viremia se correlacionó con un aumento de las células T CD4-CD8high, y con una mayor expresión de la interleuquina-10 (IL-10) y de la interleuquina-12 p40 (IL-12 p40). Durante la fase temprana de la infección no se detectó una respuesta eficiente de interferón gamma (IFN¿) y la expresión de interferón alfa (IFN¿) fue tardía. Estos resultados sugieren que la IL-10 e IL-12 y las células T CD4-CD8high serían importantes mediadores en la respuesta inmune frente al VPRRS. La concentración sérica de haptoglobina (Hp) y pig-major acute protein (Pig-MAP) mostró un aumento moderado a los 10 dpi, mientras que los niveles de proteína C reactiva (PCR) y amiloide A sérica (AAS) presentaron un incremento retardado y altamente variable. Las citoquinas proinflamatorias fueron detectadas en niveles bajos en suero, observándose sólo un aumento moderado de la interleuquina-1 beta (IL-1ß). Aunque el factor de necrosis tumoral alfa (TNF¿) se expresó en niveles bajos, se observó una correlación positiva con la viremia, y con los niveles de IL-6 y Hp. Por todo, el TNF¿ podría desempeñar un papel importante en la modulación de la respuesta inmune frente al VPRRS. En el pulmón, la expresión tisular de citoquinas proinflamatorias estaba correlacionada con el grado de lesión histopatológica de lesión pulmonar y con la cinética de los macrófagos, desarrollando estas citoquinas un papel importante en la patogenia de la neumonía intersticial observada en la enfermedad. Una correlación significativa fue observada entre los niveles de expresión del virus y de la expresión de IL-10, y entre la expresión de IL-12 p40 y TNF¿ con respecto de IFN¿, pero no entre IFN¿ e IFN¿. Nuestros resultados sugieren que el VPRRS modula la respuesta inmune a través de la expresión de IL-10, lo cual podría inducir niveles más bajos de otras citoquinas implicadas en la eliminación del virus, como IFN¿, IFN¿, IL-12 p40 y TNF¿. Las citoquinas estudiadas fueron expresadas principalmente por macrófagos del septo del pulmón, de forma que estos estarían implicados fundamentalmente en la síntesis y liberación de citoquinas, mientras que los MAPs representaron la célula diana involucrada en la replicación del VPRRS.