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Il dibattito sulle cellule staminali, nell’ultimo decennio è stato oggetto di privilegiato interesse sia nell’ambito della ricerca scientifica e bioetica che nella divulgazione a mezzo stampa nazionale ed internazionale; inoltre coinvolge a diverso titolo una pluralità di problematiche. Le applicazioni terapeutiche delle cellule staminali, in corso già da un decennio, per la cura di diverse patologie, risultano essere altamente promettenti ed utilizzabili anche nell’ambito della medicina rigenerativa. Gli interrogativi etici differiscono profondamente a seconda della fonte da cui le cellule staminali sono prelevate. Pertanto è necessario definire quale sia l’origine delle staminali. Assume una valenza assai diversa effettuare ricerche e sperimentazioni su staminali adulte o su staminali embrionali in quanto l’utilizzo di queste ultime comporta sempre la distruzione dell’embrione da cui sono prelevate. E’ proprio intorno a tale differenza, o meglio intorno allo status dell’embrione, che si accendono i dibattiti bioetici più roventi. Fino a pochi anni fa, il cordone ombelicale era considerato, una volta eliminato dal corpo del neonato, uno scarto biologico. La scoperta della presenza di cellule staminali emopoietiche, utilizzabili ai fini trapiantologici ha incrementato l’interesse scientifico nei confronti di esso, suscitando numerose aspettative tra i ricercatori e i clinici. Inoltre la notevole capacità delle cellule cordonali di sopportare le procedure di crioconservazione a lungo termine, ha reso concreto e possibile il loro utilizzo sia in pazienti che necessitavano di una ricostituzione emopoietica sia nell’ambito della medicina rigenerativa. Il prelievo e l’utilizzo di cellule staminali isolate da cordone ombelicale non suscitano interrogativi etici rilevanti, ma l’attenzione si riversa sulle possibilità di donazione (autologa o allogenica) e sulle caratteristiche delle banche (pubbliche o private). Pertanto anche la tematica delle cellule staminali cordonali e delle biobanche coinvolgono a pieno titolo i diritti fondamentali della persona. E’ proprio sul dibattito circa il bancaggio di sangue cordonale che si incentra questa attività di dottorato, focalizzando l’attenzione sugli aspetti etici relativi ai benefici della donazione e della conservazione di sangue cordonale, e sulla sperimentazione di nuove modalità di crioconservazione che ne migliorino l’efficienza ed incrementino la vitalità delle cellule staminali cordonali dopo lo scongelo.

Le SOD sono enzimi implicati nella difesa antiossidante e ripartiva di quasi tutte le cellule, poiché catalizzano la dismutazione del radicale superossido a perossido d’idrogeno che, successivamente, è convertito in ossigeno e acqua dall’enzima catalasi. Questi enzimi hanno la capacità di prevenire il danno provocato dagli alti livelli di ROS prodotti, in particolare da radiazioni ionizzanti (Epperly et al., 2003). Nelle cellule sono presenti tre isoforme: la SOD 1 è localizzata nel citosol, la SOD 2 nella matrice mitocondriale, mentre la SOD 3 è secreta nello spazio extracellulare (Oberley, 2005). L’isoforma SOD 2, conosciuta anche come manganese superossido dismutasi (MnSOD), ricopre un ruolo di notevole importanza nella conversione del radicale superossido (O2.-) nei mitocondri e, dunque, rappresenta la prima linea di difesa contro questo radicale (Wang et al., 2001). Recentemente nel laboratorio di ricerca del dott. Aldo Mancini (Istituto Nazionale Tumori G.Pascale) è stata isolata un’isoforma di SOD da cellule di liposarcoma umano in coltura (LSA-Type MnSOD) che ha mostrato sia in vivo che in vitro una azione citotossica specifica e selettiva solo per le cellule esprimenti il recettore per gli estrogeni. Pur avendo la stessa attività enzimatica comune a tutte le SOD, la LSA-Type MnSOD si differenzia dalla sua corrispondente nativa per la presenza del peptide leader (da 24 amminoacidi), evidentemente non clivato, che le conferisce la peculiare capacità di penetrare in tutte le cellule. Tale proteina è stata riprodotta in forma ricombinante, rMnSOD, a partire da uno specifico clone di cDNA derivato da cellule di liposarcoma umano (Mancini et al., 2006). La rMnSOD è risultata, in vitro, essere radioprotettiva per le cellule normali e radiosensibilizzante per quelle tumorali, nonchè è stata impiegata con successo nel trattamento di estese aree di necrosi tissutale di un esemplare di tartaruga Caretta caretta. (Occhiello A. et al 2009). Sulla base dei risultati precedentemente ottenuti è stato allestito uno studio pilota su 20 pazienti affetti da ulcere trofiche, piaghe da decubito, ustioni, perdite di sostanza post-traumatiche e ferite post-chirurgiche, i quali si sono spontaneamente dichiarati disponibili al trattamento con la formulazione in crema contenente la rMnSOD, I pazienti di entrambi i sessi di età compresa tra i 25 e i 85 anni sono stati medicati con una formulazione O/A a base di rMnSOD in occlusione, una volta al giorno per un tempo variabile da 15gg a 2 mesi. In tutti i pazienti si eè osservata rapida formazione di tessuto di granulazione con una riduzione significativa dei tempi di riparazione e soddisfacenti esiti cicatriziali. • Borrelli A, Schiattarella A, Mancini R, Morrica B, Cerciello V, Mormile M, d'Alesio V, Bottalico L, Morelli F, D'Armiento M, D'Armiento FP, Mancini A. Free Radical Biology and Medicine. 2009 Jan 1;46(1):110-6. Epub 2008 . • Epperly M.W., Gretton J. E., Sikora C.A., Jefferson M., Bernarding M., Nie S. and Greenberger J.S. (2003). Radiation Research. 160 (5): 568-578. • Mancini A., Borrelli A., Schiattarella A., Fasano S., Occhiello A., Pica A., Sher P., Tommasino M., Nüesch J. P. F. and Rommelaere J. (2006). International Journal of Cancer. 119 (4): 932-943. • Oberley L.W. Biomedicine & Pharmacotherapy. 59 (4): 143-148. • Occhiello A., Bentivegna F., Borrelli A., Schiattarella A., Mancini A., Pica A. Comparative clinical Pathology. DOI 10.1007/s00580-009-0816-9 • Wang L.I., Miller D.P., Sai Y., Liu G., Su L., Wain J.C., Lynch T.J. and Christiani D.C. (2001). Journal of the National Cancer Institute. 93 (23): 1818-1821. • Santoianni P., Nino M. Giornale italiano di dermatologia e venereologia. 2003. 138(6):455-64 • Nino M., Santoianni P. . Giornale italiano di dermatologia e venereologia 2006. 141(5):471-4

The endometrial cancer is one of the principal causes of death in women (Siegel et al., 2012). The main treatment for this cancer is hysterectomy that involves loss of fertility (Holland, 2008). If the tumor is not well defined and metastasizes, radio/chemo therapy are needed. The survival after chemotherapy is about 5-10 years, because it cannot kill all tumor cells. So, an isoform of manganese superoxide dismutase isolated from a human liposarcoma cell line, obtained as recombinant molecule (rMnSOD), which displayed oncotoxic action on cultured breast cancer cells (Mancini et al.,2006), was used to treat human endometrial cancer cells. This enzyme catalizes the dismutation of O2 – free radicals in H2O2, preventing the accumulation of ROS. H2O2 can be further converted into H2O and O2 by catalase and ⁄or glutathione peroxidase. Once rMnSOD penetrates cancer cells, it transforms free radicals into H2O2. This, in neoplastic cells, may lead to an high accumulation of H2O2 that causes apoptosis of them, because of their lower level of catalase (Mancini et al., 2008). We evaluated the effects of the rMnSOD treatment on cultured human endometrial adenocarcinoma cell line HTB-112. We demonstrated the oncotoxic effect of this protein, which lead HTB/112 cells to apoptotic death, by immunocytochemistry at light and electron microscopy and by comet assay test, which shows early DNA damage induced by the accumulation of H2O2. References: Siegel CA 62, 10–29; 2012; Holland Clin Oncol 20:448-56 2008 ; Mancini Int J Cancer, 119: 932–943¸ 2006.

Obiettivi. Sono state studiate le alterazioni ematologiche prodotte da danno tossico indotto in ratti Wistar dall’assunzione di DDE con la dieta, mediante monitoraggio dei parametri ematologici e l'identificazione di biomarkers, quali l’acetilcolinesterasi (AchE) e il recettore per la transferrina (TfR) sulle cellule eritroidi. Materiali e metodi. Ratti Wistar di sesso maschile, di 60 giorni di età e del peso di 400 g, suddivisi in 4 gruppi sperimentali sottoposti rispettivamente a: 1) dieta iperlipidica (40% in grassi) associata a trattamento con DDE (10 mg/Kg per peso corporeo) per 4 settimane (T2); 2) dieta standard (10% in grassi) associata a DDE (10 mg/Kg per peso corporeo) per 4 settimane (T2); 3) dieta iperlipidica (40% in grassi) associata a trattamento con DDE (10 mg/Kg per peso corporeo) per 4 settimane (T2) seguite da 2 settimane di dieta di restrizione (T3); 4) dieta standard (10% in grassi) associata a DDE (10 mg/Kg per peso corporeo) per 4 settimane (T2) seguite da 2 settimane di dieta restrizione (T3). Monitoraggio ematologico su campioni di sangue con litio eparina: determinazione spettrofotometrica dell’Hb, microematocrito, conta cellulare in camera di Bürker, formula leucocitaria, indici eritrocitari, analisi spettrofotometrica dell’AchE, rivelazione in immunocitochimica e in immunofluorescenza dell’AchE e del TfR su apposizioni midollari prima (T0) e dopo (T2-T3) trattamento con DDE. Risultati. Nei ratti di tutti i gruppi sperimentali, tra tempo iniziale (T0) e tempo finale (T2-T3) si è osservato: diminuzione della concentrazione di Hb, dell’Ht, del numero degli eritrociti e dei leucociti, dell’MCHC, e un aumento dell’MCV e dell’MCH; diminuzione dell’attività dell’AchE; riduzione della immunopositività dell’AchE e aumento della immunopositività del TfR nelle cellule eritroidi midollari. Conclusioni. L’assunzione del DDE con la dieta induce anemia macrocitica e citopenia periferica probabilmente conseguente a danno tossico midollare. Inoltre, la riduzione dell’attività enzimatica dell’AchE, la ridotta positività dell’AchE e l’aumentata positività del TfR a seguito di trattamento con DDE, suggeriscono che sia l’AchE che il TfR possano essere impiegati come markers di danno tossico da pesticidi.

In humans red blood cells live on average of 120 days. Senescent erythrocytes are removed from circulation by macrophages; this process, called erythrophagocytosis (EPC), takes place mainly in the liver but also in the bone marrow. We studied this process in loggerhead turtles Caretta caretta, inhabiting the Mediterranean Sea. Leukocytes of reptiles include heterophils, eosinophils, lymphocytes, basophils, thrombocytes, monocytes and of these heterophils and monocytes represents the main phagocytic cells. The aim of this study was to investigate the blood of Caretta caretta specimens and to observe, in the blood smears, heterophils phagocytizing erythrocytes. The phagocytizing cells were also identified by cytochemical reactions. Furthermore some examples of tear-shaped erythrocytes (dacrocytes) were observed. A mechanism presuming a causative link between erythrophagocytosis and teardrop-erythrocyte detection have been proposed to explain this seemingly general pattern of all specimens both wild and housed.

Obiettivi: L'obiettivo dello studio è stato quello di valutare il sistema coagulativo attraverso lo studio della via estrinseca e di quella intrinseca dell’orso bruno marsicano (Ursus arctos marsicanus) del quale non sono presenti dati in letteratura. Tale specie è attualmente classificata dall'IUCN come «critico», ovvero a rischio estremamente alto di estinzione in natura. Materiali e metodi: Il primo esemplare utilizzato per lo screening emocoagulativo è stato un esemplare femmina del peso di 150 Kg. Il prelievo, eseguito in primavera nel Parco Faunistico d’Abruzzo di Castel di Sangro, Località Brionna, è stato effettuato, dopo narcosi, con accesso venoso giugulare in provette vacutainer contenenti rispettivamente EDTA, litio eparina e sodio-citrato. L’EDTA si è rivelato un anticoagulante non efficace in tale specie. Dal campione eparinizzato è stato effettuato l’emocromo e uno screening ematochimico completo dello studio della funzionalità epatica. Dal campione citratato è stato ottenuto, previa centrifugazione, il plasma usato per la determinazione dell’assetto coagulativo mediante metodi, sia automatizzati (Coagulometro Advance IL con reagenti refrigerati e temperatura di lavoro e incubazione a 37°C) sia manuali, in BM a 37° C. Attraverso i tests PT (tempo di protrombina) e aPTT (tempo di protrombina parziale attivata); misura della concentrazione di fibrinogeno sec. la metodica funzionale di Clauss (aggiunta di eccesso di Trombina). Il plasma dopo centrifugazione presentava una tenue intensità cromogena. Risultati: Dalle analisi effettuate l’esemplare è risultato in stato di buona salute. La valutazione del test del PT, in toto, come ci si aspettava dalla debole intensità cromogena, non ha dato risultati. Il tempo di protrombina è stato quindi effettuato allungando i tempi di incubazione e applicando la tecnica del Mix con uguali quantità di Plasma umano normale. I risultati ottenuti dopo correzione mostrano un INR normale e inferiore a 1. L’aPTT è invece fallito anche in tempi estesi. Per contro i valori del fibrinogeno riscontrati si sono rivelati molto più alti rispetto a quelli medi dell’uomo. Conclusioni: Da questi risultati sembrerebbe che l’Orso Marsicano mostri una deficienza fattoriale FXII, FXI, FIX, FVIII, Callicreina, Chininogeno ad alto peso Molecolare (HMWK) responsabili a cascata dell’attivazione della via intrinseca. Sono in corso analisi su altri esemplari.

Physiological processes, as aerobic metabolism and inflammatory response, generate reactive oxygen species (ROS) that may induce cellular injury when their amount is increased and antioxidant defense mechanisms are overwhelmed. Also, ROS are generated following UV skin irradiation able to deplete the natural antioxidant defenses in the skin. The increase in exposure to UV may lead to photoaging and precancerous skin lesions (actinic keratosis). New antioxidant strategies in the prevention and therapy of skin lesions are urgently needed. In this study, we evaluated the antioxidant efficacy of a recombinant form of human manganese superoxide dismutase able to inhibit reactive oxygen species pro- duction in some patients affected by severe photoaging and actinic keratosis

A 24-amino acid leader peptide of a new human recombinant manganese superoxide dismutase can enter cells and carry molecules. Here, we demonstrated that six of the 24 amino acids penetrate cells through a particular gate represented by a specific amino acid sequence of the oestrogen receptor (ER). We analysed the internalization of the synthetic hexapeptide and the cytotoxic activity of the hexapeptide conjugated to cisplatin on a cell line panel. In most cell lines, the hexapeptide delivered an amount of cisplatin that was 2 to 8 times greater than that released by cisplatin when the drug was used alone. This increased delivery increases the therapeutic index of cisplatin and reduces side effects caused by a high dosage or long-term treatment times. We may consider this hexapeptide a new molecular carrier to deliver molecules with therapeutic activity into ER+ cells for diagnostic purposes and clinical or immune therapy.

Background/Objectives: An isoform of Manganese-superoxide-dismutase (rMnSOD) was isolated and sequenced for the first time from a human Liposarcoma cells and obtained in recombinant form. The protein showed a specific and selective cytotoxicity on many cancer cell lines. rMnSOD enters cells by means of its 24-aa leader peptide that linked to the oestrogen receptor (ER). A 6-aa sequence, that participates in ER binding, was identified as a molecular carrier by mass spectrometric analysis. The aim of this study was to test the ability of this molecule to inhibit the growth of SUP-B15 cell line and leukemic B-cells and kill them alone and as enhancer of chemotherapic drug. Design/Methods: SUP-B15 cell line and leukemic B cells were cultured in RPMI medium and treated for 5 hours with rMnSOD and Daunoblastine, single and in combination. Cell viability assay was analyzed by MUSE analyzer (Millipore). Apoptotic cell death and cell cycle were analyzed by Annexin-V-FITC staining and PI fluorescence.We analyzed ER expression levels by Real time PCR. Results: A high level of ER was observed in SUP-B15. Our preliminary data showed that in SUP-B15 cell line rMnSOD induced apoptosis with a reduction of vitality from 61.9% to 31.40% respect to untreated. Treatment with rMnSOD of leukemic cell samples showed in all apoptotic profiles an increase in late apoptosis up to 52%. Better apoptotic induction was observed in prednisone poor responders. Cell cycle analysis showed an arrest in Go/G1 after treatment. Conclusion: rMnSOD is a promising molecule for the treatment of paediatric B-ALL due to its selective action to cancer cells and to its enhancer action which leads to reduction of drug dose and significantly reducing side effects. Targeted delivery can increase the therapeutic index of conventional chemotherapy, with low doses to kill cancer cells.