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Submitted by LUCIANA DINIZ ROLA Rola (lanakauz@gmail.com) on 2017-02-20T21:28:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_Rola, L.D..pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) Made available in DSpace on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida (“induced pluripotent stem cells” - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, condrócitos e osteócitos) para avaliar sua plasticidade in vitro. Ainda, foi caracterizada a expressão de marcadores moleculares por meio da imunocitoquímica (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) e RT-qPCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). A segunda meta teve como enfoque a derivação de células iPSC a partir das linhagens tronco multipotentes obtidas anteriormente. A derivação das linhagens iPSC foi testada pelo uso de integração gênica que exprimem quatro fatores de transcrição (c-Myc, Klf4, Oct4 e Sox2) pelos métodos de nucleofecção, lipofecção ou lentiviral. As colônias do tipo iPSC foram obtidas somente pelo método de nucleofecção e foram repicadas isoladamente. Porém, falharam em estabelecer linhagens clonais para posterior caracterização. A terceira meta deste trabalho visou estabelecer linhagens de células semelhantes as germinativas primordiais (“Primordial germ cell-like” PGCLs). Devido a falha em reprogramar as células-tronco adultas em iPSC, foram estabelecidas as linhagens de PGCLs por diferenciação de células de chifre, gordura e pele, passando pela fase de células semelhantes as epiblásticas (“epiblast-like cells” EpiLCs) e posteriormente sendo diferenciadas nas PGCLs. Após diferenciação, as PGCLs foram submetidas a testes de imunocitoquímica (DDX4 e DAZL) e RT-qPCR (DDX4, Stra8, Stella, Fragilis, OCT4). Ainda, foi testada a influência do ácido retinoico e do BMP4, bem como os sistemas de cultivo em adesão e em suspensão para a diferenciação das células multipotentes em PGCLs. FAPESP: 13/13972-0

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:39:02Z : No. of bitstreams: 1 rola_ld_me_jabo.pdf: 1100112 bytes, checksum: e5705e1710fde07da43891e94919e554 (MD5) Assim como outras espécies brasileiras de vida livre, os cervídeos têm sofrido pressões sobre seu habitat, o que provoca segregação entre populações, diminuição de troca gênica e de diversidade genética, aumento da endogamia, e um maior risco de extinção. A produção in vitro de embriões (PIVE) tem ganhado destaque como uma ferramenta a ser utilizada nos programas de conservação de espécies selvagens in situ e ex situ. Entre as etapas da PIVE, a maturação in vitro (MIV) assume grande importância, pois o seu sucesso pode garantir a melhora nas taxas de produção de embriões. Assim, os objetivos do presente trabalho foram: avaliar viabilidade do protocolo de estimulação ovariana para a aspiração folicular, a eficiência da laparoscopia para a aspiração folicular, e a maturação nuclear e a distribuição mitocondrial em oócitos maturados in vitro para a espécie M. gouazoubira. Para isso, foram utilizadas cinco fêmeas, submetidas a repetidas estimulações ovarianas com intervalos de 30 dias. Os oócitos aspirados foram classificados morfologicamente de acordo com a qualidade, submetidos à maturação in vitro por 24 horas e, posteriormente, corados para a avaliação da distribuição mitocondrial (Mitotracker Red CMXRos); e do estágio de maturação nuclear (Hoescht 33342). Foram realizados 14 procedimentos cirúrgicos para a colheita de 94 oócitos de fêmeas superestimuladas. A média de folículos visualizados, folículos aspirados e oócitos colhidos por cirurgia foi, respectivamente, de 17,07±9,12, 13,54±6,64 e 7,15±3,72. Dos oócitos maturados in vitro, 64,52% alcançaram a MII e a classificação da distribuição mitocondrial não foi conclusiva. Houve ativação espontânea por partenogênese em 16,13% dos oócitos. Ainda, foi realizada avaliação de... The cervids, as well as other free-living brazilian species, have suffered pressures on their habitat, causing segregation between populations and reduced genetic exchange, which may decrease the genetic diversity and generate increased inbreeding and extinction risk. In vitro embryo production (IVEP) has been highlighted as a tool to be used in wild species conservation programs in in situ and ex situ. The maturation process has a great importance among the steps of IVEP, and its success can ensure an improvement in the rate of production of embryos. The objectives of this study were to assess feasibility of the protocol of ovarian stimulation for ovum pick, the efficiency of laparoscopy for oocyte retrieval, and the nuclear maturation and mitochondrial distribution in oocytes matured in vitro for the species M. gouazoubira. Thus, we used five females, submitted to repeated stimulation with intervals of 30 days. After the visualization of the ovaries, the visible follicles were counted and punctured by laparoscopy on day eight (D8). The aspirated oocytes were classified morphologically according the quality, subjected to in vitro maturation for 24 hours and then stained for the evaluation of mitochondrial distribution (Mitotracker Red CMXRos) and nuclear maturation stage (Hoescht 33342). Fourteen surgical procedures were performed on overstimulated females and 94 oocytes were collected in total. The average number of visualized follicles, aspirated follicles, and harvested oocytes was equal to 17.07±9.12, 13.54±6.64 e 7.15±3.72, respectively. Of the in vitro matured oocytes, 64.52% reached the MII stage and 67.74% were classified with homogeneous mitochondrial distribution. There was spontaneous activation by parthenogenesis in 16.13% of the oocyte. Furthermore, 21 non-matured oocytes were evaluated and of these, 81%... (Complete abstract click electronic access below)