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Orientadores: Lea Rodrigues Simioni, Yoko Oshima Franco Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O veneno de Bothrops jararacussu (Bjssu) e sua miotoxina bothropstoxina-I (BthTX-I), induzem neurotoxicidade e miotoxicidade. Como o tratamento com o antiveneno é pouco eficaz contra a miotoxicidade, muitos estudos têm sido realizados utilizando substâncias que neutralizem a atividade miotóxica induzida pelo veneno, entre elas, a heparina. Os objetivos deste trabalho foram: 1) verificar o efeito da heparina sobre a miotoxicidade induzida pelo veneno e toxina, utilizando-se uma baixa concentração de heparina, porém capaz de impedir o bloqueio neuromuscular e, 2) esclarecer o papel protetor da heparina contra Bjssu. Controles foram realizados com antiveneno botrópico (AVB) comercial ou solução nutritiva de Tyrode ou salina. Para avaliar a neurotoxicidade empregou-se técnica miográfica convencional em preparações nervo frênico-diafragma de camundongos (in vitro) e nervo ciático poplíteo externo-tibial anterior de ratos (in vivo); para avaliar a miotoxicidade in vitro empregou-se a técnica histológica (microscopia óptica) e in vivo a dosagem bioquímica da creatinoquinase (CK); para avaliar o papel protetor da heparina empregou-se a protamina, um antagonista farmacológico. Os resultados obtidos in vitro mostraram que a resposta contrátil de 12 ± 2% (n=6) frente à incubação com Bjssu (40 µg/mL) por 120 min foi aumentada para 79,6 ± 5,9% (n=6) quando pré-incubado com heparina (5 UI/mL) e 68,3 ± 6,2% (n=6) quando pré-incubado com AVB (120 µL/mL); na mesma situação a BthTX-I (2,9 µM) passou de 5 ± 1,3% (n=8) para 78,8 ± 6,8% (n=8) com heparina e 62,3 ± 6,1% (n=6) com AVB. A média da quantificação do dano morfológico (leitura de três diferentes observadores) mostrou que o veneno provocou lesões de 27% e a toxina de 40%, que passaram para níveis de 5% e 9%, respectivamente, quando tratadas com heparina e 11% e 3% quando com AVB. Os pré-tratamentos não apresentaram diferença significativa em relação ao controle Tyrode. Os resultados in vivo (em ratos) mostraram que as mesmas concentrações de veneno e toxina utilizadas nos ensaios in vitro não provocaram alterações na resposta contrátil; contudo, quando injetados no músculo gastrocnêmio de camundongos, apresentaram níveis plasmáticos de CK (U/L) de: 1454 ± 185 (Bjssu, n=6) diminuindo (P

Orientador: Léa Rodrigues Simioni Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Rhinella schneideri, conhecido previamente como Bufo paracnemis, é um sapo comum em muitas regiões do Brasil. O veneno destas espécies exerce importante efeito cardiovascular em humanos e animais, mas pouco se sabe sobre sua atividade neuromuscular. Neste trabalho, nós avaliamos a neurotoxicidade do veneno de R. schneideri em preparações neuromusculares de pintainho e camundongo. Através da compressão manual das glândulas parótidas localizadas atrás dos olhos, coletou-se a secreção e então realizada a extração com metanol. O extrato metanólico foi liofilizado e testado em preparações biológicas. Preparações biventer cervicis (BC) de pintainho e nervo frênico diafragma (NFD) de camundongo foram utilizadas para o registro miográfico através de estimulação elétrica indireta para medidas eletrofisiológicas, análise morfológica e microscopia eletrônica de transmissão. Frações ativas do extrato metanólico foram obtidas submetendo-se à coluna de fase reversa Luna PFP (250 x 4,6 mm). O extrato metanólico (50 ?g/ml) causou somente facilitação da neurotransmissão em preparações NFD. Ao contrário, causou bloqueio neuromuscular significativo em preparações BC que foram concentração-dependente (3, 10 and 30 ?g/ml; a 37º C) com tempo para 50% de bloqueio, média ± erro padrão: 84±10, 51±3 e 12±0,8 min com 3, 10 e 30 ?g/ml, respectivamente; n=6-8 cada, precedido por facilitação da neurotransmissão. Não houve inibição significativa das respostas contraturantes à ACh (110 ?M) ou KCl (20 mM) após bloqueio completo em qualquer concentração testada. Em preparações BC incubadas com o extrato metanólico (10 ?g/ml) a 22º C por 70 min não observou-se qualquer alteração das respostas musculares (117±3%; n=5), mas quando a temperatura do banho foi elevada a 37º C, 50% de bloqueio ocorreu após 92±3 min (n=5; p

Rhinella schneideri (or Bufo paracnemis), popularly known in Brazil as cururu toad, is also found in other countries in South America. The cardiovascular effects of this poison are largely known and recently was shown that it is capable to affect the neuromuscular junction on avian and mice isolated preparation. In this work, we used transmission electron microscopy to investigate the ultrastructure of the motor nerve terminal and postsynaptic junctional folds of phrenic nerve-hemidiaphragm preparations incubated for either 5 or 60 min with the methanolic extract of R. schneideri (50 µg/mL). In addition, the status of the acetylcholine receptors (AChR) was examined by TRITC-α-bungarotoxin immunofluorescence location at the endplate membrane. The results show that 5 min of incubation with the gland secretion extract significantly decreased (32 %) the number of synaptic vesicles into the motor nerve terminal, but did not decrease the electron density on the top of the junctional folds where nicotinic receptors are concentrated; however, 60 min of incubation led to significant nerve terminal reloading in synaptic vesicles whereas the AChR immunoreactivity was not as marked as in control and after 5 min incubation. Muscle fibers were well-preserved but intramuscular motor axons were not. The findings corroborated pharmacological data since the decrease in the number of synaptic vesicles (5 min) followed by recovery (60 min) is in accordance with the transient increase of MEPPs frequency meaning increased neurotransmitter release. These data support the predominant presynaptic mode of action of the R. schneideri, but do not exclude the possibility of a secondary postsynaptic action depending on the time the preparation is exposed to poison. Rev. Biol. Trop. 66(3): 1290-1297. Epub 2018 September 01. Resumen Rhinella schneideri (o Bufo paracnemis), conocido popularmente en Brasil como sapo cururu, también se encuentra en otros países de América del Sur. Los efectos cardiovasculares de este veneno son ampliamente conocidos y recientemente se demostró que es capaz de afectar la unión neuromuscular en la preparación aislada de aves y ratones. En este trabajo, utilizamos microscopía electrónica de transmisión para investigar la ultraestructura de la terminación nerviosa motora y pliegues de unión postsináptica de preparaciones de nervio frénico-hemidiafragma incubadas durante 5 o 60 min con el extracto metanólico de R. schneideri (50 μg/mL). Además, se examinó el estado de los receptores de acetilcolina (AChR) mediante la ubicación de inmunofluorescencia de TRITC-α-bungarotoxina en la membrana de la placa terminal. Los resultados muestran que 5 min de incubación con el extracto de secreción de glándula disminuyeron significativamente (32 %) el número de vesículas sinápticas en el terminal del nervio motor, pero no disminuyeron la densidad electrónica en la parte superior de los pliegues de unión donde se concentran los receptores nicotínicos. Sin embargo, 60 min de incubación condujeron a una recarga significativa de los terminales nerviosos en las vesículas sinápticas, mientras que la inmunorreactividad del AChR no fue tan marcada como en el control y después de 5 min de incubación. Las fibras musculares estaban bien conservadas, pero los axones motores intramusculares no. Los hallazgos corroboraron los datos farmacológicos ya que la disminución en el número de vesículas sinápticas (5 min) seguida de recuperación (60 min) está de acuerdo con el aumento transitorio de la frecuencia de MEPPs, lo que significa una mayor liberación de neurotransmisores. Estos datos apoyan el modo de acción presináptico predominante de R. schneideri, pero no excluyen la posibilidad de una acción postsináptica secundaria dependiendo del tiempo en que la preparación esté expuesta al veneno.

The neurotoxicity of a methanolic extract of toad (Rhinella schneideri) poison was examined in chick biventer cervicis preparations. The methanolic extract (1, 3, 10 and 30µg/ml) caused concentration-dependent blockade at the three highest concentrations (time for 50% blockade, mean±SEM: 84±10, 51±3 and 12±0.8min for 3, 10 and 30µg/ml, respectively; n=6-8 each) that was preceded by significant, transient facilitation at 10μg/ml. Contractures to exogenous ACh (110μM) or KCl (20mM) were unaffected by the blockade. In curarized (d-Tc, 1μg/ml) preparations, the extract (10µg/ml) caused complete, irreversible blockade that persisted after extensive washing. The extract did not significantly alter the creatine kinase release or morphology of biventer cervicis muscle. These results indicate that the methanolic extract of R. schneideri poison acts primarily presynaptically to enhance neurotransmitter release in this avian preparation.