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Made available in DSpace on 2022-04-28T19:52:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2022-05-31 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) The development of bio-based food packaging with antioxidant properties is an important research topic and has gained prominence these days. In this study, bioactive films were developed based gelatin-corn starch (GCS) incorporated with corn stigma extract (CSE) at different concentrations (15% and 25%; w/v). In preliminary tests, the extract maintained cell viability above 90% indicating that it is safe for application as an active ingredient. Insertion of the extract did not influence the thickness of the films but caused a slight change in optical properties. Scanning electron microscopy (SEM) analysis revealed interactions between the extract's bioactive compounds with gelatin and corn starch compounds, which may have improved the mechanical properties (elongation at break, Young's modulus). The addition of 25% corn stigma extract increased the contact angle, giving the film a hydrophobic character. Furthermore, at this concentration, a 15% reduction in water vapor permeability was observed. The elaborated films showed complete biodegradability before the tenth day of the study. It can be inferred that the films with corn stigma extract have good antioxidant properties, indicating that they can be used as an ingredient for food packaging. Department of Food Science and Technology Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), RS Hybrid Composites and Nanocomposites Group Department of Physics and Chemistry Universidade Estadual Paulista (UNESP), SP Department of Industrial Pharmacy Health Sciences Center Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), RS Hybrid Composites and Nanocomposites Group Department of Physics and Chemistry Universidade Estadual Paulista (UNESP), SP FAPESP: 2013/07296-2 CEPID FAPESP: 2019/06170-1 CNPq: 312530/2018-8 CAPES: Code 001

Oil-in-water (O/W) nanoemulsion containing goldenberry extract was elaborated using a high-energy ultrasonic bath method. Physicochemical characterization of the formulation was carried out by determining pH, mean droplet diameter, polydispersity index (PDI) and zeta potential. Nanoemulsion toxicity was assessed using in vitro assays with tumor and non-tumor cell lines, and in vivo using Caenorhabditis elegans. The pH of the nanoemulsion was 3.84, the mean droplet diameter was 268 ± 7 nm, PDI 0.113 and zeta potential -13.94 mV. Results of the cytotoxicity assays employing non-tumor cells indicated that the extract associated or not with nanoemulsion maintained cell viability at different concentrations tested. In the assays using tumor lineage, it is observed that the nanoemulsion containing the extract had higher antitumor activity than the free extract. As for the in vivo tests, there was no change in the survival rate of the worms. RESUMO: Nanoemulsão óleo/água (O/A) contendo extrato de goldenberry foi elaborada utilizando método de banho ultrassônico de alta energia. A caracterização físico-química da formulação foi realizada pela determinação do pH, diâmetro médio de gotas, índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta. A toxicidade das nanoemulsões foi avaliada utilizando ensaios in vitro com linhas celulares tumorais e não tumorais e in vivo utilizando Caenorhabditis elegans. O pH da nanoemulsão foi de 3,84, o diâmetro médio das gotículas foi de 268 ± 7 nm, PDI 0,113 e o potencial zeta -13,94 mV. Os resultados dos ensaios de citotoxicidade empregando células não tumorais indicaram que o extrato associado ou não à nanoemulsão manteve a viabilidade celular em diferentes concentrações testadas. Nos ensaios, utilizando linhagem tumoral, observou-se que a nanoemulsão contendo o extrato apresentou maior atividade antitumoral do que o extrato livre. Quanto aos testes in vivo, não houve mudança na taxa de sobrevivência dos vermes.

The aim of this study was to develop and validate a simple, quick and sensitive assay for determination of doxycycline concentration in human plasma by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Doxycycline and Oxytetracycline (internal standard) were extracted from 0,5 mL human plasma into ethyl acetate. The HPLC system was operated isocratically at controlled temperature (30°C) with reversed phase Phenomenex Luna C8 column (150 mm x 4.6mm i.d.; 4 ?m particle size) and using a mobile phase consisting in water: acetonitrile: tetrahydrofuran (80:15:5 v/v/v) adjusted to pH 2.5, at a flow rate of 1.0 mL/min. Detection was achieved with a UV detector at 357 nm. Method validation investigated parameters such as the sensitivity, linearity (r2= 0.9946), precision, accuracy, recovery and stability. The limit of quantification was 0,25 ?g/mL. Under the assay conditions, doxycycline and oxytetracycline had retention times of 7,5 and 2,4 minutes, respectively. No interferences with endogenous compounds or with anticoagulant were observed. The mean recovery of doxycycline was 84.57%, and 80.73% for the intern standard at working concentration (20?g/mL). The method showed to be precise and accurate both for analyses held in a same day (intra-day) as in different days (inter-days). A good stability of doxycycline and oxytetracycline was observed during extraction and analysis, when stored over a fourmonth period at -20°C, on the auto sample during 24 hours and to 3 freeze-thaw cycles. The present method is suitable for sensitive, precise and accurate determination of doxycycline concentrations in human plasma, within the limits established for this type of analyses O objetivo deste estudo foi desenvolver e validar método simples, rápido e sensível para determinação de doxiciclina em plasma humano por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A doxiciclina e oxitetraciclina (padrão interno), foram extraídas de 0,5 mL de plasma com acetato de etila. Utilizaram-se o sistema de CLAE com bomba isocrática, com temperatura controlada (30°C) e coluna cromatográfica Phenomenex® Luna C8 (15,0 cm x 4,6 mm; partícula 4 ?m). A fase móvel, constituída por mistura de água, acetonitrila e tetrahidrofurano (80:15:5 v/v/v), teve pH ajustado para 2,5 sendo bombeada para o sistema cromatográfico em fluxo de 1,0 mL/min. Utilizou-se detector ultravioleta com comprimento de onda de 357 nm. Investigaram-se os seguintes parâmetros de validação: especificidade, linearidade (r2 = 0,9946), precisão, exatidão, recuperação e estabilidade. O limite de quantificação encontrado foi de 0,25?g/mL. Nas condições do ensaio, doxiciclina e oxitretaciclina apresentaram tempo de retenção de 7,5 e 2,4 minutos, respectivamente. Não foram observadas interferências com compostos endógenos ou com anticoagulante. Obtevese recuperação média para doxiciclina de 84,57% e de 80,73% para o padrão interno na concentração de 20 ?g/mL. O método mostrou-se preciso e exato tanto em análises realizadas no mesmo dia (intra-dia) quanto em dias diferentes (inter-dias). As amostras mantiveramse estáveis no tempo e condições de análise, por pelo menos 120 dias, à temperatura de -20°C, durante a injeção no cromatógrafo (24 horas) e quando analisadas após três ciclos de congelamento e descongelamento. O método desenvolvido demonstrou-se adequado à quantificação de doxiciclina em amostras de plasma humano, apresentando sensibilidade, precisão e exatidão dentro dos limites estabelecidos para análises deste tipo

The high intensity ultrasound-assisted extraction (HIU) is one of the most simple, quick and efficient techniques for the extraction of phenolic and other antioxidant compounds from plants. This is the first application of HIU for the extraction of these compounds from goldenberry fruit. The HIU and conventional extraction techniques showed similar results regarding to phenolic compounds and antioxidant capacity. However, the time required for HIU extraction (5min) was 24 times lower than conventional extraction (120min). Phenolic compounds reported were chlorogenic acid, caffeic acid and rutin. In vitro cytotoxicity assays were used for evaluation of extracts and the results showed that in a wide range of concentration, the extract maintains cell viability, thus indicating the possibility to use it as food with safety. RESUMO: A extração assistida com ultrassom de alta intensidade (HIU) é uma das técnicas mais simples, rápidas e eficientes na extração de compostos fenólicos e antioxidantes de plantas. Este trabalho foi o primeiro a utilizar HIU na extração destes compostos presentes na fruta goldenberry. As técnicas HIU e extração convencional apresentaram resultados semelhantes com relação aos compostos fenólicos e capacidade antioxidante. Entretanto, o tempo necessário na HIU (5min) foi 24 vezes menor que na extração convencional (120min). Os compostos fenólicos encontrados foram ácido clorogênico, ácido cafeico e rutina. Ensaios de citotoxicidade in vitro foram usados para avaliação dos extratos e os resultados demonstraram que, em ampla faixa de concentração, o extrato mantém a viabilidade celular, indicando assim possível segurança para utilização em alimentos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Doxorubicin (DOX) is an anthracycline antibiotic widely used in cancer therapy, being effective against a number of tumors. However, its use may promote the development of multidrug resistance on tumor cells beside other adverse effects. Polymeric nanoparticles (NPs) stand out as an alternative to circumvent these limitations. Therefore, this work aimed to develop and evaluate poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) NPs to vectorized DOX release. The versatility of this system allows the modification of its composition to obtain multifunctional NPs. Thus, the pH-sensitive behavior of the NPs was achieved by the incorporation of a surfactant derived from the amino acid lysine with sodium counterion (77KS), while the chemosensitizer ability was explored by the inclusion of poloxamer (DOX-PLGA-NPs). The transferrin (Tf) protein was conjugated to the NPs surface (Tf-DOX-PLGA-NPs) with the role to actively targeting them to the cancerous cells. The NPs displayed adequate physicochemical characteristics and the Tf conjugation rate was considered satisfactory, being proved by different methods. The characteristics of the NPs suspensions changed over the storage time; therefore, a lyophilized pharmaceutical form was proposed. The NPs promoted a control and pH-dependent in vitro drug release. In the hemolysis studies, performed in different pH values, it was showed the role of the 77KS to obtain pH-sensitive NPs and, consequently, to reach pHresponsiveness membranolytic activity, indicating the possible rupture of endosomes and DOX release in the cytoplasm. Both DOX-loaded and unloaded NPs exhibited great hemocompatibility and did not affect the coagulation system. Compared to DOX-PLGA-NPs and free DOX, the Tf-DOX-PLGA-NPs were more efficient to inhibit the proliferation of both sensitive and resistant cells, showing the synergistic activity of the modifiers 77KS, poloxamer and Tf. Cell uptake studies showed the effectiveness of Tf-modified NPs to internalize into the cells, proving the role of Tf as specific ligand and suggesting the targeted DOX delivery to cancer cell. Moreover, it was verified the higher Tf-DOX-PLGA-NPs intracellular retention, which can be attributed to the poloxamer ability to inhibit the activity of efflux pumps, as a mechanism to overcome MDR effect. The mechanisms underlying the cytotoxic response of the NPs indicated the involvement of the greater number of apoptotic events, accompanied by cell cycle arresting and reactive oxygen species generation, being these mechanisms more expressive for Tf-conjugated NPs. Cell internalization pathway studies revealed that receptormediated endocytosis and strong energy dependence were involved in the cellular uptake process of Tf-DOX-PLGA-NPs. From these results, it can be considered that the functionalization promoted in the polymeric NPs were effective to obtain a targeted DOX delivery system, able to overcome the MDR effect and potentialize its antineoplastic activity. A doxorrubicina (DOX) é um antibiótico antraciclínico amplamente utilizado na terapia do câncer, sendo efetiva contra uma série de tumores. No entanto, seu uso pode causar promover o desenvolvimento de resistência pelas células tumorais, além de diversos efeitos adversos. As nanopartículas (NPs) poliméricas sobressaem-se como uma alternativa para contornar essas limitações. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo desenvolver e estudar NPs de poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) para liberação vetorizada da DOX. A versatilidade desse sistema permite a funcionalização de sua estrutura para a obtenção de NPs multifuncionais. Assim, o comportamento pH-sensível das NPs foi alcançado pela incorporação de um adjuvante derivado do aminoácido lisina com contra-íon sódio (77KS), enquanto a habilidade de sensibilizar as células tumorais e potencializar o efeito citotóxico da DOX foi explorada através da inclusão do poloxamer (DOX-PLGA-NPs). A proteína transferrina (Tf) foi conjugada à superfície das NPs (Tf-DOX-PLGA-NPs) visando direcionar a DOX ativamente à célula tumoral. As NPs apresentaram características físico-químicas adequadas e a conjugação da Tf alcançou uma taxa satisfatória, sendo comprovada através de diferentes métodos. As suspensões de NPs apresentaram alterações em suas características ao longo do estudo de estabilidade e, portanto, uma forma farmacêutica liofilizada foi proposta. As NPs promoveram a liberação in vitro da DOX de forma controlada e pH-dependente. A partir da realização do ensaio de hemólise em diferentes valores de pH, evidenciou-se o papel do tensoativo 77KS para a obtenção de NPs pH-sensíveis e, consequentemente, para sua alta capacidade lítica de membrana em condições ácidas, indicando a possível ruptura dos endossomas e liberação do fármaco no citoplasma das células. As NPs contendo ou não DOX mostraram-se hemocompatíveis. Em comparação às DOX-PLGA-NPs e à DOX livre, as Tf- DOX-PLGA-NPs mostraram-se mais eficientes em inibir a proliferação tanto de células tumorais sensíveis quanto resistentes, indicando a ação sinérgica dos modificadores 77KS, poloxamer e Tf. Estudos de captação celular mostraram que as NPs funcionalizadas com Tf foram internalizadas eficientemente, comprovando o papel da Tf como ligante específico e sugerindo a entrega vetorizada da DOX à célula tumoral. Além disso, verificou-se que as Tf- DOX-PLGA-NPs mantiveram-se retidas por mais tempo nos compartimentos intracelulares, o que pode ser atribuído ao poloxamer, devido a sua capacidade de inibir a atividade de bombas de efluxo como um mecanismo para superar o efeito MDR. Estudos de mecanismos de toxicidade indicaram que a indução de apoptose acompanhado de alterações no ciclo celular e geração de espécies reativas de oxigênio estão envolvidos na resposta citotóxica promovida pelas NPs, sendo estes mecanismos mais expressivos para as NPs conjugadas com Tf. Em estudos sobre as possíveis vias de internalização das NPs, verificou-se que as Tf-DOX-PLGANPs foram internalizadas via endocitose mediada por receptor e em um processo dependente de energia. Sendo assim, pode-se considerar que as modificações realizadas nas NPs poliméricas foram eficientes para a obtenção de um sistema de liberação vetorizado para a DOX, capaz de superar o efeito MDR e potencializar sua atividade antineoplásica.

3,3’-Diindolylmethane (DIM) is a phytochemical compound originated after the ingestion of some vegetables. Despite the several health benefits showed by this bioactive (like antioxidant, anti- inflammatory and antineoplasic effects), it is water-insoluble, presenting oral bioavailability of 1% and it is thermo and photolabile, which restrains its pharmaceutical applications. In attempt to overcome these issues and improve DIM therapeutic potential, an interest approach is the incorporation of the compound in polymeric microparticles (MPs) or nanocapsules (NCs), which provide protection of the drug and improved dissolution profile for hydrophobic substances. Therefore, this thesis aimed to the development of DIM-loaded MPs. The in vitro photostability, antioxidant and antitumoral (glioma cells) actions of NCs were assessed as well as the evaluation of DIM antinociceptive effect, in its free or nano/microencapsulated forms, using animal models of acute pain. The Ethical Research Committee of Federal University of Santa Maria approved all experimental procedures carried out in the present study, which are register under the nº 4428090217/2017. The NCs suspensions were prepared by the interfacial deposition of pre-formed polymers and demonstrated suitable physicochemical characteristics: particles in nanometric diameter (100-300 nm), polydispersity indexes below 0.25, positive or negative zeta potentials depending on the polymer feature, acid pH, drug content close to the theoretical (1 mg/mL) and encapsulation efficiency about 100%. In the photostability assay, after 5h under UVC exposure, NCs presented DIM content 3-fold higher than free DIM (methanolic solution). The DIM release from the NCs was evaluated by the dialysis bag technique, demonstrating that the NCs prolonged the DIM release, which fits first order kinetic and anomalous transport as release mechanism. For DIM scavenging capacity test, the DPPH or ABTS reagents were added to NC samples containing 2-4-6 µg/mL of DIM. DIM presented scavenging activity in both free and nanoencapsulated forms, which was more pronounced for the NCs. The cytotoxic effect of free DIM or DIM-loaded NCs against U87 human glioblastoma cells was performed at 3-6-12-24 μg/mL and demonstrated that nanoencapsulation generally enhanced the antitumor effect of DIM (Article 1). Besides, it was demonstrated the feasibility of preparation of DIM-loaded MPs, which have shown suitable physicochemical characteristics, as micrometric diameter (200-400 µm), narrow size distribution, DIM content of 150 mg/g and encapsulation efficiency of 84%, as well as controlled release of the active. Other physicochemical evaluations demonstrated that NCs and MPs were able to adequately encapsulate DIM without interactions of the active with the other materials of the formulations. In addition, the antinociceptive effect was evaluated using distinct animal models of acute pain (Thermic nociception model - Hot plate; Chemical nociception model induced by formalin; Model of acute inflammatory pain induced by Complete Freund’s Adjuvant). Male Swiss mice (25-35 g) were intragastrically treated (DIM doses of 2,5, 5 ou 10 mg/Kg) and the behavioral tests were performed after 0,5-8h. The results demonstrated DIM antinociceptive/anti-hypernociceptive action, in both free and nano/microencapsulated forms, presenting prolonged and enhanced effect in the NCs or MPs in comparation with the free form (Manuscripts 1 and 2). Therefore, the present work showed the feasibility of preparation of DIM-loaded NCs and MPs, in addition to the ability of these systems of promoting DIM prolonged release and photoprotection, as well as improve the antinociceptive and antioxidant activity this bioactive, consisting in an innovative approach to DIM oral delivery for pain management . O 3,3´-diindolmetano (DIM) é um bioativo originado a partir de reações químicas que ocorrem em vegetais crucíferos, após a ingestão destes. Este bioativo tem demonstrado vários benefícios ao organismo, como ação antioxidante, anti-inflamatória e antineoplásica. Entretanto, o DIM é insolúvel em água, apresentando biodisponibilidade menor que 1% por via oral, além de degradar-se quando exposto à luz ou a altas temperaturas. Na tentativa de contornar algumas destas limitações e melhorar o potencial terapêutico do DIM, uma estratégia que pode ser adotada é a incorporação do composto em nanocápsulas (NCs) ou micropartículas (MPs) poliméricas, as quais proporcionam proteção ao ativo e melhora no perfil de dissolução de substâncias hidrofóbicas. Dessa forma, esta tese visou o desenvolvimento de NCs e de MPs contendo DIM e a avaliação da performance destes sistemas frente à fotoestabilidade, ação antioxidante e antitumoral in vitro com as NCs, bem como o efeito antinociceptivo do DIM livre ou associado aos sistemas carreadores em modelos animais de dor aguda. Os protocolos descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Santa Maria, sob o nº 4428090217/2017. As suspensões de NCs de DIM foram preparadas pelo método de deposição interfacial de polímero pré-formado e apresentaram características físico-químicas adequadas, com tamanho de partícula na faixa de 100-300 nm, índice de polidispersão abaixo de 0,25, potencial zeta negativo ou positivo de acordo com a natureza do polímero empregado, pH levemente ácido, teor de ativo próximo ao teórico (1 mg/mL) e eficiência de encapsulamento próxima a 100%. Quanto ao estudo de fotodegradação frente à radiação UVC, a concentração final de ativo nas NCs foi 3x maior que a de ativo livre após 5h. O perfil de liberação do DIM a partir das NCs foi avaliado através da técnica de difusão em saco de diálise, demonstrando que as NCs prolongaram a liberação do bioativo, apresentando cinética de primeira ordem e mecanismo por transporte anômalo. A avaliação da atividade sequestrante frente aos radicais DPPH e ABTS foi realizada após diluição (2-4-6 µg/mL) das amostras (NCs e ativo livre), seguida da mistura destas com cada radical. O DIM apresentou neutralização dos radicais tanto na forma livre quanto nanoencapsulada, sendo esta mais acentuada para as NCs. O estudo do efeito citotóxico do DIM livre ou nanoencapsulado frente a células de glioma U87 foi realizado nas concentrações de 3-6-12-24 µg/mL e demonstrou que, de maneira geral, a nanoencapsulação aumentou o efeito citotóxico do DIM (Artigo 1). Além disso, foi demonstrada a viabilidade de preparação de MPs contendo DIM, as quais apresentaram características físico-químicas adequadas, como diâmetro médio na faixa de 200-400 µm, estreita distribuição granulométrica, teor de DIM de aproximadamente 150 mg/g e eficiência de encapsulamento em torno de 84%, bem como liberação controlada do ativo. Avaliações da forma de associação do DIM às nano- e micropartículas demonstraram a viabilidade dos sistemas em incorporar o DIM, sem apresentar interações com outros constituintes dos sistemas. Ainda, foi realizada a avaliação do efeito antinociceptivo do DIM em diferentes modelos animais (Teste da chapa quente, Modelo de nocicepção induzida pela formalina, Modelo de dor inflamatória aguda induzida pelo Adjuvante Completo de Freund). Para tal, foram utilizados camundongos Swiss machos (25-35 g), os quais foram tratados por via intragástrica (doses de 2,5, 5 ou 10 mg/Kg) nos tempos de 0,5-8h de tratamento. Os resultados demonstraram a ação antinociceptiva/anti-hipernociceptiva do DIM, tanto livre quanto associado aos sistemas, apresentando efeito farmacológico prolongado e mais acentuado devido à nano e a microencapsulação (Manuscritos 1 e 2). Portanto, o presente trabalho demonstrou a viabilidade de preparação de NCs e MPs contendo DIM, bem como a capacidade dos sistemas em promover liberação prolongada e fotoproteção, além de melhorar as atividades antinociceptiva e antioxidante deste bioativo, sendo assim uma abordagem inovadora para a liberação oral do DIM no tratamento da dor.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. Solubilidade e permeabilidade são parâmetros fundamentais para promover a adequada biodisponibilidade oral de um fármaco ou substância biologicamente ativa. Baseado nisso, foi criado o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) com o intuito de definir testes in vitro capazes de prever o comportamento in vivo dos fármacos. No contexto do uso do SCB para o desenvolvimento de fármacos encontra-se a eremantolida C (EREC), uma lactona sesquiterpênica com comprovadas atividades antitumoral, anti-inflamatória, antihiperuricêmica e antiartrite gotosa, e baixa toxicidade. Considerando isso, o objetivo deste trabalho foi realizar a avaliação biofarmacêutica da eremantolida C, por meio da determinação da velocidade de dissolução intrínseca (VDI) e da permeabilidade empregando a perfusão intestinal in situ em ratos. Para isso, a eremantolida C foi isolada e purificada, o que possibilitou a validação do método analítico para sua quantificação por cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE), aplicável aos estudos propostos. A VDI foi avaliada, após padronização da técnica, utilizando 100,0 mg de EREC, força e tempo de compressão de 1 tonelada e 1 minuto, respectivamente, 900 mL de meio tamponado a 37,0 ºC sob velocidade de 100 e 250 rpm, com coleta de amostras a cada 30 minutos durante 8 horas. A VDI obtida para a EREC nos meios tampão acetato (pH 4,5), fluido intestinal simulado sem enzimas (pH 6,8) e tampão fosfato (pH 7,4) apresentou valores inferiores a 0,1 mg/min/cm2 , confirmando a baixa solubilidade obtida para a substância. Apesar dos resultados dos estudos de solubilidade não indicarem a presença de polimorfismo, cinco diferentes amostras de EREC foram submetidas as análises de difração de raios-X, calorimetria diferencial exploratória e microscopias óptica e eletrônica de varredura com o intuito de avaliar a presença de formas polimórficas. A partir das análises realizadas, a EREC não apresentou qualquer tipo de polimorfismo, clássico ou morfológico, não havendo, portanto, influência de transições cristalinas na solubilidade e, consequentemente, em sua classificação biofarmacêutica e processo de absorção oral. Com relação à permeabilidade, a perfusão intestinal in situ foi avaliada no intestino delgado completo de ratos Wistar por meio da introdução de 10,0 mL da solução de perfusão contendo as substâncias de interesse. Alíquotas de 200,0 µL foram coletadas a cada 5 minutos durante 30 minutos e encaminhadas para quantificação, possibilitando o cálculo da permeabilidade efetiva (Peff) e a predição da fração absorvida (Fabs). O aciclovir (1,6 mg/mL) e o cloridrato de propranolol (0,32 mg/mL) foram empregados como fármacos padrão de baixa e alta permeabilidade, respectivamente, enquanto a permeabilidade da EREC foi avaliada frente às concentrações de 9,6 µg/mL, 96,0 µg/mL e 960,0 µg/mL, bem como, na presença de azida sódica 65,0 µg/mL. O aciclovir e o cloridrato de propranolol apresentaram Peff iguais a 1,09 x 10-5 ± 0,38 x 10-5 cm/s (Fabs = 19,6 %) e 10,94 x 10-5 ± 1,67 x 10-5 cm/s (Fabs = 88,8 %), respectivamente, confirmando a adequabilidade da técnica para a avaliação da permeabilidade. A EREC, por sua vez apresentou Peff entre 7,28 x 10-5 ± 0,52 x 10-5 cm/s e 7,81 x 10-5 ± 3,16 x 10-5 cm/s, demonstrando Fabs igual a 79,0 %. Os valores de Peff obtidos demonstraram sua alta permeabilidade e que o processo de absorção da EREC ocorre apenas pelo mecanismo passivo de permeação. Portanto, diante de todo o exposto, pode-se concluir que a eremantolida C pertence à classe II do SCB por apresentar baixa solubilidade e alta permeabilidade. Solubility and permeability are fundamental parameters for promoting the adequate oral bioavailability of a drug or biologically active substance. Based on this, the Biopharmaceutics Classification System (BCS) was created in order to define in vitro tests able to predict the in vivo behavior of the drugs. In the context of the use of BCS for the development of drugs, there is the eremantholide C (EREC), a sesquiterpene lactone with proven antitumour, antiinflammatory and antihyperuricaemic activities and low toxicity. Considering this, the purpose of this work was to carry out the biopharmaceutics evaluation of the eremantholide C, using the determination of the intrinsic dissolution rate (IDR) and the permeability by in situ intestinal perfusion in rats. For this, eremantholide C was isolated and purified, which allowed the validation of analytical method for its quantification by high performance liquid chromatography (HPLC), applicable to the proposed studies. IDR was evaluated, after standardization of the technique, using 100.0 mg of EREC, force and time of compression of 1 tonne and 1 minute, respectively, 900 mL of buffer media at 37.0 ºC and speed of 100 and 250 rpm, with sample collection every 30 minutes during 8 hours. IDR obtained for EREC in acetate buffer (pH 4.5), intestinal fluid simulated without enzymes (pH 6.8) and phosphate buffer (pH 7.4) showed values below 0.1 mg/min/cm2 , confirming the low solubility of the substance. Although the results from the solubility studies did not indicate the presence of polymorphism, five different EREC samples were submitted to X-ray diffraction, differential scanning calorimetry and optical microscopy and scanning electron microscopy analysis in order to evaluate the presence of polymorphic forms. From the analysis, the EREC did not present any type of polymorphism, classical or morphological. Therefore, there is no influence of crystalline transitions in the solubility and, consequently, in its biopharmaceutics classification and oral absorption process. Regarding the permeability, in situ intestinal perfusion was evaluated in the complete small intestine of Wistar rats by the introduction of 10.0 mL of the perfusion solution containing the substances. Aliquots of 200.0 μL were collected every 5 minutes during 30 minutes and sent for quantification, allowing the calculation of the effective permeability (Peff) and the prediction of the absorbed fraction (Fabs). Acyclovir (1.6 mg/mL) and propranolol hydrochloride (0.32 mg/mL) were used as standard drugs of low and high permeability, respectively, while the permeability of EREC was evaluated using concentrations of 9.6 μg/mL, 96.0 μg/mL and 960.0 μg/mL, as well as in the presence of sodium azide 65.0 μg/mL. Acyclovir and propranolol hydrochloride showed Peff equal to 1.09 x 10-5 ± 0.38 x 10-5 cm/s (Fabs = 19.6 %) and 10.94 x 10-5 ± 1.67 x 10-5 cm/s (Fabs = 88.8 %), respectively, confirming the suitability of the technique to evaluate the permeability. EREC, in turn, presented Peff between 7.28 x 10- 5 ± 0.52 x 10-5 cm/s and 7.81 x 10-5 ± 3.16 x 10-5 cm/s, showing Fabs equal to 79.0 %. The Peff values demonstrated its high permeability and that EREC absorption process occurs only by the passive mechanism of permeation. Therefore, it can be concluded that eremantholide C belongs to BCS class II because it presents low solubility and high permeability.

Dronedarone is a new antiarrhythmic agent, analogue of amiodarone. Dronedarone was approved for the maintenance of the sinus rhythmic in adult patients with atrial fibrillation. Dronedarone show bioavailability problems due to its very low water solubility, slow dissolution rate and instability in the gastrointestinal tract. Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides with a relatively hydrophobic central cavity and a hydrophilic surface. Because cyclodextrins can form complexes with a variety of organic molecules, they have been widely used to increase the solubility, stability and bioavailability of poorly soluble drugs. In the present study, complexes of dronedarone with β-cyclodextrin (β-CD) and 2-hydroxypropyl- β-cyclodextrin (HP-β-CD) were prepared with the aim to increase the aqueous solubility and dissolution properties of dronedarone. Solid inclusion compounds were obtained by mixing appropriate amounts of dronedarone and β-CD or HP-β-CD, in a 1:10 molar ratio. The preparation was carried out according to the lyophilization, co-lyophilization and kneading and spray-drying methods. Solubility studies were performed by phase solubility analysis. The complexes were characterized in the solid state by DSC, XRD, FTIR spectroscopy and SEM. Characterization of inclusion complexes by DSC and XRD showed that dronedarone appeared to exist in a non-crystalline form. The solubility of the complexes were evaluated and compared with pure drug. Dronedarone solubility was notably improved in simulated gastric fluid. The cytotoxicity of the inclusion complexes was evaluated by a simple method based on 3T3 embryonic mouse fibroblast monolayers culture using the reduction of 2,5-diphenyl-3,-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl) tetrazolium bromide (MTT) as in vitro viability assay. The inclusion complexes with both cyclodextrins produced a significant reduction in cytotoxic effects compared with the free dronedarone. In order to determine the hepatotoxic potential of the free drug and inclusion complexes, the cytotoxicity was investigated using human hepatoma cell line HepG2. The assay results showed a dose response effect; higher drug concentrations induced a higher reduction in cell viability. No significant difference among the IC50 values of the free drug and inclusion complexes was observed, suggesting that inclusion complexation did not increase dronedarone hepatotoxic effect. The 3T3 Neutral Red Uptake phototoxic test was used to verify the phototoxic potential, while the in vitro photoassay using THP-1 human monocytes, with the interleukin 8 (IL-8) expression as endpoint, was used to determine the photosensitizing potential of free dronedarone and its inclusion complexes with β-CD or HP-β-CD. The free drug and inclusion complexes did not show photoirritant potential. In the photosensitizing assay, inclusion complexes prepared with β-CD by kneading following spray-drying induced lower photosensitization in comparison to free dronedarone. Finally, cyclodextrins were able to form inclusion complexes with dronedarone, and provided an improved solubility and chemical stability, reducing drug cytotoxic potential. Thus, inclusion complexes with cyclodextrins might be a promising alternative in the development of formulations with improved therapeutic efficacy. A dronedarona é um novo agente antiarrítmico análogo à amiodarona. Foi aprovado para a manutenção do ritmo cardíaco normal em pacientes com fibrilação atrial. A dronedarona possui baixa biodisponibilidade e é instável no trato gastrintestinal. As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos com uma cavidade central relativamente hidrofóbica e superfície hidrofílica. Por formarem complexos com uma variedade de moléculas orgânicas, as ciclodextrinas têm sido amplamente utilizadas para aumentar a solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água. No presente estudo, complexos de inclusão de dronedarona com β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina foram preparados com o objetivo de melhorar a solubilidade aquosa e as propriedades de dissolução da dronedarona. Os complexos de inclusão no estado sólido foram obtidos pela mistura de quantidades de β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina na proporção molar de 1:10 (fármaco:ciclodextrina). Os complexos foram preparados de acordo com os métodos de liofilização, coliofilização e malaxagem seguida de secagem por aspersão. Os estudos de solubilidade foram realizados pelo método do diagrama de solubilidade de fases. Os complexos no estado sólido foram caracterizados por calorimetria exploratória diferencial, difração de raios-X de pó, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier e microscopia eletrônica de varredura. A caracterização dos complexos de inclusão por calorimetria exploratória diferencial e difração de raios-X mostrou que a dronedarona aparenta estar na forma amorfa. A dissolução dos complexos foi estudada e comparada com o fármaco puro. Após a complexação, houve um aumento significativo na porcentagem dissolvida da dronedarona em fluido gástrico simulado. A citotoxicidade dos complexos de inclusão foi avaliada em cultivo de fibroblastos da linhagem 3T3 utilizando o ensaio de redução do MTT (brometo 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico). Os complexos de inclusão com ambas as ciclodextrinas apresentaram uma significativa redução dos efeitos citotóxicos da dronedarona em comparação ao fármaco livre. Com a finalidade de determinar o potencial hepatotóxico da dronedarona livre e dos complexos de inclusão, avaliou-se a citotoxicidade dos compostos em células da linhagem HepG2, células tumorais de hepatoma humano. Nesse ensaio verificou-se um efeito dose-resposta, ou seja, o aumento da concentração dos compostos gerou uma redução da viabilidade celular. Não foi observada diferença significativa entre os valores de concentração inibitória (IC50) do fármaco livre e complexos de inclusão, sugerindo que a complexação do fármaco com ciclodextrinas não aumenta seu efeito hepatotóxico. O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU foi utilizado para verificar o potencial fototóxico e o fotoensaio utilizando células THP-1 e IL-8 foi usado para determinar o potencial fotossensibilizante do fármaco e dos complexos de inclusão de dronedarona com β-ciclodextrina e 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina. O fármaco livre e os complexos de inclusão não apresentaram potencial fotoirritante. No ensaio de fotossensibilização, o complexo com β-CD obtido por malaxagem e secagem por aspersão mostrou potencial fotossensibilizante inferior ao do fármaco livre. Finalmente, as ciclodextrinas foram capazes de formar complexos com a dronedarona e desse modo, proporcionaram melhoria na solubilidade aquosa e estabilidade química do fármaco, além de reduzir seu potencial citotóxico. Assim, os complexos de inclusão demonstram ser uma alternativa promissora no âmbito farmacêutico, visando a obtenção de medicamentos com propriedades terapêuticas potencializadas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES The traditional cancer treatments act in a non-specific way, and cause side effects through loss of normal cell functions. Therefore, the development of new treatments with greater selectivity for the tumoral tissue is very important for the improvement of the anticancer therapy. In the last years, many studies have shown that an effective approach to enhancing the pharmacological action of drugs is conjugating the active molecule with a nanostructured delivery system. These news drug delivery systems have the capacity to improve the therapeutic index of several drugs, increasing the efficiency, decreasing the toxicity and achieving therapeutic indexes for an extended period. Therefore, the main objective of this research was to develop polymeric nanoparticles ( Ps) with the polyme poli(ε-caprolactone) and incorporating the surfactant 77 KL as a pH-responsive adjuvant , in order to entrap the antitumor drug methotrexate (MTX). After an exhaustive formulation study, the NPs was optimized with the surfactant poloxamer 407 as a stabilizer, which has the capacity to improve the entrapment efficiency (EE) of nanoparticulate systems, as well as to decrease the resistance of tumor cells. The NPs showed mean hydrodynamic diameter, polydispersity index and zeta potential of 178.5 nm, 0.135, -1.98 mV, respectively. A high-performance liquid chromatography method was developed and validated to measure the MTX in the NPs. The stability and photostability assessments, the EE and the in vitro release studies of MTX were determined using the validated analytical method. The NPs were freeze-dried with trehalose at 10% (w/v) as a cryoprotectant to improve the NPs stability, showing EE of 20.52%. In vitro release studies were performed in media with pH 7.4 and 5.4, exhibiting slightly accelerated release patterns under acidic conditions. The pH-dependent membrane-lytic activity of NPs was assessed using the hemolysis assay, with the erythrocytes as a model of the endosomal membrane. The inclusion of 77KL on the formulation gives it a pH-sensitive membrane-lytic behavior in the acidic environment found in the intracellular compartments. Moreover, the in vitro antitumor activity of the NPs was evaluated in physiological pH and in the pH characteristic of the tumor tissue (pHe ~ 6.6), using tumor cell lines (MCF-7 and HepG2) and different cell viability assays (MTT and NRU). Our results proved that the nanoencapsulated MTX was more active against the tumor cell lines than the free drug, as determined by both viability assays. Therefore, the overall results indicated that the NPs have pH-sensitive properties and a greater in vitro antitumor activity than the free drug, suggesting that these nanodevices could be potentially useful as a carrier system in cancer therapy. As te apias t a icionais e t atamento o c nce atuam e manei a inespec fica esultan o em efeitos a e sos ca acte iza os pela pe a a fun ão as c lulas normais. Portanto, o desenvolvimento de novos t atamentos ue ap esentem maio seleti i a e pa a o teci o neopl sico muito impo tante para o progresso da terapia do c nce . os ltimos anos, vários estudos mostraram que uma a o a em eficaz pa a ape fei oa a a ão fa macol ica os f macos associa a mol cula ati a com um sistema e li e a ão nanoest utu a o. sses no os sistemas e li e a ão têm o potencial e melho a o n ice te apêutico e i e sos f macos ispon eis, aumentando a sua eficácia, diminuindo a sua toxicida e e atin in o n eis te apêuticos estacion ios po um pe o o p olon a o. Nesse contexto, o principal objetivo deste t a alho foi esen ol e nanopa t culas ( Ps) polim icas asea as no pol me o poli(ε-caprolactona) e modificadas com um tensoativo pH-dependente (77 KL), para encapsular o fármaco antitumoral metotrexato (MTX). Após a realização de um exaustivo estudo de formulação, as NPs foram otimizadas utilizando o tensoativo poloxâmero 407, que possui capacidade de melhorar a eficiência de encapsulação (EE) de sistemas nanoparticulados, bem como de diminuir a resistência de células tumorais. As NPs apresentaram tamanho médio de partícula, índice de polidispersão, e potencial zeta de 178,5 nm, 0,135, -1,98 mV, respectivamente. Um método analítico por cromatografia a líquido de alta eficiência foi desenvolvido e validado para a quantificação do MTX nas NPs. Os estudos de estabilidade e fotoestabilidade, a EE e o perfil de liberação in vitro do MTX encapsulado foram avaliados utilizando o método analítico validado. As NPs foram liofilizadas com 10% (p/v) de trealose, a fim de melhorar a estabilidade das NPs, e apresentaram EE de 20,52%. O perfil de liberação in vitro das NPs foi avaliado nos pH 7,4 e 5,4, apresentando liberação ligeiramente superior no pH 5,4. O potencial das NPs em romper as membranas celulares de modo pH-dependente foi estudado utilizando o eritrócito como modelo de membrana endossomal, sendo que os resultados obtidos evidenciaram que as NPs com 77 KL apresentaram atividade hemolítica superior nos pHs ácidos característicos dos compartimentos intracelulares. Além disso, determinou-se a atividade antitumoral in vitro das NPs, tanto em pH fisiológico como no pH característico do tecido tumoral (pHe ~ 6,6), utilizando linhagens celulares tumorais (MCF-7 e HepG2) e diferentes ensaios de viabilidade celular (MTT e NRU). O MTX nanoencapsulado foi mais citotóxico que o MTX livre em ambas linhagens celulares e ensaios de viabilidade. Portanto, os resultados obtidos demonstraram que as NPs possuem propriedades pH-dependentes e uma atividade antitumoral in vitro superior ao fármaco livre, sugerindo sua potencial utilização na terapia antineoplásica.

Skin is the largest organ of the humen body. Several cell types, including keratinocytes, Langerhans cells, melanocytes, Merkel cells and fibroblasts indwell in this tissue, ensuring its innumerous functions. Among these functions, the primary barrier against enviromental agressions may be the most import activity. Any damage that determines the interruption of this barrier sets a series of complex physiological responses aiming to restore this essential function in a multiphase process known as wound healing. The inflammatory phase of wound healing is subjected to possible instabilities. This may increase risks of delayed repair due to lytic and oxidative unbalances and continued inflammation. Therefore, the restoration of physiological defenses through the introduction of antioxidant and anti-inflammatory substances may result in an important strategy for recovery. Tropaeolum majus L. is a plant original from the South American Andes with many popular uses recognized by folk medicine for its anti-inflammatory and wound healing properties. Some of these traditional uses have already been scientifically justified. The aim of this work was to evaluate the wound healing potential of T. majus hydroethanolic extract. Fifty-four male Wistar rats were surgically wounded and treated daily with base emulsion (control group), base emulsion plus allantoin 1% (positive control group), or base emulsion plus T. majus dried hydroethanolic (70%) extract. Euthanasia and skin sample removal was carried 3, 7, and 14 days after surgery (day 0). The samples were destined to biochemical and morphological analyses. The extract was submitted to phytochemical characterization to determine major phenolic compounds. Total content of phenolic compounds, total content of flavonoids, and antioxidant capacity were also determined. Allantoin showed the expected results for a wound healing agent. However, T. majus extract demonstrated superior results compared to the positive control. The extract improved oxidative parameters of the wound, reduced inflammation, increased the number of fibroblasts, increased dermal connective tissue organization and collagen deposition. T. majus also offered benefits to re-epithelization. The extract analyses evidenced the presence of two major phenolic compounds, chlorogenic acid and rutin, as well as elevated content of phenolics and flavonoids associated to an elevated antioxidant capacity. It was concluded that T. majus extract presented excellent wound healing activity, probably connected to phenolic substances in its composition, demonstrating the possibility of pharmaceutical applications. A pele é o maior órgão do corpo humano. Diversas células, entre elas queratinócitos, células de Langerhans, melanócitos, células de Merkel e fibroblastos, fazem parte dos tecidos da pele, assegurando suas inúmeras funções. Dentre estas funções, a de barreira primária contra agente agressores ambientais é a mais importante. Danos que levem a interrupção desta barreira despertam respostas fisiológicas complexas visando restaurar esta função tão essencial em um processo multifásico denominado cicatrização. A fase inflamatória da cicatrização é passível de descontrole, aumentando o risco de atrasos no processo devido ao desequilíbrio lítico e oxidativo e ao prolongamento da inflamação. Desta forma, a recuperação das defesas fisiológicas pela introdução de agentes antioxidantes e anti-inflamatórios pode representar uma medida importante para atingir a cura. Tropaeolum majus L. é uma planta originária dos Andes Sul Americanos com inúmeros usos populares e reconhecida pela cultura tradicional por suas propriedades anti-inflamatórias e cicatrizantes. Alguns desses usos já foram fundamentados cientificamente. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial cicatrizante do extrato de T. majus. Neste trabalho 54 ratos Wistar machos sofreram processo cirúrgico para indução das feridas cutâneas. As feridas foram tratadas diariamente com emulsão base (controle), emulsão base acrescida de alantoína 1% (controle positivo) ou emulsão base acrescida de extrato hidroetanólico (70%) seco de T. majus (1%). A eutanásia e remoção das feridas para análises bioquímicas e morfológicas foi realizada 3, 7 e 14 dias após a cirurgia (dia 0). O extrato foi submetido a análise fitoquímica para identificação dos componentes fenólicos majoritários. O conteúdo total de compostos fenólicos e flavonoides e a atividade antioxidante do extrato também foram determinados. A alantoína provou os resultados esperados como agente cicatrizante. Porém o extrato de T. majus evidenciou resultados ainda melhores que o controle positivo. O extrato melhorou parâmetros oxidativos da ferida, reduziu a inflamação, aumentou o número de fibroblastos, a organização do tecido conjuntivo da derme e a deposição de colágeno. T. majus também ofereceu benefícios a reepitelização. A análise do extrato demonstrou a presença de dois compostos fenólicos majoritários, ácido clorogênico e rutina, além de elevados níveis de compostos fenólicos totais e flavonoides associados a ótima atividade antixidante. Conclui-se que extrato de T. majus apresentou excelente ação cicatrizante a qual parece estar ligada aos composto fenólicos de sua composição, demonstrando possível aplicação farmacêutica.