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Le traitement de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) de l’enfant, une affection d'origine maligne des cellules progénitrices lymphoïdes, s’est considérablement amélioré au cours des dernières décennies. En effet, le taux de succès du traitement a dépassé 90% dans des conditions favorables. Cependant, des toxicités liées au traitement peuvent être fatales et entrainer l’interruption ou la cessation du traitement. L'allergie, la pancréatite et la thrombose sont des complications fréquentes du traitement de la LLA et sont associées à l'utilisation de l'asparaginase (ASNase), tandis qu’une toxicité fréquente due à la vincristine (VCR) induit la neuropathie périphérique (VIPN). Étant donné que l’ajustement du schéma posologique afin d’augmenter l'efficacité et diminuer la toxicité est un processus sensible, ceci demeure un défi majeur dans plusieurs protocoles de traitement. La pharmacogénétique étudie comment des altérations de la composante génétique peuvent influer sur la variabilité interindividuelle observée dans la réponse au traitement. Une meilleure compréhension de la base moléculaire de cette variabilité pourrait améliorer considérablement les résultats du traitement, en permettant la personnalisation de ce dernier en fonction du profil génétique du patient. Des études récentes suggèrent l’avantage d’appliquer l’analyse de l’exome à la découverte de variants associés à des traits humains complexes ainsi qu’à des phénotypes de réactions médicamenteuses. L'objectif de notre travail était d'utiliser les données de séquençage pour réaliser des études d'association à l'échelle de l'exome, y compris des étapes de filtrage et de validation, afin d'identifier de nouveaux variants génétiques susceptibles de moduler le risque de développer des complications associées à ASNase et à VIPN. Douze SNP étaient associés à des complications due à l’ASNase dans la cohorte initiale, dont 3 étaient associés à une allergie, 3 à une pancréatite et 6 à une thrombose. Parmi ceux-ci, les variants rs3809849, rs11556218 et rs34708521 des gènes MYBBP1A, IL16 et SPEF2 respectivement ont été associés à des complications multiples et leur association à une pancréatite a été répliquée dans une cohorte de validation indépendante. En ce qui concerne la VCR, trois variantes ont été associées à la modulation du risque de VIPN: rs2781377 dans SYNE2, rs10513762 dans MRPL47 et rs3803357 dans BAHD1. Nous démontrons également le puissant effet combiné de la présence de plusieurs variants de risque pour chacune des toxicités étudiées et fournissons des modèles de prédiction du risque pour la pancréatite et le VIPN basés sur la méthode d’évaluation du risque génétique pondérée et qui ont été validés à l’interne. De plus, étant donné une association du polymorphisme du gène MYBBP1A avec de multiples issus de traitement, nous avons cherché à comprendre comment cette altération génétique se traduit par des variabilités de réponse aux traitements à l’ASNase. En utilisant la technique CRISPR-CAS9 pour induire l'inactivation de gènes dans des lignées cellulaires cancéreuses PANC1 (pancréatiques) nous avons testé la différence de viabilité entre les cellules inactivées et les cellules du type sauvage à la suite de la suppression du gène et du traitement par ASNase. Nos résultats suggèrent un rôle fonctionnel de ce gène dans la modulation de la viabilité, de la capacité de prolifération et de la morphologie des cellules knock-out, ainsi que dans leur sensibilité à l'ASNase, et plaident en outre pour que le gène influence l’issus du traitement de la LLA par ASNase. Le présent travail démontre que l’utilisation de l’approche de séquençage de l’exome entier dans le contexte d’une étude d’association à l’échelle de l’exome est une stratégie valide « sans hypothèse » pour identifier de nouveaux marqueurs génétiques modulant l’effet du traitement de la LLA de l’enfant, et souligne l’importance de l'effet synergique de la combinaison des locus à risque., Treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL), a malignant disorder of lymphoid progenitor cells has improved significantly over the past decades and treatment success rates have surpassed 90% in favorable settings. However, treatment-related toxicities can be life-threatening and cause treatment interruption or cessation. Allergy, pancreatitis and thrombosis are common complications of ALL treatment associated with the use of asparaginase (ASNase), while vincristine-induced peripheral neuropathy (VIPN) is a frequent toxicity of vincristine (VCR). It is a sensitive process and a constant struggle to adjust the dosing regimen to ensure maximum efficacy and minimum toxicity. Pharmacogenetics studies show alterations in the genetic component between individuals can influence the observed variability in treatment response. A better understanding of the molecular basis of this variability in drug effect could significantly improve treatment outcome by allowing the personalization of ALL treatment based on the genetic profile of the patient. Emerging reports suggest the benefit of applying exome analysis to uncover variants associated with complex human traits as well as drug response phenotypes. Our objective in this work was to use available whole-exome sequencing data to perform exome-wide association studies followed by stepwise filtering and validation processes to identify novel variants with a potential to modulate the risk of developing ASNase complications and VIPN. Twelve SNPs were associated with ASNase complications in the discovery cohort including 3 associated with allergy, 3 with pancreatitis and 6 with thrombosis. Of those, rs3809849 in MYBBP1A, rs11556218 in IL16 and rs34708521 in SPEF2 genes were associated with multiple complications and their association with pancreatitis was replicated in an independent validation cohort. As for VCR, three variants were associated with modulating the risk of VIPN: rs2781377 in SYNE2, rs10513762 in MRPL47 and rs3803357 in BAHD1. We also demonstrate a strong combined effect of harbouring multiple risk variants for each of the studied toxicities, and provide internally-validated risk-prediction models based on the weighted genetic risk score method for pancreatitis and VIPN. Furthermore, given the association of the polymorphism in MYBBP1A gene with multiple treatment outcomes, we aimed at understanding how this genetic alteration translates into differences in ASNase treatment response through cell-based functional analysis. Using CRISPR-CAS9 technology we produced gene knockout of PANC1 (pancreatic) cancer cell-lines and tested the difference in viability between the knockouts and wild-type cells following gene deletion and ASNase treatment. Our results suggest a functional role of this gene in modulating the viability, proliferation capacity and the morphology of the knockout cells as well as their sensitivity to ASNase and further advocates the implication of the gene in influencing the outcome of ALL treatment with ASNase. The present work demonstrates that using whole-exome sequencing data in the context of exome-wide association study is a successful “hypothesis-free” strategy for identifying novel genetic markers modulating the effect of childhood ALL treatment and highlights the importance of the synergistic effect of combining risk loci.

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales affectant 1:1000 naissances et causées par une fermeture incomplète du tube neural résultant en des malformations du cerveau et de la moelle épinière. Les présentations les plus courantes de ces malformations sont l’Anencéphalie et le Spina Bifida qui résultent d’échec de fermeture dans les régions crâniales et spinales respectivement. L’étiologie de la maladie est complexe et inclut des facteurs génétiques et environnementaux. À ce jour, près de ~250 gènes causatifs ont été identifiés chez le modèle murin permettant entre autres de conclure à un rôle important de la voie PCP dans l’étiologie des ATN. Des études de liaison et l’étude des gènes de la voie de l’acide folique ont aussi eu un certain succès, mais une majorité de l’étiologie génétique de la pathologie humaine demeure inconnue suggérant que de nouvelles approches sont nécessaires. Le séquençage de l’exome entier combiné aux méthodes d’analyse de variants de novo et de reséquençage de masse offre une option d’investigation puissante permettant d’éclaircir l’étiologie génétique des ATN. L’investigation de variants de novo dans 43 trios a permis d’identifier 42 variants codants dont 6 entraînent une version tronquée de la protéine. De ceux-ci, 2 variants tronquants (p.Tyr392X et p.Leu948fs) touchaient le gène candidat SHROOM3 ayant précédemment été associé aux ATN chez la souris. L’enrichissement statistique de variants tronquants dans ce gène suggère une association à la pathologie humaine. De plus, le nombre élevé de variants tronquants identifiés suggère que l’apparition de variants de novo est un des mécanismes permettant de maintenir la prévalence élevée de cette maladie léthale dans la population. L’investigation des variants transmis à l’aide d’une approche des gènes candidats chez 6 familles affectées par des ATN a permis l’identification d’un variant homozygote tronquant p.Asp16Aspfs*10 sur le gène GRHL3 chez deux sœurs affectées par un ATN. GRHL3 étant un gène candidat ayant été précédemment associé aux ATN chez la souris, un reséquençage massif de ce gène dans 192 patients sporadiques et une réanalyse des 43 trios précédents ont permis d’identifier 7 variants avec un haut potentiel pathogénique. L’analyse statistique de ces variants a permis de conclure un enrichissement significatif suggérant une association de GRHL3 aux ATN humaines. Des études fonctionnelles subséquentes a permis de conclure que deux des variants entraînaient une perte de fonctions (p.Arg391Cys et p.Ala529Val), alors qu’un autre affectait l’épissage de l’ARN (p.Ala318Glyfs*26). Ces résultats supportent fortement l’implication du gène GRHL3 dans les ATN humains. L’étiologie génétique des anomalies du tube neural demeure largement inconnue. Ces nouveaux gènes ouvrent la porte sur de nouveaux processus pathogéniques potentiels de la maladie. Ces résultats permettront de mieux comprendre la maladie et d’offrir une meilleure prise en charge clinique des familles affectées., Neural tube defects (NTD) are congenital malformations affecting 1 :1000 births and are caused by incomplete neural tube closure resulting in spinal cord and brain malformations. The most frequent presentations include Anencephaly and Spina Bifida which result from failure of closure of the cranial and spinal regions respectively. The etiology of the disease is complex and include genetic and environmental factors. To this day, ~250 causative genes have been identified in the mouse model and demonstrated the role of the planar cell polarity pathway in the NTD’ etiology. Linkage studies and candidate gene studies of folic acid genes had limited success and a large portion of the genetic etiology of the human pathology remain unknown suggesting the need for novel approaches. Whole exome sequencing combined with de novo variant and massive resequencing methods offer a powerful tool that may lead to a better understanding of the genetic etiology of NTD. Investigation of de novo variants in 43 trios identified 42 coding variants including 6 truncating ones. Of these, 2 truncating variants (p.Tyr392X et p.Leu948fs) were found in the SHROOM3 gene which had previously been associated to NTD in mouse. Statistical enrichment of truncating variants in this gene suggest an association to the human pathology. The high number of truncating variants identified in this cohort also suggest that de novo variants are one of the mechanisms that maintain the high prevalence of this lethal disease in the population. Investigation of transmitted variants using a candidate gene approach in 6 NTD affected family identified a homozygous truncating variant p.Asp16Aspfs*10 in the GRHL3 gene in two NTD affected sisters. GRHL3 is a strong candidate gene previously associated to NTD in mouse. Massive parallel resequencing of 192 sporadic patients and the analysis of the 43 previous trios identified 7 variants with a high pathogenic potential. Statistical analysis of these variants demonstrated a significant enrichment suggesting an association of GRHL3 with human NTD. Functional studies supported these findings through the identification of two loss of function variants (p.Arg391Cys et p.Ala529Val) and a variant affecting RNA splicing (p.Ala318Glyfs*26). The genetic etiology of NTD remain largely unknown. These new genes are essential to identification of new potential pathogenic processes of this disease. These results will help better understand the disease and offer better genetic counseling for the affected families.

Beyond the clinical benefit for diagnosis, the study of patients with primary immunodeficiency (PID) has also largely contributed to the deciphering of the complex molecular mechanisms involved in the human adaptive response against pathogens. Still, a large number of PIDs, especially common variable immunodeficiency (CVID), are genetically not defined. During my thesis, I aimed to identify and characterize novel molecular causes of PIDs based on human natural mutants as a research model (1). By whole-exome sequencing of DNA from patients presenting either with pediatric or familial form of CVID and Systemic Lupus Erythematosus (SLE), we identified three distinct heterozygous single nucleotide variations predicted deleterious in a CVID patient (RELAY306X), a pediatric SLE patient (RELAR329X) and familial SLE patients (RELAH86N). To better understand how the identified mutations may impact the role of RELA in the NF-kB pathway, we confirmed that the two nonsense RELA mutations led to the expression of truncated forms of the protein, while the missense mutation led to the expression of mutated forms of the protein. By immunoblotting of nuclear protein extracts and cellular immunofluorescence, we demonstrated that the two truncated forms of RELA can translocate into the nucleus. Then, using a labeled NF-κB consensus oligonucleotide, we demonstrated that the two truncated forms of RELA were able to bind to DNA. All three mutated RELA proteins, when expressed ectopically, had an impaired transcriptional activity. Finally, we showed by immunoprecipitation that all three ectopically expressed mutated RELA proteins are able to interact with protein partners and form homodimers. As a whole, our results indicate that mutations affecting the transcription factor RELA can be associated with CVID or SLE. Given the previous cases associating RELA haploinsufficiency to autoimmune lymphoproliferative syndrome with autoimmune cytopenia and to TNF-dependent mucocutaneous ulceration and inflammatory intestinal disease, our work widens the spectrum of disease and clinical phenotypes associated with RELA dysfunction and suggests that different RELA mutations lead to different functional consequences.; Au-delà du bénéfice clinique du diagnostic, l'étude des patients atteints de déficits immunitaires héréditaires a aussi largement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires complexes impliqués dans la réponse adaptative humaine contre les pathogènes. Cependant, un grand nombre d’immunodéficiences primaires n’a pas encore été génétiquement défini, en particulier le déficit immunitaire commun variable (ou CVID en anglais). Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier et caractériser de nouvelles causes moléculaires aux immunodéficiences primaires en me basant sur des mutants naturels humains comme modèle de recherche. Par séquençage entier de l'ADN de patients présentant une forme pédiatrique ou familiale de lupus érythémateux disséminé (ou SLE en anglais) et CVID, nous avons identifié trois variations hétérozygotes distinctes prédites comme délétères chez un patient atteint de CVID (RELAWT/Y306X), un patient pédiatrique SLE (RELAWT/R329X) et les patients atteints de SLE (RELAWT/H86N). Afin de comprendre comment les mutations identifiées peuvent affecter le rôle de RELA dans la voie NF-kB, nous avons confirmé que les deux mutations non-sens de RELA entraînent l'expression de formes tronquées de la protéine, tandis que la mutation faux-sens menait à l'expression de formes mutées de la protéine. Par immunoblot des protéines nucléaires et par immunofluorescence cellulaire, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA peuvent entrer dans le noyau. Ensuite, en utilisant un oligonucléotide consensus NF-κB marqué, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA étaient capables de se lier à l'ADN. Les trois protéines RELA mutées, lorsqu'elles étaient exprimées de manière ectopique, présentaient une altération de l'activité transcriptionnelle. Enfin, nous avons montré par co-immunoprécipitation que les trois protéines RELA mutées exprimées de manière ectopique sont capables d'interagir avec ses partenaires protéiques et de former des homodimères. En conclusion, nos résultats indiquent que des mutations affectant le facteur de transcription RELA peuvent être associées à des CVID ou des SLE. Étant donnés les cas précédents décrivant des haploinsuffisances de RELA liées à un syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité associé à une cytopénie auto-immune ainsi qu’aux ulcérations cutanéo-muqueuses TNF-dépendantes associées à des inflammations intestinales, notre travail élargit le spectre des maladies et des phénotypes cliniques liés à un dysfonctionnement de la protéine RELA et suggère que différentes mutations du gène RELA entraînent diverses conséquences fonctionnelles.

Beyond the clinical benefit for diagnosis, the study of patients with primary immunodeficiency (PID) has also largely contributed to the deciphering of the complex molecular mechanisms involved in the human adaptive response against pathogens. Still, a large number of PIDs, especially common variable immunodeficiency (CVID), are genetically not defined. During my thesis, I aimed to identify and characterize novel molecular causes of PIDs based on human natural mutants as a research model (1). By whole-exome sequencing of DNA from patients presenting either with pediatric or familial form of CVID and Systemic Lupus Erythematosus (SLE), we identified three distinct heterozygous single nucleotide variations predicted deleterious in a CVID patient (RELAY306X), a pediatric SLE patient (RELAR329X) and familial SLE patients (RELAH86N). To better understand how the identified mutations may impact the role of RELA in the NF-kB pathway, we confirmed that the two nonsense RELA mutations led to the expression of truncated forms of the protein, while the missense mutation led to the expression of mutated forms of the protein. By immunoblotting of nuclear protein extracts and cellular immunofluorescence, we demonstrated that the two truncated forms of RELA can translocate into the nucleus. Then, using a labeled NF-κB consensus oligonucleotide, we demonstrated that the two truncated forms of RELA were able to bind to DNA. All three mutated RELA proteins, when expressed ectopically, had an impaired transcriptional activity. Finally, we showed by immunoprecipitation that all three ectopically expressed mutated RELA proteins are able to interact with protein partners and form homodimers. As a whole, our results indicate that mutations affecting the transcription factor RELA can be associated with CVID or SLE. Given the previous cases associating RELA haploinsufficiency to autoimmune lymphoproliferative syndrome with autoimmune cytopenia and to TNF-dependent mucocutaneous ulceration and inflammatory intestinal disease, our work widens the spectrum of disease and clinical phenotypes associated with RELA dysfunction and suggests that different RELA mutations lead to different functional consequences.; Au-delà du bénéfice clinique du diagnostic, l'étude des patients atteints de déficits immunitaires héréditaires a aussi largement contribué à la compréhension des mécanismes moléculaires complexes impliqués dans la réponse adaptative humaine contre les pathogènes. Cependant, un grand nombre d’immunodéficiences primaires n’a pas encore été génétiquement défini, en particulier le déficit immunitaire commun variable (ou CVID en anglais). Au cours de ma thèse, j'ai cherché à identifier et caractériser de nouvelles causes moléculaires aux immunodéficiences primaires en me basant sur des mutants naturels humains comme modèle de recherche. Par séquençage entier de l'ADN de patients présentant une forme pédiatrique ou familiale de lupus érythémateux disséminé (ou SLE en anglais) et CVID, nous avons identifié trois variations hétérozygotes distinctes prédites comme délétères chez un patient atteint de CVID (RELAWT/Y306X), un patient pédiatrique SLE (RELAWT/R329X) et les patients atteints de SLE (RELAWT/H86N). Afin de comprendre comment les mutations identifiées peuvent affecter le rôle de RELA dans la voie NF-kB, nous avons confirmé que les deux mutations non-sens de RELA entraînent l'expression de formes tronquées de la protéine, tandis que la mutation faux-sens menait à l'expression de formes mutées de la protéine. Par immunoblot des protéines nucléaires et par immunofluorescence cellulaire, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA peuvent entrer dans le noyau. Ensuite, en utilisant un oligonucléotide consensus NF-κB marqué, nous avons démontré que les deux formes tronquées de RELA étaient capables de se lier à l'ADN. Les trois protéines RELA mutées, lorsqu'elles étaient exprimées de manière ectopique, présentaient une altération de l'activité transcriptionnelle. Enfin, nous avons montré par co-immunoprécipitation que les trois protéines RELA mutées exprimées de manière ectopique sont capables d'interagir avec ses partenaires protéiques et de former des homodimères. En conclusion, nos résultats indiquent que des mutations affectant le facteur de transcription RELA peuvent être associées à des CVID ou des SLE. Étant donnés les cas précédents décrivant des haploinsuffisances de RELA liées à un syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité associé à une cytopénie auto-immune ainsi qu’aux ulcérations cutanéo-muqueuses TNF-dépendantes associées à des inflammations intestinales, notre travail élargit le spectre des maladies et des phénotypes cliniques liés à un dysfonctionnement de la protéine RELA et suggère que différentes mutations du gène RELA entraînent diverses conséquences fonctionnelles.