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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 La degradación del aminoácido esencial L-Triptófano (Trp) se inicia con la actividad de la enzima indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO) y se continúa con la vía de la quinurenina (KP). IDO es altamente expresada en la placenta humana. La depleción local de L-Trp y/o la presencia de metabolitos de la KP, participan en inmunoregulación y pueden ejercer funciones antimicrobianas contra patógenos intracelulares. Se ha descrito que esta vía participa en el control de la replicación de T. cruzi, sin embargo, no ha sido estudiada en el tejido placentario humano infectado por este parásito. En esta tesis nos propusimos analizar la participación de la vía catabólica del L-Trp en la infección de la placenta humana con el agente causal de la transmisión congénita del Chagas. Para ello se utilizó un modelo experimental de infección en explantos de placenta humana a término in vitro y la expresión de proteínas de la vía de la Kyn en placentas a término provenientes de mujeres con enfermedad de Chagas (PEC), como estudio in vivo. Los explantos de vellosidades coriónicas fueron cultivados con 105 tripomastigotes de T. cruzi o sin parásitos (control) en diferentes tiempos de cultivo. Para cada ensayo, se emplearon no menos de 3 placentas distintas. En total se emplearon n = 20 placentas para los ensayos in vitro. A fin de inhibir o estimular la actividad de IDO se utilizaron diferentes compuestos como L-1-Metil-triptófano (L-1MT), Interferón-ɣ (IFN-ɣ) y Trp exógeno. También empleamos metabolitos de la KP como 3-hidroxiquinurenina (3-HK) y ácido 3-hidro antranílico (3-HAA). Se valoraron: Trp por HPLC, producción de Kyn, actividad específica de IDO y carga parasitaria (qPCR) en el explanto después de los diferentes tratamientos. Se utilizó inmunohistoquímica (IHQ) para la determinación de la expresión de proteínas IDO, AhR e IFN-ɣ. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA o prueba “t” de student, utilizando el software GraphPad Prism 7.0. Para evaluar la infección de los explantos se empleó un modelo lineal generalizado para cada una de las variables. Los valores de p < 0.05 fueron considerados significativos. En el transcurso de esta tesis se demostró que a ningún tiempo de cultivo se observarón diferencias significativas tanto en la actividad de IDO como en la expresión relativa de esta enzima entre explantos infectados con respecto a los no infectados. Los niveles de Kyn no se modificaron en explantos infectados respecto al no infectado, sin embargo, las concentraciones de Kyn en explantos infectados se incrementaron significativamente a partir de las 24 h de cultivo. En explantos no infectados se observó 2 un aumento de niveles de Kyn con el tratamiento de IFN-ɣ. La expresión relativa de AhR no se modificó en explantos infectados respecto a no infectados. A los fines de determinar la participación de la actividad de IDO en el control de la infección con este parásito, los explantos placentarios fueron tratados con L-1MT (principal inhibidor específico de la actividad de IDO). En esta tesis demostramos que la inhibición de la actividad de IDO incrementa la carga parasitaria en explantos placentarios, lo que se asoció a una menor concentración de Kyn en el sobrenadante de cultivo. Por otro lado, el tratamiento con IFN-ɣ indujo la actividad de IDO e incrementó las concentraciones de Kyn. El tratamiento con IFN-ɣ en explantos infectados no modificó la carga parasitaria en relación con explanto sin tratamiento, este dato sugiere que las concentraciones basales de IDO encontradas en los explantos placentarios son suficientes para limitar la infección in vitro. Posteriormente se demostró que el agregado de L-Trp exógeno al medio de cultivo aumentó la actividad de la enzima, los niveles de Kyn y colaboró en el control de la replicación parasitaria. Por otro lado, se demostró que los metabolitos de la KP (3-HK y 3-HAA) disminuyeron significativamente la carga parasitaria en los explantos placentarios, sin embargo, solamente 3-HK disminuyó el número de tripomastigotes móviles. Estos datos sugieren que los metabolitos conocidos en conjunto Kyns, podrían estar controlando la replicación del T. cruzi en la placenta. Por último, en PEC a término se observó disminución de la expresión de IDO, AhR e IFN-ɣ mostrando que la vía de la Kyn se modifica en las placentas chagásicas y sugiriendo que podría participar en la infección del tejido placentario por T. cruzi. La disminución de IDO podría tener un efecto semejante al observado en nuestros explantos placentarios tratados con inhibidor de IDO (L-1MT) lo que podría favorecer la infección con T. cruzi en el tejido placentario. Por lo que los resultados obtenidos en esta tesis tanto in vitro como in vivo nos podrían ayudar a comprender mejor cómo la placenta estaría controlando la infección por T. cruzi a través de la vía catabolitca del L-Trp por la generación de metabolistos y de esta manera, colaborar en la prevención de la transmisión congénita de Chagas. 3 Palabras claves: Trypanosoma cruzi, placenta humana, Triptófano, Indoleamina 2,3-dioxigenasa, quinureninas, 3-HK, 3-HAA 2022

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019 La regulación temporal de procesos celulares en una escala de 24 h probablemente haya surgido como una respuesta adaptativa a los ciclos día/noche y contribuido a la evolución de osciladores circadianos en diversos organismos, desde cianobacterias unicelulares fotosintéticas hasta animales heterótrofos multicelulares. Los ritmos circadianos (del latín, circa cercano, diem día) regulan numerosos procesos fisiológicos, incluyendo ciclos de sueño/vigilia, comportamiento y actividad locomotora, ciclos de temperatura corporal, funciones inmunes, metabólicas y del sistema endocrino y procesos cardiovasculares y digestivos. En consecuencia, los estilos de vida moderna (incremento de la luz en la noche, trabajos rotativos, jet lag, etc.) que alteran el equilibrio entre el sistema circadiano y el ambiente han sido asociados con un incremento en el riesgo de cáncer, desordenes metabólicos y enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares. Durante el trabajo de esta tesis nos planteamos estudiar la regulación temporal del metabolismo en células tumorales T98G provenientes de glioblastoma humano y la implicancia del sistema circadiano en la respuesta a drogas antitumorales. Los resultados evidenciaron oscilaciones metabólicas en el contenido endógeno de glicerofosfolípidos (GFLs) y actividad in vitro de la enzima fosfatidato fosfohidrolasa como también en el estado redox de las células T98G. A su vez, estas células exhibieron una respuesta diferencial en el tiempo al ser tratadas con el quimioterapéutico Bortezomib (inhibidor del proteosoma) con mayor susceptibilidad en una ventana temporal entre las 12 y 24 h luego de la sincronización con dexametasona. Luego de alterar la expresión del activador molecular Bmal1 mediante la tecnología CRISPR/Cas9, observamos una fuerte interacción entre el oscilador metabólico/redox y la maquinaria circadiana transcripcional, dado que los ciclos redox fueron sustancialmente alterados y la respuesta temporal a la susceptibilidad al Bortezomib mostró un adelanto de fase de 6 h respecto a las células T98G control. Por otro lado, la modulación farmacológica del reloj circadiano a través de agonistas sintéticos (SR9009) de los genes reloj represores REV-ERBs evidenció efectos antiproliferativos en células T98G alterando la progresión del ciclo celular y la acumulación de lípidos en células tumorales. Por último, evaluamos la velocidad de crecimiento de tumores provenientes de células A530 derivadas del sistema nervioso periférico o B16 de melanoma murino inyectadas en ratones C57BL/6 bajos distintas condiciones experimentales. Estos resultados evidenciaron una mayor tasa de crecimiento tumoral en aquellos ratones inyectados al comienzo de la noche respecto a los animales inyectados al comienzo del día que provenían de ciclos regulares de luz: oscuridad (LO). Resultados similares fueron observados cuando los animales fueron mantenidos en oscuridad constante (OO) luego de la sincronización a un ciclo regular de LO e inyectados al comienzo del día o noche subjetiva. Página | 2 Otra serie de experimentos evidenciaron una mayor tasa de crecimiento en los tumores provenientes de células A530 que tenían disminuida la expresión de Bmal1 respecto a las células control. En conjunto, los resultados de esta tesis sugieren una fuerte interacción entre el oscilador metabólico/redox y la maquinaria transcripcional, como así también una regulación temporal por parte del reloj circadiano sobre el crecimiento tumoral. 2021-12-31 Wagner, Paula Micaela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Guido, Mario Eduardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Pellizas, Claudia Gabriela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Pasquini, Juana Maria. Universidad Nacional de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Química y Fisicoquímica Biológicas; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016 La cromatina de eucariotas está compuesta por regiones compactas (heterocromáticas) y relajadas (eucromáticas). En la planta modelo Arabidopsis, las regiones compactas están comprendidas principalmente en los centrómeros, en donde se concentran la mayoría de los transposones (TEs) del genoma. Estas regiones están enriquecidas en marcas epigenéticas represoras tales como las derivadas de la metilación del DNA (5mC) e histonas (H3K9me2). Estas estructuras son dinámicas, y se modifican frente a la infección con Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst), condición que produce la relajación de la cromatina centromérica y la pérdida de 5mC. Otros estreses bióticos y abióticos desencadenan respuestas similares sobre estas regiones genómicas, pero curiosamente aún no existen estudios que evalúen si la decondensación y demetilación de los centrómeros afecta a la resistencia a los diferentes estrés. En esta Tesis Doctoral abordamos esta incógnita realizando distintos tipos de estudios en plantas de Arabidopsis infectadas con Pst. Como una primera aproximación, analizamos de qué manera la falta de proteínas que regulan la estructura de la cromatina centromérica (mutantes de metilación del DNA e histonas, y de remodelación de cromatina) afecta a la decondensación de cromocentros (CCs) y resistencia a Pst. Los resultados mostraron que todas las mutantes analizadas son más resistentes al patógeno. Posteriormente seleccionamos a la mutante mom1-5 para estudiar en ella el proceso de activación de defensas. Demostramos que esta mutante manifiesta predisposición a la activación de las defensas (“priming”) involucrando un mecanismo que operaría en trans. Evaluamos el comportamiento de las secuencias blanco de MOM1 y otros blancos centroméricos en plantas salvajes infectadas y encontramos que la decondensación de la cromatina centromérica se asocia a la activación y posterior represión de TEs y transgenes allí codificados, requiriendo componentes del silenciamiento génico transcripcional mediado por RNAs pequeños (smRNAs). En paralelo, detectamos un grupo de genes R (genes que codifican a proteínas de resistencia a patógenos) que en plantas salvajes infectadas poseen smRNAs homólogos que no inducirían su silenciamiento. Por el contrario, el silenciamiento sería re-direccionado hacia otras secuencias también homólogas a estos mismos smRNAs pero más abundantes (TEs centroméricos) liberando los minoritarios (R) y permitiendo su expresión. A partir de los resultados obtenidos, proponemos un mecanismo que operaría en trans, por el cual la activación transcripcional de TEs centroméricos podría afectar a la transcripción de genes R en plantas salvajes infectadas. Fil: Cambiagno, Damián Alejandro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Fil: Alvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Barra, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Barra, José Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Rodríguez Galán, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Rodríguez Galán, María Cecilia.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Palatnik, Javier Eduardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016 La recombinación homóloga es un proceso esencial en el metabolismo celular de todos los organismos que permite la reorganización de genes dentro y entre cromosomas, provee una de las mayores vías de reparación de rupturas de ADN doble cadena y asegura la segregación correcta de los cromosomas en la meiosis eucariota. Fil: Borgogno, María Victoria. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Argaraña, Carlos Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Alvarez, María Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Echenique, José Ricardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Echenique, José Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Spampinato, Claudia Patricia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Bioquímica y Farmacia; Argentina. Fil: Spampinato, Claudia Patricia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016 Este trabajo de tesis tiene como objetivo contribuir al conocimiento de las bases neurobiológicas de los efectos de Gr a nivel del sistema nervioso central, particularmente en hipocampo, investigando el/los posibles mecanismos implicados en la modulación de la retención de la memoria. Estudios previos en nuestro laboratorio, han demostrado que Gr incrementa la retención de la memoria y la ingesta de alimentos cuando se administra localmente en esta estructura. Además, los efectos de Gr sobre la memoria se correlacionan con parámetros tales como el incremento en la actividad de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), con la disponibilidad del neurotransmisor serotonina (5-HT) y con la disminución del umbral para generar potenciación a largo plazo (LTP). Los experimentos de esta tesis incluyen el estudio de los posibles mediadores de la cadena bioquímica de la memoria modulados por Gr, como así también, la participación de neurotransmisores en los efectos del péptido, utilizando paradigmas conductuales, determinaciones bioquímicas y electrofisiológicas, bloqueo farmacológico de receptores y técnicas inmunohistoquímicas, a fin de definir el papel funcional de Gr sobre la memoria. Más específicamente, estudiamos si los efectos de la administración intrahipocampal de Gr sobre la memoria, dependen de la activación de su receptor específico GHS-R1a, de modificaciones en la liberación de glutamato y/o de la expresión de sus receptores, con particular atención en la subunidad NR2B del receptor NMDA. Analizamos también, si Gr modifica la liberación del neurotransmisor 5-HT y si ello se correlaciona con el incremento en la retención de la memoria. Los resultados mostraron que Gr facilita la consolidación de la memoria evaluada en una prueba de evitación inhibitoria (SDT), ejerciendo sus efectos en una ventana temporal determinada, es decir, sólo cuando es infundida inmediatamente y no a los 15 o 60 min después del entrenamiento. Se demostró también, que los efectos de Gr sobre el comportamiento y los parámetros electrofisiológicos desaparecen cuando se infunde en hipocampo un antagonista selectivo del receptor de Gr, D-Lys3-GHRP-6, previo a la infusión del péptido, indicando que los efectos observados son mediados por la activación directa del receptor de Gr (GHS-R1a) en esta estructura. En lo que a liberación de glutamato se refiere, la administración de Gr incrementa la liberación evocada de glutamato a partir de sinaptosomas hipocampales, de una manera dependiente de la dosis. En cuanto al efecto de la administración intrahipocampal de Gr sobre la expresión de la subunidad NR2B del RNMDA, el péptido incrementa el número de células inmunorreactivas-NR2B en las áreas hipocampales CA1 y DG. Con el fin de agregar información funcional sobre la participación de la subunidad NR2B del RNMDA en los efectos de Gr, se estudiaron los efectos comportamentales y electrofisiológicos del péptido en animales previamente infundidos con el antagonista específico de la subunidad NR2B, Ro 25-6981. Cuando Gr se infundió en estos animales, que presentan un deterioro en la retención de la memoria, los valores obtenidos para el tiempo de latencia alcanzan valores similares a los del grupo control, sugiriendo que Gr es capaz de revertir el efecto deletéreo del antagonista sobre la retención de la memoria. Con respecto a los parámetros electrofisiológicos, cuando Gr se infundió en animales pretratados con Ro 25-6981, en los cuales no puede generarse LTP, los valores de umbral para inducir este fenómeno aumentaron en comparación con el grupo Gr, pero fueron significativamente más bajos que los del grupo salina. Resultados previos en el laboratorio, sugirieron que los efectos de Gr dependerían de la disponibilidad de 5-HT. En consecuencia valoramos la liberación de 5-HT a partir de rebanadas de hipocampo, demostrándose que Gr inhibe la liberación de [3H]5-HT. Esta disminución en la liberación de 5-HT se correlaciona con un mayor tiempo de latencia en el SDT (indicativo de retención de la memoria). En conclusión, estos resultados refuerzan la hipótesis de que Gr podría modular los primeros eventos de la consolidación de la memoria en hipocampo, probablemente mediante el aumento de los niveles de [Ca+2]i inducido por la activación de sus receptores GHS-R1a, el incremento en la liberación de glutamato, la activación de los RNMDA con un aumento de la expresión de la subunidad NR2B, estimulando de esta manera diferentes vías moleculares que contribuyen a la facilitación en la retención de la memoria y a la inducción de LTP. Ghersi, Marisa Soledad. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Pérez, Mariela Fernanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Hallak, Marta Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Molina, Juan Carlos. Universidad Nacional de Córdoba. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC); Argentina. Perelló, Mario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Celular; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015 Durante la realización de la presente tesis doctoral se estableció un modelo terapéutico preclínico de administración intratumoral (i.t.) de polyadenylic–polyuridylic acid (poli A:U) desnudo, un análogo sintético de ARN doble cadena viral que es reconocido sólo por TLR3 y no por otros receptores citosólicos. Se demostró que el tratamiento terapéutico con poli A:U inhibe el crecimiento tumoral y aumenta la sobrevida en los ratones portadores de tumores de melanoma murino B16 tratados. Asimismo, se demostró que dicho tratamiento puede ser empleado con éxito en similares esquemas terapéuticos en distintos modelos murinos, tanto en el background genético C57BL/6 como en el BALB/c, aportando bases para una terapia alternativa antitumoral. También se estudió la contribución particular que las células del sistema inmune ejercen en nuestro modelo preclínico. Empleando ratones nude e IL-12 p40-/-, se demostró que tanto las células T (y/o NKT) así como la subunidad IL-12p40 (compartida por IL-12 e IL-23) participan en el control del crecimiento tumoral y la sobrevida en los ratones portadores de tumores B16 tratados. Cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado inmunológico en tumores de ratones tratados con poli A:U, se encontró un mayor infiltrado de células CD45+, de células dendríticas maduras CD11c+ (CD40+CD86+) productoras de IL-12 y de LiT CD8+, modificándose la relación CD4/CD8 en tumor. Empleando ratones reporteros Foxp3-GFP, se encontró que el tratamiento con poli A:U disminuye el número de células T reguladoras (Treg) en tumor y el porcentaje de células que expresan el marcador LAP, asociado a la producción de TGF-β. Además, se estudió la respuesta antitumoral antígeno específica empleando el modelo preclínico en ratones portadores de tumores B16 que expresan de forma estable ovalbúmina (OVA), mediante la transferencia adoptiva de células T CD4+ y CD8+ provenientes de ratones transgénicos OTI y OTII (que expresan TCR específicos para péptidos de OVA expresados en el contexto del CMH clase I y II respectivamente). Se evidenció que el tratamiento i.t. con poli A:U promueve el reclutamiento y la proliferación de LiT CD8+ antígeno específicos en ganglio drenante y favorece un perfil de respuesta Th1 antígeno específica en tumor. Por otra parte, mediante el empleo de nuestro modelo preclínico en ratones deficientes en el receptor de IFN-I (IFNAR1-/-) se demostró que se requiere la señalización de IFN-I sobre las células huésped para observar la inhibición del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida generada por el tratamiento con poli A:U. Además, cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado leucocitario en tumor en ratones IFNAR1-/-, todas esas diferencias halladas entre los tratamientos en ratones wt se pierden. Para demostrar que el tratamiento con poli A:U induce la producción endógena de IFN-β, se emplearon ratones reporteros que expresan el gen de luciferasa en lugar de la secuencia codificante de IFN-β. El estudio de la cinética de la inducción de IFN-β in vivo demostró que el tratamiento i.t. con poli A:U desnudo es capáz de inducir un pico de dicha citocina luego de 6 h y que este se produce a lo largo de sucesivas dosis. Empleando cepas de ratones reporteros de IFN-β específicos para distintos linajes como células mieloides, dendríticas, LiT y B (LysM+/loxβLuc, CD11c+/loxβLuc, CD4+/loxβLuc y CD19+/loxβLuc respectivamente), se demostró que luego del tratamiento con poli A:U las células de origen mieloide son responsables de producir la totalidad de IFN-β en el microambiente tumoral y que las células CD11c+ también contribuyen en gran parte con dicha inducción. Además, se reprodujo el modelo preclínico en ratones reporteros de IFN-β deficientes en UNC93B1 (molécula involucrada en el tráfico de TLR endosomales) y en IRF3, 5 o 7 (factores de transcripción clave en las vías de señalización de TLR). De esta manera, se demostró que la producción de IFN-β en nuestro modelo preclínico, es dependiente de IRF3 y UNC93B1 pero no de IRF7 e IRF5, confirmando que poli A:U es ligando TLR3 y contribuyendo también con algunos aspectos importantes de su señalización in vivo. Por último, se evaluó el empleo de poli A:U en combinación con un quimioterapéutico convencional como doxorrubicina, con el fin de disminuir su dosis, manteniendo la eficacia del tratamiento y disminuyendo sus efectos adversos. Para ello, se empleó doxorubicina en altas y bajas dosis i.v. en ratones portadores de tumores B16 y se mantuvieron las condiciones y el esquema experimental de administración de poli A:U. La terapia combinada poli A:U y doxorubicina bajas dosis demostró tener un efecto sinérgico favorable, respecto a los demás tratamientos empleados, para el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados, reduciendo además los efectos tóxicos secundarios de doxorubicina evaluados mediante niveles ezimáticos y parámetros bioquímicos. La presente tesis revela el rol crucial de la inducción endógena de IFN-β, luego de la administración i.t. de poli A:U, en la modificación del tipo de infiltrado, funcionalidad de células del sistema inmune y en la respuesta inmune antitumoral que promueve el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados Fil: Nocera, David Andrés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Maccioni, Mariana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maccioni, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Degano, Alicia Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Degano, Alicia Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Schillaci, Roxana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014 El presente trabajo de Tesis Doctoral consiste en el desarrollo de diversos dispositivos poliméricos para liberación controlada de feromonas a partir del uso de polímeros de orígenes naturales y biodegradables como el quitosano y el alginato. El diseño de estos dispositivos estuvo enfocado hacia la obtención de cinéticas de liberación adecuadas de los tres compuestos que integran el blend feromonal de un insecto de importancia económica y forestal llamado Megaplatypus mutatus. Los compuestos son sulcatol, sulcatona y 3-pentanol y su uso en el control de esta plaga es una técnica novedosa de escasos antecedentes en el país. Los dispositivos poliméricos planteados tenían como requisitos: ser biodegradables para evitar tener que recolectarlos una vez concluido el control de la plaga, tener una alta proporción de compuesto incorporado, así como una baja concentración residual, liberar los compuestos de interés de manera lenta y sostenida, y ser de rápida aplicación y de bajo costo de elaboración. La secuencia de dispositivos desarrollados fue avanzando y modificándose según los resultados así lo demostraban y requerían, adquiriendo de estos resultados el criterio para fundamentar la preparación de un nuevo dispositivo. Para tal fin, se estudió la conveniencia del uso de una vía seca ó de una vía húmeda. Para el primer caso se prepararon películas y para el segundo caso, se prepararon geles y esferas de quitosano y alginato simples y combinadas. Las películas fueron generadas a partir del entrecruzamiento de quitosano con genipina y a partir de alginato. Se realizaron por el método de evaporación del solvente. En el caso de la película de quitosano se pudo demostrar cualitativamente que este dispositivo incorporó el sulcatol y que lo liberó gradualmente por un período de 13 días. En el caso de la película de alginato, la misma no resultó estable y resultaron materiales muy flexibles con una muy baja estabilidad de forma. En cuanto a los geles, su forma de síntesis supone una clara ventaja en cuanto a la incorporación de un compuesto de interés, ya que al ser un proceso sencillo, que no posee medios o pasos intermedios de reacción, no supone la pérdida del compuesto en etapas intermedias. La preparación de estos dispositivos permitió regular la velocidad de difusión y la de liberación, aumentando en el tiempo. En cuanto al comportamiento de incorporación/liberación de STOL, los dos polímeros utilizados mostraron diferencias importantes; mientras que el quitosano mantuvo una liberación controlada por una cantidad considerable de días con un bajo porcentaje de retención de la droga, el alginato lo hizo por un período de tiempo muy reducido. Así, con el fin de aumentar la superficie expuesta al ambiente y de obtener dispositivos más fáciles de transportar y de ubicar en forestaciones, se condujo la experimentación hacia el desarrollo de esferas. Las esferas poseen una alta relación volumen/superficie, lo cual es muy beneficioso para la preparación de dispositivos de liberación controlada y prolongada en el tiempo. El tercer tipo de dispositivos preparados fue el de esferas simples de alginato y de quitosano. Ambos materiales fueron sintetizados por coacervación simple. El quitosano mostró buena capacidad de formación de esferas y buena incorporación de los compuestos orgánicos evaluados. Sin embargo este polímero se comportó como un agente de retención excesivo ya que el único compuesto posible de cuantificar fue el Beta-Caroteno.Por otro lado, las esferas de alginato mantienen la forma esférica adecuada e incorporan un alto porcentaje de los compuestos de interés. Sin embargo poseen también ciertas debilidades, tales como la salida demasiado rápida del compuesto incorporado, ya sea durante el lavado de las esferas o por sus propiedades de retención intrínsecas. Estas debilidades debieron ser superadas desde la preparación de las mismas, sumando compuestos que recubren la esfera y que colaboren a disminuir la porosidad del mismo. En este sentido, la carga negativa del alginato otorgada por sus grupos COO- le confiere posibilidad de interacción con otros polímeros de carga opuesta y de esta manera amplia posibilidades de mejorar las condiciones desfavorables detectadas. Así, la experimentación de la presente tesis doctoral se condujo al desarrollo de esferas combinadas. En este sentido, y ya en la segunda etapa de experimentación del presente trabajo, se realizaron esferas combinadas sintetizadas con las dos opciones alternadas de ubicación de los polímeros, es decir se sintetizaron esferas con un corazón de quitosano y una cubierta de alginato y esferas con un corazón de alginato y una cubierta de quitosano. Las de corazón de quitosano fueron realizadas por el método de coacervación compleja, en el cual a partir del contacto entre ambos polímeros se produce la unión de los grupos carboxílicos del alginato y los grupos amino del quitosano. Si bien los estudios de caracterización por FT-IR y microscópicos revelaron la presencia de ambos polímeros en los dispositivos, las esferas presentaron pobres propiedades mecánicas, adjudicadas principalmente a la baja eficiencia de las interacciones, electrostáticas o covalentes. Este tipo de interacciones no pudieron dar origen a un retículo estable, por lo que la experimentación se condujo hacia el otro tipo de esferas combinadas, las de corazón de alginato y cubierta de quitosano. Estas esferas fueron ampliamente caracterizadas por medio de estudios de FT-IR, DSC, SEM y fotografías ópticas. Para el estudio de sus propiedades se modificaron diversas variables de síntesis en pos de conocer el efecto sobre el hinchamiento y sus propiedades mecánicas; ya que ambas características se encuentran totalmente relacionadas con el grado de entrecruzamiento de las esferas y por ende con la capacidad y tiempo de liberación de compuestos incorporados en ellas. Las variables que más influyeron en el comportamiento final de los dispositivos fueron el pH de la solución gelificante y la relación molar Ca2+/COO-. Estos dos parámetros afectan por un lado el grado de ionización de los grupos COO- del alginato y por otro lado, el porcentaje de Calcio disponible para conformar la estructura “caja de huevo” característica de esta interacción. A partir de estos estudios de las propiedades y de los estudios de liberación de BC, STOL, STONA y 3-PEN se pudieron definir las condiciones de preparación consideradas óptimas para los ensayos biocomportamentales de atracción que seguían a esta sección experimental. Así las condiciones de concentración de alginato de 4% p/v, el pH y la relación molar Ca2+/COO- de la solución gelificante de 9 y 3,5 respectivamente y un tiempo de curado de 10 minutos fueron las utilizadas para preparar las esferas con las que se comprobó la efectividad de atracción con el insecto en cuestión. En la última sección de esta tesis doctoral, se realizaron ensayos de atractancia de los insectos hacia los dispositivos por medio del uso de un olfatómetro. Los resultados obtenidos sugieren que los dispositivos elegidos como liberadores de feromonas se comportaron de manera adecuada para provocar el efecto de atracción de hembras de Megaplatypus mutatus Valladares, Gabriela A. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Strumia, Miriam Cristina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica; Argentina. Strumia, Miriam Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación y Desarrollo en Ingeniería de Procesos; Argentina. González Audino, Paola Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Unidad de Investigación y Desarrollo Estratégico para la Defensa; Argentina. Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Rossi, Roberto Arturo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica; Argentina. Aranguren, Mirta Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales; Argentina. Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.