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Introdução. As neurofibromatoses tipo 1 (NF1) e tipo 2 (NF2) e a esclerose tuberosa (ET) são as genodermatoses mais comuns, que possuem potencial de desenvolvimento de tumores benignos e malignos. Elas são síndromes hereditárias com padrão de herança autossômico dominante e expressividade altamente variável, causadas, respectivamente, por mutações nos genes supressores tumorais NF1, NF2 e TSC1 ou TSC2, todos com grande número de mutações diferentes descritas em bases de dados, envolvendo rearranjos e mutações de ponto. Objetivos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar, do ponto de vista clínico e molecular, os pacientes e familiares com diagnóstico de NF1 e NF2 avaliados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre e pacientes com diagnóstico de ET avaliados em centros da Rede Nacional de Câncer Familial, além de avaliar a expressão gênica global e os processos celulares em células com mutações em TSC1 e TSC2. Resultados. Foram recrutados 93 pacientes com NF1 e 7 com NF2, no sul do Brasil, e 53 pacientes com ET oriundos de 4 regiões do Brasil. Na análise molecular, a frequência de grandes rearranjos e mutações de ponto foi de 4,3 e 79,0% em NF1; 14,3 e 29,0% em NF2; e 9,0 e 81,0% em TSC1 e TSC2, sendo 33 variantes novas em NF1 e 20 em TSC1 e TSC2. Correlações genótipo-fenótipo específicas para a população brasileira não foram estabelecidas, mas algumas correlações previamente descritas também foram identificadas em nosso estudo. Hotspots para mutações não foram encontrados. Por fim, análise de processos celulares e expressão gênica com células mutadas e normais (com e sem rapamicina) mostrou que não há morte celular e mudança em fases de ciclo celular; entretanto, em pacientes com esclerose tuberosa, a indução de autofagia é muito maior do que em células controles após o tratamento com rapamicina (p=0,039). Discussão e conclusões. Este é o primeiro estudo do Brasil a realizar a caracterização molecular completa de pacientes com neurofibromatoses e esclerose tuberosa. A caracterização das variantes nesses pacientes é muito importante para confirmar o diagnóstico quando a clínica é duvidosa, para o acompanhamento da doença e a possível prevenção das características multissistêmicas. Além disso, foi demonstrado que a autofagia pode ser o mecanismo inicial que leva a formação de tumores em células com mutações em TSC1 ou TSC2. O processo de autofagia precisa ser estudado com mais detalhe a fim de esclarecer o papel desse mecanismo na esclerose tuberosa, e, possivelemente, levar ao uso de terapia de alvo molecular direcionada à via de autofagia, em conjunto com inibidores de mTOR ou sozinha. Introduction. Neurofibromatosis type 1 (NF1) and type 2 (NF2) and tuberous sclerosis (TSC) are the most common genodermatoses, with the potential to develop benign and malignant tumors. These genodermatoses are hereditary syndromes with an autosomal dominant inheritance pattern and highly variable expressivity. They are caused, respectively, by mutations in the tumor suppressor genes NF1, NF2 and TSC1 or TSC2, all with a large number of different mutations described, including rearrangements and point mutations. Objectives. The aim of this study was to perform clinical and molecular characterization of NF1 and NF2 patients and their relatives, evaluated at Hospital de Clínicas of Porto Alegre and patients diagnosed with TSC evaluated in the Familial Cancer National Network. In addition, we aimed to evaluate the global gene expression and cellular processes in cells with mutations in TSC1 and TSC2. Results. Ninety-three NF1 patients and 7 NF2 patients were recruited from south Brazil; 53 TSC patients were recruited from 4 Brazilian regions. In molecular analysis, the frequency of large rearrangements and point mutations was 4.3 and 79.0% in NF1; 14.3 and 29.0% in NF2; and 9.0 and 81.0% in TSC1 and TSC2, with 33 new variants in NF1 and 20 in TSC1 and TSC2. Specific genotype-phenotype correlations in Brazilian population were not established, but some previously described correlations were also identified in our study. Hotspots for mutations were not found. Finally, analysis of cellular processes and gene expression in normal and mutated cells (with and without rapamycin) showed that there is no cell death and change in cell cycle phases; however, in patients with tuberous sclerosis, the induction of autophagy is much greater than in control cells after treatment with rapamycin (p=0.039). Discussion and conclusion. This is the first Brazilian study to perform the complete molecular characterization of patients with neurofibromatoses and tuberous sclerosis. Variant characterization in these patients is very important to confirm diagnosis when the clinic is doubtful, to follow disease progress and possibly prevent the occurrence of multisystemic characteristics. In addition, we showed that autophagy may be the initial mechanism leading to tumor formation in cells with TSC1 or TSC2 mutations. Autophagy needs to be studied in more detail to clarify the role of this mechanism in tuberous sclerosis, and possibly lead to the use of autophagy-targeted molecular therapy, alone or in conjunction with mTOR inhibitors.

A deficiência parcial ou total ou defeitos funcionais no fator VIII (FVIII) resultam na doença hereditária hemofilia A (HA), geralmente causada por mutações heterogêneas no gene do FVIII (F8). Embora mais de 1200 mutações no gene do F8 tenham sido descritas, dados sobre o espectro dessas mutações na população do Sul do Brasil são insuficientes e o estudo das mesmas possibilita uma melhor compreensão da genética molecular da doença nessa população. Além disso, ao estimar o efeito que uma mutação exerce em uma proteína, obtem-se subsídios para uma melhor avaliação de sua função, bem como das interações entre ela e estruturas afins. Os objetivos desse estudo foram identificar as mutações gênicas em pacientes com HA leve ou moderada do Rio Grande do Sul e posterior análise do papel dessas mutações na determinação da doença e presença de inibidores. Um total de 76 pacientes não-relacionados do sexo masculino, com HA leve (n=55) ou moderada (n=21) foram incluídos no estudo. Todos os 26 éxons do F8, as regiões 5’não-traduzida e 3’não-traduzida, as junções éxon-intron e a região promotora foram amplificadas por PCR e analisadas por sequenciamento direto. Foram examinados também 100 cromossomos normais de doadores de banco de sangue para excluir mudanças polimórficas como causadoras da doença. Todas as sequências do F8 dos pacientes foram comparadas com a sequência referência (NCBI: NG_005114.1), utilizando o software CodonCode Aligner implementado no Mega 5.04. As mutações encontradas foram comparadas com as do banco de dados The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) e a conservação dos aminoácidos mutados também foi verificada. A detecção de mutações em sítios de processamento foi realizada pelo programa de predição de sítios de processamento (Berkeley Drosophila Genome Project) e para a análise do efeito das mutações de sentido trocado foram utilizados três preditores: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping), Site Direct Mutator (SDM) e Have yOur Protein Explained (HOPE). A localização das mutações na estrutura do FVIII foi realizada no programa PyMol e para a visualização da superfície eletrostática dos domínios A foi utilizado o programa GRASP2. Quando nenhuma mutação foi encontrada, foi executada a análise de Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Quanto às mutações recorrentes, a análise de haplótipos foi feita a fim de investigar se elas surgiram nessa população através de vários eventos mutacionais distintos ou através de efeito fundador. Foi identificada a mutação causadora da doença em 69 (91%) pacientes, que apresentaram 33 mutações diferentes: 27 de sentido trocado, uma pequena deleção, duas pequenas duplicações e três mudanças em sítios de processamento. Sete mutações de sentido trocado e duas em sítios de processamento não tinham sido previamente descritas no HAMSTeRS e não foram identificadas na literatura. Todas as últimas foram consideradas patogênicas; a mutação p.Val266Met, muito próxima a um sítio de ligação ao cobre, pode diminuir a interação entre os domínios A2 e A3 do FVIII; a mutação p. Met567Lys pode afetar um sítio de ligação ao fator IX; as mutações p.Arg1764Gly, p.Tyr1786Phe e p.Tyr1792Cys podem afetar a ligação ao fator IX e ao Fator von Willebrand. Nove mutações recorrentes foram encontradas, uma delas nunca descrita anteriormente (p.Tyr1786Phe). A análise de haplótipos sugere que essa mutação tenha se originado na população brasileira como um único evento em um ancestral comum. Um dos indivíduos desenvolveu inibidores. Foi feita, também, uma avaliação geral sobre o papel das mutações no F8 na formação de inibidores em pacientes graves estudados em investigação anterior, verificando-se associações significativas tanto no que se refere aos domínios em que as mutações ocorreram, quanto aos tipos de mutações encontrados. Os dados desses estudos são úteis no diagnóstico e prevenção precoce de inibidores na hemofilia A, bem como na detecção de mulheres heterozigotas na população do sul do Brasil. Espera-se oferecer um melhor manejo aos pacientes, fornecer aconselhamento genético e suporte psicológico/emocional para as famílias dos afetados. Factor VIII (FVIII) partial or total deficiency, or functional defects, result in the hereditary disease haemophilia A (HA), generally caused by heterogeneous mutations in the FVIII gene (F8). Although more than 1200 F8 mutations have been reported, data regarding these mutations are insufficient in southern Brazilian populations and their study provides a better understanding of the molecular genetics of the disease in this population. Furthermore, after evaluating the effect that a mutation has on a protein, we can do a better assessment of its function, as well as of the interactions between the mutated protein and related structures. The objectives of this study were to identify gene mutations in patients with mild and moderate HA living in the southern Brazilian state of Rio Grande do Sul and to analyze the role of these mutations in disease determination and presence of inhibitors. A total of 76 unrelated male patients with mild (n = 55) or moderate (n = 21) HA were included in the study. All F8 26 exons, the 5 'UTR and 3' UTR, intron-exon junctions and the promoter region were amplified by PCR and analyzed by direct sequencing. We also examined 100 blood bank donors’ normal chromosomes to exlude polymorphic changes as causal to the disease. F8 patients’ sequences were compared with the reference sequence (NCBI: NG_005114.1) using the CodonCode Aligner software implemented in Mega 5.04. The mutations found were compared with those present in The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (HAMSTeRS) database and the conservation of the mutated amino acids was also verified. Splice site mutations were detected using the Berkeley Drosophila Genome Project splice site prediction program, and for the analysis of missense mutation effects three predictors were used: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping), Site Direct Mutator (SDM) and Have yOur Protein Explained (HOPE). The mutations were localized in the FVIII structure by PyMOL and the FVIII A domains eletrostatic surface was visualized using GRASP2. When no mutation was found, the Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) analysis was performed. As for the recurrent mutations, haplotype analyses were conducted to investigate whether they emerged in this population through several distinct mutational events or from a founder effect. We identified the disease causing mutation in 69 (91%) patients, who showed 33 different mutations: 27 missense, one small deletion, two small duplications and three splice site changes. Seven missense and two splice site mutations had not been previously reported in HAMSTeRS and were not identified in any literature search. The latter were all considered pathogenic; p.Val266Met is located near a copper binding site and may decrease the interaction between the FVIII A2 and A3 domains; p. Met567Lys can affect a factor IX binding site; p.Arg1764Gly, p.Tyr1786Phe and p.Tyr1792Cys can affect factor IX and von Willebrand Factor binding sites. Nine recurrent mutations were found, one of them (p.Tyr1786Phe) never described before. Haplotype analysis suggests that this mutation originated in the Brazilian population as a single event in a common ancestor. One of the subjects developed inhibitors. A general evaluation was also made about the role of F8 mutations in the development of inhibitors in severe patients studied in a previous investigation, and significant associations were found both in relation to the domains where the mutations occurred, as well as in the mutations found. The data of these studies will be useful in the diagnosis and early prevention of inhibitors in haemophilia A, and in the detection of female carriers in the southern Brazilian population. We hope to offer a better monitoring to the patients, to give genetic counseling, and psychological/emotional support to the families of affected persons.

Introdução: As doenças monogênicas neurofibromatose tipo 1 (NF1) e esclerose Tuberosa (ET) são consideradas síndromes genéticas raras com malignidade associada. Trata-se das duas genodermatoses mais frequentes, que apresentam como sintomas em comum as lesões cutâneas, ocorrência de tumores no Sistema Nervoso Central, deficiência cognitiva e/ou de desenvolvimento. Com uma gama variada de alterações genéticas envolvidas e sintomas em diferentes graus de comprometimento, caracterizar essas doenças, bem como investigar as alterações genéticas encontradas em subgrupos clínicos é um desafio. Objetivos: O objetivo dos trabalhos reunidos nesta tese foi caracterizar, do ponto de vista evolutivo, clínico e molecular, pacientes com NF1 e ET diagnosticados com rearranjos gênicos, realizar caracterização molecular adicional por análise de transcritos em pacientes com diagnóstico clínico de ET, bem como explorar o mecanismo de autofagia envolvido nesta doença. Resultados: Através de uma abordagem evolutiva foram avaliadas microdeleções encontradas em pacientes com NF1 envolvendo quatorze genes co-deletados. Destes, dez genes mostraram seleção purificadora e quatro genes mostraram seleção positiva, sendo um deles, RNF135, apresentando também seleção positiva de aminoácidos específicos, reforçando sua importância e contribuição para a doença e possível correlação da sua deleção com o fenótipo mais grave desses pacientes. Adicionalmente, foi apresentado relato de caso de um paciente com ET e rearranjo gênico, descrevendo manifestações clínicas não habitualmente relacionadas com a doença e sugerindo, através de revisão de todas as evidências existentes, a inclusão destas manifestações no fenótipo da síndrome. Como resultados preliminares, apresentamos o recrutamento de pacientes com ET e variantes de significado incerto ou ausência de variante patogênica na região codificadora dos genes TSC1 e TSC2, bem como o desenho de primers que serão utilizados para a investigação de exon-skipping no RNA mensageiro desses pacientes. Por fim, uma revisão bibliográfica apresenta o paradoxo da via de autofagia e potenciais estratégias terapêuticas envolvidas com essa via para pacientes acometidos com ET e resultados preliminares apresentam o estabelecimento de fibroblastos de paciente ET com mutação em TSC2 e de fibroblastos de indivíduo sem ET, a fim de realizar avaliação do impacto de moduladores de autofagia no fluxo autofágico e nos mecanismos de mitofagia, apoptose e necrose celular. Introduction: Neurofibromatosis type 1 (NF1) and tuberous sclerosis complex (TSC) are the most common genodermatoses. They are monogenic, autosomal dominant disorders associated with skin abnormalities, increased risk for developing certain tumors, mainly of the peripheral and central nervous system, cognitive and/or developmental disabilities and other findings. The disorders are characterized by complete penetrance but variable expressivity and significant molecular heterogeneity, which result in challenges in terms of the clinical and molecular diagnosis of the affected patients. Objectives: The main goal of this thesis was to characterize, from an evolutionary, clinical, and molecular point of view, patients with NF1 and TSC diagnosed with gene rearrangements, perform additional molecular investigations in patients with the clinical diagnosis of ET, as well as exploring the autophagy mechanism involved in this disease. Results: Through an evolutionary approach, microdeletions identified in NF1 patients and involving fourteen co-deleted genes were characterized. Of these, 10 genes showed purifying selection and 4 genes showed positive selection, with one of them, RNF135, also presenting positive selection of specific amino acids. These findings related to RNF135 suggest its importance and contribution to the disease and a possible correlation of its deletion with a more severe phenotype in affected patients. Additionally, a case report of a patient with TSC and a gene rearrangement is presented. It describes clinical manifestations not usually observed in TSC and suggests, through a review of all the existing evidence, the inclusion of these manifestations in the syndrome’s phenotype. In addition, the thesis contains preliminary results of the additional molecular investigation, focused on mRNA/exon skipping analyses, of TSC patients with variants of uncertain significance (VUS) or absence of pathogenic variants in the coding region of the TSC1 or TSC2 genes. Finally, a comprehensive review on the paradox of autophagy in TS and of potential novel therapeutic strategies related to autophagy for TS patients is presented as well as preliminary results on an investigation of autophagy modulators in fibroblast of TSC patients. Discussion and conclusions: NF1 and TSC are well characterized genodermatoses from a 13 clinical and molecular point of view. However, there are still important gaps about these syndromes, such as an incomplete understanding of genotype-phenotype relationships (especially related to gene rearrangements), absence of a specific disease-causing molecular lesion in some patients, and uncertainties related to the exact mechanisms that lead to these disorders and their complications. This thesis aims to contribute to the understanding of some of these aspects, ultimately leading to improved diagnosis and management of patients and their family members, with impacts both on genetic counseling and on development of potential novel therapeutic interventions. Discussão e conclusões: A NF1 e a ET são genodermatoses bem caracterizadas do ponto de vista clínico e molecular. No entanto, ainda existem lacunas importantes acerca destas síndromes, como o entendimento completo de relações genótipo-fenótipo (em especial de rearranjos gênicos), da ausência de identificação da lesão molecular em todos os casos com diagnóstico clínico, e dos mecanismos relacionados à patogênese destas doenças. Essa tese foi desenvolvida para contribuir no entendimento de alguns destes aspectos. Esforços voltados para uma melhor compreensão destas lacunas poderão resultar na inclusão dos achados desta tese no diagnóstico molecular dessas doenças e no aprimoramento do manejo dos pacientes e familiares, com impactos tanto no aconselhamento genético quanto para desenvolvimento de potenciais alternativas terapêuticas.