Search

Heart failure (HF) is a clinical syndrome arising from diverse causes leading to abnormalities in cardiac structure and function and is characterized by typical symptoms, e.g., breathlessness, ankle swelling and fatigue. Pathophysiological stimuli (e.g., pressure overload, cardiac injury) activate several pathways and processes (e.g., neurohumoral mechanisms, inflammation, fibrosis, cell death) leading to the cardiac hypertrophy and remodeling, and finally cardiac dysfunction. Although improvements in treatments and their implementation have increased survival and reduced the hospitalization rate in patients with HF, cardiovascular disease is still the most common cause of death worldwide. Therefore, new approaches to improve outcomes in HF are needed. The aim of the present study was to identify novel small molecule modulators for the transcriptional synergy of cardiac hypertrophy associated transcription factors GATA4 and NKX2-5 by a phenotypic cell-based reporter assay. The most potent compound showed antihypertrophic actions in various in vitro assays and experimental models of pressure overload and myocardial ischemia in vivo. Micro- and nanoparticles (MNPs) are promising tools in different diagnostic and therapeutic applications in medicine. In the present study, the biosafety of the porous silicon MNPs for cardiac drug delivery was investigated and differences in biocompatibility between different types of MNPs were found. In summary, the results suggest that modulation of the key transcription factors involved in cardiac hypertrophy may provide the possibility for novel therapeutic interventions for HF. Moreover, porous silicon MNPs were shown to be applicable biomaterials for drug delivery into the heart., Tiivistelmä Sydämen vajaatoiminta on kliininen oireyhtymä, jonka tyypilliset oireet (mm. hengenahdistus, lihasväsymys ja nilkkaturvotus) ovat seurausta alentuneeseen sydämen minuuttitilavuuteen johtavista sydämen rakenteellisista ja/tai toiminnallisista muutoksista. Erilaiset patofysiologiset ärsykkeet (esim. paineylikuormitus ja sydänlihasvaurio) aktivoivat useita mekanismeja (esim. neurohumoraalinen aktivaatio, tulehdus, solukuolema, sidekudostuminen), jotka johtavat sydänlihaksen kasvuun ja uudelleen muovautumiseen, ja lopulta sydämen toimintahäiriöön. Vaikka sydämen vajaatoimintapotilaiden ennuste on parantunut ja sairaalahoitojaksojen määrä vähentynyt lääkehoitojen ansiosta, sydän- ja verenkiertoelinten sairaudet ovat edelleen yleisin kuolinsyy maailmanlaajuisesti. Siksi tarvitaan uusia lähestymistapoja sydämen vajaatoiminnan lääkehoidon tehostamiseksi. Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli fenotyyppisen solupohjaisen reportterikokeen avulla tunnistaa uudenlaisia pienimolekyylisiä yhdisteitä muuntelemaan transkriptiotekijöiden GATA4 ja NKX2-5 sydänlihaksen kasvuun liittyvää transkriptionaalista yhteisvaikutusta. Voimakkaimmalla yhteisvaikutuksen estäjäyhdisteellä oli sydänlihaksen kasvua estäviä vaikutuksia useissa soluviljelymalleissa ja kokeellisissa paineylikuormituksen ja sydänlihaksen iskemian koe-eläinmalleissa. Mikro- ja nanokokoiset partikkelit ovat lupaavia erilaisissa lääketieteen diagnostisissa ja hoidollisissa sovelluksissa. Tässä väitöstutkimuksessa tutkittiin huokoisesta piistä valmistettujen mikro- ja nanopartikkelien bioturvallisuutta annosteltaessa yhdisteitä sydänkudokseen. Väitöstutkimuksen tulosten perusteella voidaan päätellä, että sydämen hypertrofiassa keskeisten transkriptiotekijöiden toiminnan muuntelu tarjoaa mahdollisuuden uudenlaisille sydämen vajaatoiminnan lääkehoidoille. Lisäksi havaittiin, että huokoinen pii soveltuu käytettäväksi yhdisteiden annosteluun sydänkudokseen.

In this study, we investigated whether local intramyocardial GATA4 overexpression affects the left ventricular (LV) remodelling process and the importance of phosphorylation at serine 105 (S105) for the actions of GATA4 in an angiotensin II (AngII)‐induced hypertension rat model. Adenoviral constructs overexpressing wild‐type GATA4 or GATA4 mutated at S105 were delivered into the anterior LV free wall. AngII (33.3 µg/kg/h) was administered via subcutaneously implanted minipumps. Cardiac function and structure were examined by echocardiography, followed by histological immunostainings of LV sections and gene expression measurements by RT‐qPCR. The effects of GATA4 on cultured neonatal rat ventricular fibroblasts were evaluated. In AngII‐induced hypertension, GATA4 overexpression repressed fibrotic gene expression, reversed the hypertrophic adult‐to‐foetal isoform switch of myofibrillar genes and prevented apoptosis, whereas histological fibrosis was not affected. Overexpression of GATA4 mutated at S105 resulted in LV chamber dilatation, cardiac dysfunction and had minor effects on expression of myocardial remodelling genes. Fibrotic gene expression in cardiac fibroblasts was differently affected by overexpression of wild‐type or mutated GATA4. Our results indicate that GATA4 reduces AngII‐induced responses by interfering with pro‐fibrotic and hypertrophic gene expressions. GATA4 actions on LV remodelling and fibroblasts are dependent on phosphorylation site S105.

Heart failure, a progressive disease, is a consequence of various cardiac diseases. It is one of the leading causes of mortality in the world and a challenge for modern medicine. Although the primary prevention of cardiac diseases in developed countries has improved, the absolute number of heart failure patients is increasing. The current treatments relieve the symptoms and improve quality of life, but they only delay the progression of the disease. Cardiac hypertrophy initially develops as an adaptive response to reduce ventricular wall stress and maintain cardiac function. However, if hypertrophy is prolonged, it activates pathological remodelling processes, e.g. increased fibrosis and cell death, inadequate angiogenesis and upregulation of foetal gene expression. Sequence-specific DNA-binding proteins, transcription factors (TFs), regulate gene expression and coordinate cell specification. The TF GATA-binding protein 4 (GATA4) is involved in several remodelling processes. It mediates the hypertrophic growth of cardiomyocytes, induces angiogenesis, and regulates apoptosis and cell survival. GATA4 and another cardiac TF, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), interact physically and synergistically upregulate gene expression of, e.g. the foetal genes. In addition, their physical co-operation is required for mechanical stretch-induced brain natriuretic peptide (BNP) activation and cardiomyocyte hypertrophy. Thus, GATA4-NKX2-5 interaction is an interesting novel drug target. The aim of this thesis was to (i) characterise the GATA4-NKX2-5 protein-protein interaction and determine the NKX2-5 binding site on the GATA4 protein, (ii) investigate small molecule binding to GATA4 and NKX2-5 and (iii) to study the effect of the small molecule compounds in experimental in vivo models of heart failure. Mutational studies revealed a specific region involving amino acid N272 on the surface of the GATA4 protein that mediates the interaction with NKX2-5. The inhibitor of GATA4-NKX2-5 in, Tiivistelmä Sydämen vajaatoiminta on etenevä sairaus, joka on seurausta tai liittyy useisiin eri sydänsairauksiin. Se on yksi johtavista kuolleisuuden syistä maailmassa ja haaste nykyaikaiselle lääketieteelle. Vaikka kehittyneissä maissa sydänsairauksien ennaltaehkäisy on parantunut, niin vajaatoimintaa sairastavien potilaiden absoluuttinen määrä kuitenkin lisääntyy. Nykyinen lääkehoito helpottaa oireita ja parantaa elämänlaatua, mutta vain hidastaa sairauden etenemistä. Sydämen liikakasvu vähentää aluksi vasemman kammion seinämän stressiä ja ylläpitää sydämen riittävää toimintaa. Jos tila jatkuu pitkään, patologiset uudelleenmuovautumisprosessit aktivoituvat ja esim. sidekudosta muodostuu lisää, solukuolema ja sikiönaikaisten geenien luenta lisääntyvät. Transkriptiotekijät ovat proteiineja, jotka sitoutuvat sekvenssispesifisesti DNA:han ja siten säätelevät ja koordinoivat geenien luentaa sekä solun toimintaa. Etenkin GATA-sekvenssiin sitoutuva proteiini, GATA4, on mukana useissa uudelleen muovautumisprosesseissa. Se mm. välittää sydänlihassolujen kasvua ja säätelee solukuolemaa. GATA4 ja toinen sydämen transkriptiotekijä NKX2-5 sitoutuvat toisiinsa fyysisesti ja aktivoivat synergistisesti geenien, kuten sikiöaikaisten geenien, luentaa. Lisäksi niiden fyysinen vuorovaikutus on tärkeää mekaanisen venytyksen aiheuttamassa B-tyypin natriureettisen peptidin (BNP) aktivaatiossa ja sydänlihassolujen kasvussa. GATA4-NKX2-5 proteiini-proteiini vuorovaikutus onkin uusi mielenkiintoinen lääkevaikutuskohde. Tämän väitöskirjatyön tavoite oli (i) tutkia GATA4 ja NKX2-5 proteiini-proteiini vuorovaikutusta ja määrittää NKX2-5:n sitoutumispaikka GATA4:ssä, (ii) tutkia pienimolekyylisen yhdisteen sitoutumista GATA4:ään ja NKX2-5:een sekä (iii) tutkia yhdisteiden vaikutuksia in vivo kokeellisissa sydämen vajaatoimintamalleissa. Mutaatiokokeet osoittivat, että GATA4 proteiinin pinnalla, aminohapon N272 kohdalla oleva alue on tärkeä sitoutumiselle NKX2-5:n kanssa. GATA4-NKX2-5 vuorovai

Summary Myocardial infarction (MI)−induced cardiac fibrosis attenuates cardiac contractile function, and predisposes to arrhythmias and sudden cardiac death. Expression of connective tissue growth factor (CTGF) is elevated in affected organs in virtually every fibrotic disorder and in the diseased human myocardium. Mice were subjected to treatment with a CTGF monoclonal antibody (mAb) during infarct repair, post-MI left ventricular (LV) remodeling, or acute ischemia−reperfusion injury. CTGF mAb therapy during infarct repair improved survival and reduced LV dysfunction, and reduced post-MI LV hypertrophy and fibrosis. Mechanistically, CTGF mAb therapy induced expression of cardiac developmental and/or repair genes and attenuated expression of inflammatory and/or fibrotic genes.

Background: Calcific aortic valve disease (CAVD) is an atheroinflammatory process; finally it leads to progressive calcification of the valve. There is no effective pharmacological treatment for CAVD and many of the underlying molecular mechanisms remain unknown. We conducted a proteomic study to reveal novel factors associated with CAVD. Methods: We compared aortic valves from patients undergoing valvular replacement surgery due to non-calcified aortic insufficiency (control group, n = 5) to a stenotic group (n = 7) using two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE). Protein spots were identified with mass spectrometry. Western blot and immunohistochemistry were used to validate the results in a separate patient cohort and Ingenuity Pathway Analysis (IPA) was exploited to predict the regulatory network of CAVD. Results: We detected an upregulation of complement 9 (C9), serum amyloid P-component (APCS) and transgelin as well as downregulation of heat shock protein (HSP90), protein disulfide isomerase A3 (PDIA3), annexin A2 (ANXA2) and galectin-1 in patients with aortic valve stenosis. The decreased protein expression of HSP90 was confirmed with Western blot. Conclusions: We describe here a novel data set of proteomic changes associated with CAVD, including downregulation of the pro-inflammatory cytosolic protein, HSP90.

Cardiac loading induces left ventricular hypertrophy and cardiac remodeling which when prolonged, leads to heart failure, a complex syndrome affecting approximately 1-2% of the adult population of the Western world with a prevalence increasing with age. Pathological remodeling involves functional and structural changes that are associated with fetal gene expression, sarcomeric re-organization, hypertrophy of cardiomyocytes, fibrosis, inflammation, oxidative stress and impairment of metabolism. The aim of this study was to investigate the role of three novel factors during the cardiac remodeling process with different experimental models of cardiac overload. Phosphatase and actin regulator 1 (Phacr1) expression was rapidly downregulated due to myocardial infarction (MI). Adenovirus-mediated Phactr1 overexpression changed the skeletal α-actin to cardiac α-actin ratio in both healthy and infarcted rat hearts and cultured cardiomyocytes. Phactr1 could regulate the actin isoform switch via the serum response factor (SRF). The expression of transforming growth factor (TGF)- β-stimulated clone 22 (TSC-22) was rapidly induced by multiple hypertrophic stimuli and was also evident post-MI. In addition, TSC-22 could regulate collagen 3a1 expression in the heart. The expression of retinal degeneration 3-like (Rd3l) was downregulated in response to pressure overload and also downregulated post-MI. Rd3l knockout mice expressed increased myocyte hypertrophy and cardiac dysfunction in response to a transverse aortic constriction (TAC) induced pressure overload. This thesis provides novel information about Phactr1, TSC-22 and Rd3l in load-induced cardiac hypertrophy and remodeling. Collectively these studies increase our understanding of the regulatory mechanisms underlying the progression of heart failure., Tiivistelmä Sydämen kuormitus saa aikaan vasemman kammion liikakasvun eli hypertrofian ja sydämen uudelleenmuovautumisen, mikä pitkittyessään johtaa sydämen vajaatoimintaan. Sydämen vajaatoiminta on monimutkainen oireyhtymä, josta länsimaissa kärsii noin 1-2 % aikuisväestöstä, ja esiintyvyys nousee iän myötä. Patologisessa uudelleenmuovautumisessa tapahtuu toiminnallisia ja rakenteellisia muutoksia, joihin liittyy muutoksia geenien ilmentymisessä, sarkomeerin uudelleen järjestäytymistä, sydänlihassolujen koon kasvua, fibroosia, tulehdusta, oksidatiivista stressiä ja aineenvaihdunnan huonontumista. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia kolmen uuden tekijän roolia sydämen uudelleenmuovautumisessa erilaisissa kokeellisissa sydämen kuormituksen malleissa. Fosfataasin ja aktiinin säätelijä 1:n (Phactr1) ilmentyminen väheni nopeasti infarktin seurauksena. Adenovirusvälitteinen Phactr1:n ylituotanto muutti luusto- ja sydänlihasaktiinien isomuotojen suhdetta sekä terveessä että infarktisydämessä, samoin viljellyissä sydänlihassoluissa. Phactr1 saattaa säädellä isomuotojen suhdetta seerumiresponsiivisen tekijän (SRF) avulla. Transformoituvan kasvutekijä β1:n stimuloima proteiini 22:n (TSC-22) ilmentyminen nousi nopeasti usean hypertrofisen stimuluksen seurauksena sekä infarktin jälkeen. Lisäksi TSC-22 voisi säädellä kollageeni 3a1:n ilmentymistä sydämessä. Retinan degeneroituvan proteiinin 3 kaltaisen tekijän (Rd3l) ilmentyminen väheni sekä painekuormituksen että infarktin seurauksena. Rd3l-poistogeenisillä hiirillä aortan ahtauman aiheuttama painekuormitus sai aikaan lisääntynyttä sydänlihassolujen hypertrofiaa ja sydämen toimintahäiriöitä. Tämä väitöskirjatutkimus tuo uutta tietoa Phactr1-, TSC-22- ja Rd3l-geeneistä kuormituksen aiheuttamassa sydämen hypertrofiassa ja uudelleenmuovautumisessa. Nämä tulokset auttavat osaltaan ymmärtämään monimutkaisia molekyylitason mekanismeja, jotka johtavat sydämen vaajatoiminnan kehittymiseen.

Identification of the adult cardiac stem cells (CSCs) has offered new therapeutic possibilities for treating ischemic myocardium. CSCs positive for the cell surface antigen c-Kit are known as the primary source for cardiac regeneration. Accumulating evidence shows that chemokines play important roles in stem cell homing. Here we investigated molecular targets to be utilized in modulating the mobility of endogenous CSCs. In a four week follow-up after experimental acute myocardial infarction (AMI) with ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery of Sprague-Dawley rats c-Kit+ CSCs redistributed in the heart. The number of c-Kit+ CSCs in the atrial c-Kit niche was diminished, whereas increased amount was observed in the left ventricle and apex. This was associated with increased expression of stromal cell-derived factor 1 alpha (SDF1α), and a significant positive correlation was found between c-Kit+ CSCs and SDF1α expression in the heart. Moreover, the migratory capacity of isolated c-Kit+ CSCs was induced by SDF1 treatment in vitro. We conclude that upregulation of SDF1α after AMI associates with increased expression of endogenous c-Kit+ CSCs in the injury area, and show induced migration of c-Kit+ cells by SDF1.

Mechanical forces are able to activate hypertrophic growth of cardiomyocytes in the overloaded myocardium. However, the transcriptional profiles triggered by mechanical stretch in cardiac myocytes are not fully understood. Here, we performed the first genome-wide time series study of gene expression changes in stretched cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVM)s, resulting in 205, 579, 737, 621, and 1542 differentially expressed (>2-fold, P<0.05) genes in response to 1, 4, 12, 24, and 48 hours of cyclic mechanical stretch. We used Ingenuity Pathway Analysis to predict functional pathways and upstream regulators of differentially expressed genes in order to identify regulatory networks that may lead to mechanical stretch induced hypertrophic growth of cardiomyocytes. We also performed micro (miRNA) expression profiling of stretched NRVMs, and identified that a total of 8 and 87 miRNAs were significantly (P<0.05) altered by 1–12 and 24–48 hours of mechanical stretch, respectively. Finally, through integration of miRNA and mRNA data, we predicted the miRNAs that regulate mRNAs potentially leading to the hypertrophic growth induced by mechanical stretch. These analyses predicted nuclear factor-like 2 (Nrf2) and interferon regulatory transcription factors as well as the let-7 family of miRNAs as playing roles in the regulation of stretch-regulated genes in cardiomyocytes.

Safety assessment of drug candidates in numerous in vitro and experimental animal models is expensive, time consuming and animal intensive. More thorough toxicity profiling already in the early drug discovery projects using human cell models, which more closely resemble the physiological cell types, would help to decrease drug development costs. In this study we aimed to compare different cardiac and stem cell models for in vitro toxicity testing and to elucidate structure–toxicity relationships of novel compounds targeting the cardiac transcription factor GATA4. By screening the effects of eight compounds at concentrations ranging from 10 nM up to 30 µM on the viability of eight different cell types, we identified significant cell type- and structure-dependent toxicity profiles. We further characterized two compounds in more detail using high-content analysis. The results highlight the importance of cell type selection for toxicity screening and indicate that stem cells represent the most sensitive screening model, which can detect toxicity that may otherwise remain unnoticed. Furthermore, our structure–toxicity analysis reveals a characteristic dihedral angle in the GATA4-targeted compounds that causes stem cell toxicity and thus helps to direct further drug development efforts towards non-toxic derivatives.

Acute myocardial infarction is a life-threatening condition that occurs as a result of reduced blood flow in the cardiac muscle, eventually leading to tissue damage. In infarcted areas, cardiomyocytes have insufficient ability to proliferate and replace the injured cells, which is associated with a deficient pumping capacity. A strictly regulated combinatorial interplay of transcription factors, e.g., GATA4, NKX2-5, TBX5, and MEF2C, orchestrates cardiac type gene expression during the cardiomyocyte differentiation and maturation processes. The aim of the present study was to (i) characterize the protein-protein interaction of the cardiac transcription factors GATA4-NKX2-5, (ii) evaluate the chemical agents that modify the synergy of GATA4-NKX2-5 in vitro, (iii) examine the capacity of the lead compound to promote myocardial repair in vivo after myocardial infarction and other cardiac injuries and (iv) study the structural features of the compound important for metabolism and cytotoxicity. Integration of the experimental mutagenic data with computational modeling suggests that the structural architecture of the GATA4-NKX2-5 interaction resembles the protein structure of the conserved DNA binding domain of nuclear receptors. Fragment-based screening, reporter gene-based optimization and pharmacophore searching were utilized to identify the most potent lead compound targeting the GATA4-NKX2-5 interaction: N-[4-(diethylamino)phenyl]-5-methyl-3-phenylisoxazole-4-carboxamide. This compound presented anti-hypertrophic effects in vitro and cardioprotective effects in vivo. In addition, structural analysis of the lead compound revealed the signature molecular features for metabolism and cytotoxicity. Current drug treatments are able to delay, but not prevent the progress of the heart failure; therefore, modulators of protein-protein interactions of key transcription factors may represent a novel class of pharmaceuticals for cardiac remodeling and repair., Tiivistelmä Sydäninfarkti on henkeä uhkaava verenkierron häiriö, joka syntyy veren virtauksen äkillisen vähentymisen seurauksena sydänlihaksessa aiheuttaen kudosvaurion. Vaurioituneen sydänlihaskudoksen kyky uusiutua tai korvata kuolleet sydänlihassolut uusilla on puutteellinen, ja tämän seurauksena sydämen pumppauskyky heikkenee. Transkriptiotekijöiden GATA4, NKX2-5, TBX5 ja MEF2C muodostamat ja koordinoimat proteiinikompleksit säätelevät sydänsolujen geenien ilmenemistä solujen elinkaaren aikana. Väitöskirjatyön tavoitteena oli (i) karakterisoida geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 molekyylirakenteet ja niiden keskinäinen vuorovaikutus, (ii) seuloa kemiallisia yhdisteitä, jotka muokkaavat GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin aikaansaamaa geeniaktivaatiota, (iii) tutkia johtoyhdisteen vaikutuksia in vivo sydäninfarktia ja painekuormitusta kuvaavissa eläinmalleissa, ja (iv) tutkia johtoyhdisteen molekyylirakenteen yhteyttä yhdisteen metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Väitöskirjatyö osoittaa molekyylimallinuksen ja kokeellisten tulosten perusteella, että geeninsäätelytekijöiden GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin orientaatio matkii tumareseptoriperheen DNA domeenin tertiäärirakennetta. Molekyylifragmenttien, lusiferaasi-reportterikokeen ja farmakoforimallin avulla seulottiin ja optimoitiin sitoutumisvoimakkuudeltaan lupaavin GATA4-NKX2-5 proteiinikompleksin toimintaan vaikuttava johtoyhdiste: N-[4-(dietyyliamino)fenyyli]-5-metyyli-3-fenyyli-isoksatsoli-4-karboksamidi. Johtoyhdisteellä havaittiin solu- ja eläinmalleissa hypertrofiaa estäviä vaikutuksia in vitro ja sydäntä suojaavia vaikutuksia in vivo. Väitöskirjatyö osoitti lisäksi aktiivisten molekyylien rakenneominaisuuksia, jotka keskeisesti vaikuttavat yhdisteiden metaboliaan ja sytotoksisuuteen. Nykyinen lääkehoito hidastaa, mutta ei pysäytä sydänlihasvaurioon liittyvän kroonisen sydämen vajaatoiminnan etenemistä. Lääkevaikutuksen kohdentaminen sydämen keskeisten transkriptiotekijöiden yhteisvaikutukseen avaa uuden mahd

Transcription factors are fundamental regulators of gene transcription, and many diseases, such as heart diseases, are associated with deregulation of transcriptional networks. In the adult heart, zinc-finger transcription factor GATA4 is a critical regulator of cardiac repair and remodelling. Previous studies also suggest that NKX2-5 plays function role as a cofactor of GATA4. We have recently reported the identification of small molecules that either inhibit or enhance the GATA4–NKX2-5 transcriptional synergy. Here, we examined the cardiac actions of a potent inhibitor (3i-1000) of GATA4–NKX2-5 interaction in experimental models of myocardial ischemic injury and pressure overload. In mice after myocardial infarction, 3i-1000 significantly improved left ventricular ejection fraction and fractional shortening, and attenuated myocardial structural changes. The compound also improved cardiac function in an experimental model of angiotensin II -mediated hypertension in rats. Furthermore, the up-regulation of cardiac gene expression induced by myocardial infarction and ischemia reduced with treatment of 3i-1000 or when micro- and nanoparticles loaded with 3i-1000 were injected intramyocardially or intravenously, respectively. The compound inhibited stretch- and phenylephrine-induced hypertrophic response in neonatal rat cardiomyocytes. These results indicate significant potential for small molecules targeting GATA4–NKX2-5 interaction to promote myocardial repair after myocardial infarction and other cardiac injuries.

Cardiac hypertrophy is an adaptive response to increased cardiac workload. It is initially beneficial, since it helps to maintain cardiac output, but ultimately it is considered as an independent predictor for heart failure and sudden cardiac death. The cardiac hypertrophic response is triggered by mechanical and neurohumoral stimuli and is associated with the activation of complex changes in gene programming and intracellular signaling pathways. The purpose of this study was to investigate the expression of some novel load-induced factors i.e. melusin, thrombospondin (TSP)-1 and -4 and LIM and cysteine-rich domains protein 1 (LMCD1)/dyxin during the hypertrophic response. Melusin was expressed in cardiac tissue both in the atria and ventricles, furthermore its expression was very rapidly activated in response to multiple hypertrophic stimuli predominantly in the left atria. Melusin gene expression was activated when cultured cardiac myocytes were subjected to mechanical stretch or hypertrophic agonists such as endothelin-1 or angiotensin (Ang II). TSP-1 and TSP-4 gene expressions were rapidly activated at an early stage of pressure overload. Myocardial infarction (MI) induced the expression of both TSP-4 and TSP-1 mRNA in the heart. TSP-4 may also be an endothelial cell-specific marker of pressure overload since its expression was limited to endothelial cells in the adult heart. The expression of LMCD1/dyxin was found to be induced during the cardiac hypertrophic response and after MI. By itself, mechanical load was a critical regulator of LMCD1/dyxin gene expression. LMCD1/dyxin is a putative novel p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) target since adenovirus-mediated overexpression of p38 MAPK upregulated LMCD1/dyxin expression. In addition, during the Ang II-induced pressure overload p38 MAPK phosphorylation levels correlated with the early induction of LMCD1/dyxin expression. In conclusion, this study provides new information on the expression of, Tiivistelmä Sydänlihas mukautuu lisääntyneeseen kuormitukseen lihassolujen koon kasvun eli hypertrofian avulla. Pitkittyessään hypertrofinen kasvu on kuitenkin tärkeä sydämen vajaatoimintaa ja äkkikuolemaa ennakoiva riskitekijä. Hypertrofisessa vasteessa mekaaninen venytys sekä neurohumoraaliset tekijät saavat aikaan solunsisäisten signaalinvälitysreittien aktivoitumisen, mikä johtaa lisääntyneeseen geenien luentaan ja proteiinituotantoon. Väitöskirjassa tutkittiin uusien kuormitusaktivoituvien tekijöiden, melusiinin, trombospondiini (TSP) -1:n ja -4:n sekä dyksiinin ilmentymistä hypertrofisen vasteen aikana. Melusiinia ilmentyy sydämessä sekä kammioissa että eteisissä, mutta painekuormituksen myötä se aktivoituu nopeasti pääasiassa vasemmassa eteisessä. Sydänlihassolujen soluviljelymallissa melusiinin luenta lisääntyy suoraan mekaanisen venytyksen ja hypertrofisten agonistien vaikutuksesta. Painekuormitus aktivoi nopeasti myös TSP-1:n ja -4:n luentaa sydämessä. TSP-1:n ja -4:n geeniluenta lisääntyy myös kokeellisessa sydäninfarktimallissa. Lisäksi sydämessä TSP-4:ää havaittiin olevan ensisijaisesti endoteelisoluissa. Dyksiinin ilmentyminen lisääntyi sekä painekuormituksen että sydäninfarktin aiheuttaman sydänlihaksen uudelleenmuovautumisen aikana. Mekaaninen kuormitus riitti jo yksinään aktivoimaan dyksiinin geeniluentaa sydämessä. Lisäksi mitogeeni-aktivoituvan p38-proteiinikinaasin havaittiin säätelevän dyksiinin ilmentämistä. Väitöskirjatyössä saatiin uutta tietoa sydänlihaksen kuormituksen aikaisista muutoksista geenien luennassa sydänlihaksessa. Työssä osoitettiin, että painekuormitus aktivoi sydämessä aiemmin vähän tutkittujen geenien, melusiinin, TSP-1:n ja -4:n sekä dyksiinin, ilmentymistä. Näiden tekijöiden aktivoituminen hypertrofisen vasteen alkuvaiheessa antaa viitettä siitä, että tekijät osallistuvat kuormittuneen sydänlihaskudoksen uudelleenmuovautumiseen. Melusiini voi toimia erityisesti eteiskudosta kuormitukselta suojaavissa mekanismeissa, kun taas

Calcific aortic valve disease (CAVD) is the most common valvular heart disease in the Western world. Although it shares mainly the same risk factors as coronary heart disease (CHD), i.e. similar initial events in both diseases but with time, they lead to different clinical outcomes. Thus, when it affects the coronary arteries, the disease leads to an obstructive or rupture-prone plaque whereas in the aortic valve, it causes massive calcification and ossification. This obstructs the blood flow from the left cardiac ventricle, causing myocardial hypertrophy, and if left untreated, heart failure and death. Many of the pathobiological differences between CAVD and CHD remain unknown. Currently, there are no effective lifestyle- or pharmacologic treatments for CAVD and the only therapy is a valve replacement operation. In this thesis, several studies utilizing large-scale methods were undertaken to profile the molecular events leading to CAVD. Surgically removed valves from patients in different stages of the disease were obtained and gene transcripts, microRNA-molecules and several proteins were identified as being differentially expressed. Several of these were investigated further, including two pro-inflammatory CC-type chemokine ligands 3 and 4 (CCL3 and CCL4), microRNA-125b, several granzyme-proteins and heat-shock protein 90. The results of this thesis provide a large dataset of hundreds of molecular changes associated with CAVD. It is proposed that they can be used as a basis for the generation of new hypotheses and assist in the design of experiments to clarify the mechanisms driving CAVD., Tiivistelmä Aorttaläpän kalkkeutuva ahtauma on länsimaiden yleisin sydänläppäsairaus. Riskitekijät ovat pääosin samat kuin sepelvaltimotaudissa, ja molemmat saavat alkunsa samalla tavalla. Ajan myötä ne kuitenkin johtavat varsin erilaisiin kliinisiin ilmenemismuotoihin: sepelvaltimoihin kasvaa ahtauttavia ja repeytymisherkkiä plakkeja, kun taas aorttaläppään muodostuu runsaasti kalkkia ja luuta. Se haittaa verenvirtausta sydämen vasemmasta kammiosta aorttaan, mikä aiheuttaa sydänlihaksen paksuuntumista. Hoitamattomana tauti johtaa lopulta sydämen vajaatoimintaan ja kuolemaan. Monet syyt eroihin sepelvaltimotaudin ja aorttaläpän ahtauman välillä ovat edelleen tuntemattomia. Tällä hetkellä aorttaläpän ahtaumaan ei ole olemassa tehokasta elintapa- tai lääkehoitoa, ja ainoa hoitomuoto onkin vioittuneen aorttaläpän korvaaminen proteesilla. Tässä väitöskirjatyössä tehtiin useita laaja-alaisia molekyylitason profilointitutkimuksia, joilla selvitettiin aorttaläpän ahtaumaan mahdollisesti johtavia mekanismeja. Aineistona oli leikkauksessa potilailta poistettuja, erilaisissa taudin vaiheissa olevia aorttaläppiä. Niistä kerättiin tietoja kaikkien geenien ilmentymisestä, mikroRNA-molekyyleistä sekä koko proteomitason muutoksista. Useat tunnistetuista molekyyleistä valittiin jatkotutkimuksiin niiden tarkempien ominaisuuksien selvittämiseksi. Näitä olivat tulehdusta välittävät kemokiinit CCL3 ja CCL4, mikroRNA-125b, useat grantsyymiproteiinit sekä lämpöshokkiproteiini 90. Väitöskirjatyön tuloksista voidaan muodostaa ainutlaatuinen aineisto sadoista erilaisista aorttaläpän ahtaumaan johtavista molekyylitason muutoksista. Sitä voidaan hyödyntää uusien tutkimushypoteesien muodostamisessa sekä aorttaläpän ahtauman tarkempien mekanismien selvittämiseen tähtäävien kokeellisten tutkimusten suunnittelussa.

Cardiac hypertrophy is the primary adaptive mechanism of the heart to increased workload, though when advanced, it becomes a leading predictor for heart failure and sudden death. The growth stimulus elicited by a hemodynamic load is attributable to a combination of mechanical and neurohumoral factors, but the precise roles of individual growth promoting components are still unclear. This study utilized atrial natriuretic peptide (ANP) and B-type natriuretic peptide (BNP) as model genes with which to investigate the involvement and mechanisms of mechanical stress and peptide growth factors in hypertrophic response of cardiac myocytes. The direct effect of mechanical stretch was studied in two different in vitro models of cultured neonatal rat cardiomyocytes. In the first approach, hypo-osmotic swelling -induced stretch increased ANP mRNA levels in atrial cells. In the second model, cyclic mechanical stretch of ventricular cells grown on flexible membranes evoked ANP and BNP gene expression and secretion. The mechanisms of stretch-induced BNP gene expression were studied by measurement of the activities of transcription factors and by utilizing promoter analysis together with site specific mutations. Stretch activated the binding of the transcription factor GATA-4 similarly to pressure overload in vivo. Mutational studies revealed that specific GATA consensus sites on the BNP promoter, in combination with an Nkx-2.5 binding element, were critical for stretch-activated BNP transcription. Importantly, a reduction of GATA-4 protein levels inhibited the stretch-induced hypertrophic response. Both cyclic mechanical stretchin vitro and hemodynamic overload in vivo activated the expression of peptide growth factor bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). The effects of BMP-2 closely resembled those of mechanical stretch including the increase in the expressions of ANP and BNP. Furthermore, the BMP antagonist noggin inhibited the effect of stretch on ANP and BNP. Fibrob, Tiivistelmä Sydämen tärkein mukautumiskeino kohonneeseen työmäärään on sydänlihaksen kasvu. Sydänlihaksen liikakasvu on kuitenkin tärkein sydämen vajaatoiminnan ja äkkikuoleman ennustetekijä. Hemodynaamisen ylikuormituksen kasvua edistävä vaikutus on lukuisten mekaanisten ja neurohumoraalisten tekijöiden summa, jossa kunkin yksittäisen tekijän osuus on vielä epäselvä. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin mekaanisen venytyksen ja peptidikasvutekijöiden osuutta ja vaikutusmekanismeja sydämen liikakasvun synnyssä käyttämällä malligeeneinä sydämen eteispeptidiä (ANP) ja B-tyypin natriureettista peptidiä (BNP). Mekaanisen venytyksen välitöntä vaikutusta tutkittiin vastasyntyneen rotan sydänsoluviljelymalleissa. Osmolaliteetin muutoksella aiheutettu venytys lisäsi ANP:n lähetti-RNA-tasoja eteissoluissa. Venyväpohjaisilla kalvoilla kasvatettujen kammiosolujen syklinen venytys stimuloi ANP:n ja BNP:n geeniekspressiota ja eritystä. BNP:n geenisäätelymekanismeja tutkittiin mittaamalla transkriptiotekijöiden aktiivisuutta sekä geeninsiirtokokeilla hyödyntäen muunneltuja BNP:n geenisäätelyalueita. Venytys lisäsi transkriptiotekijä GATA-4:n sitoutumisaktiivisuutta samaan tapaan kuin painekuormitus koe-eläimillä. Tietyt BNP:n säätelyalueen GATA-sitoutumispaikat yhdessä Nkx-2.5:ttä sitovan elementin kanssa osoittautuivat tärkeiksi venytysvasteen kannalta. GATA-4 -proteiinitasojen vähentäminen esti venytyksen aiheuttamaa kasvuvastetta. Sekä syklinen mekaaninen venytys soluviljelykokeissa että hemodynaaminen ylikuormitus koe-eläimillä lisäsivät peptidikasvutekijä bone morphogenetic protein-2:n (BMP-2) geeniekspressiota. BMP-2:n suorat vaikutukset puolestaan muistuttivat läheisesti mekaanisen venytyksen vaikutusta, ANP:n ja BNP:n lisääntynyt geeniekspressio mukaan lukien. BMP-antagonisti noggin esti lisäksi venytyksen vaikutusta ANP:iin ja BNP:iin. Työssä osoitettiin myös, että fibroblastikasvutekijä 1 stimuloi ANP:n synteesiä ja eritystä proteiinikinaasi C:n välityksellä. Yhteenvetona

Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the developed countries and their incidence is not expected to decrease in the future. There is a lifetime risk of one in five of developing heart failure, which still has poor prognosis and current treatments only cover part of the pathophysiology behind this syndrome. Pathological processes contributing to heart failure include cardiac hypertrophy and remodeling, which involves neurohumoral activation, reactivation of fetal genes, impaired Ca2+ cycling, increased apoptosis, and increased fibrosis. Intracellular signalling pathways and transcription factors mediating the response to various extracellular stresses have a key role in the regulation of myocardial remodeling and they are investigated in order to develop new approaches for the treatment of heart failure. The aim of this thesis was to elucidate roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and transcription factor GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function in cell cultures, and in hearts ex vivo and in vivo. The main findings were that (i) Inhibition of p38α MAPK enhanced function of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase and thus cardiac contractility by increasing phosphorylation of protein phosphatase inhibitor-1 and phospholamban, (ii) p38 MAPK isoforms p38α and p38β regulated promoter activity of B-type natriuretic peptide via distinct pathways, (iii) p38α and p38β MAPKs also had different effects on gene expressions related to fibrosis and hypertrophy, and (iv) p38 and ERK1/2 MAPKs mediated stretch-induced activation of GATA-4 by phosphorylation at Ser 105. GATA-4 also seems to be regulated by ubiquitination. This study provides novel data of p38 MAPK and GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function. Inhibition of p38α MAPK could be beneficial in the treatment of heart failure. Also GATA-4 is a potential target for treatment of cardiovascular diseases., Tiivistelmä Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, eikä niiden ilmaantuvuus tule vähenemään lähitulevaisuudessa. Elinikäinen riski sairastua sydämen vajaatoimintaan on 20 %, ja sydämen vajaatoiminnan ennuste on edelleen huono. Nykyisillä hoitomuodoilla voidaan puuttua vain osittain sydämen vajaatoiminnan patofysiologisiin mekanismeihin. Sydämen vajaatoiminnan kehittymiseen liittyvät sydänlihaksen liikakasvu ja uudelleenmuovautumisprosessi, johon liittyy neurohumoraalinen aktivaatio, sikiöaikaisten geenien uudelleenilmentyminen, häiriöt solunsisäisessä Ca2+-viestinnässä sekä lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema ja sidekudoksen muodostuminen sydämeen. Solunsisäisillä viestinvälitysketjuilla sekä transkriptiotekijöillä, jotka vastaavat solunulkoisten ärsykkeiden välittämisestä solun sisällä, on keskeinen rooli edellämainittujen prosessien säätelyssä. Uusien lähestymistapojen kehittäminen sydämen vajaatoiminnan hoitoon edellyttää myös solunsisäisen viestinvälityksen ja geenien säätelyn mekanismien selvittämistä. Tämän väitöstyön tavoite oli selvittää p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja transkriptiotekijä GATA-4:n merkitystä sydämen vajaatoiminnan patogeneesissä soluviljelymalleissa. Päälöydöksiä olivat: (i) p38α MAPK -isoformin estäminen paransi kalsiumia solulimakalvostoon pumppaavan SERCA2a:n toimintaa ja sydänlihassolun supistumiskykyä lisäämällä fosfolambaanin ja proteiinifosfataasi-inhibiittori-1:n fosforylaatiota. (ii) p38 MAPK isoformit p38α ja p38β säätelivät B-tyypin natriureettisen peptidin geenin promoottorialuetta erillisten reittien kautta. (iii) p38α ja p38β isoformit vaikuttivat myös eri tavoin sydämen sidekudoksen muodostumiseen ja hypertrofiaan liittyvien geenien ilmentymiseen. (iv) p38 ja ERK1/2 välittävät venytyksen aiheuttaman GATA-4:n aktivaation fosforyloimalla seriini-105 fosforylaatiopaikan. Lisäksi GATA-4:n toimintaa säädellään ubiquitinaation avulla. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa p38 MAPK:n ja GATA