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Orientadores: Eneida de Paula e Iola Messias Fernandes Duarte, Lígia Nunes de Morais Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia e Universidade de Aveiro Resumo: A articaína (ATC) é um anestésico local (AL) relativamente novo no mercado e, apesar disso, é o segundo mais utilizado na clínica odontológica. Uma vantagem de seu uso provém de peculiaridades químicas pois, mesmo pertencendo à família das amino-amidas, possui um anel tiofeno e um grupamento éster que permite sua utilização em maior concentração clínica. Apesar de todos os AL apresentarem neurotoxicidade, há relatos de maior taxa de parestesia associado ao uso de ATC, sem evidências do mecanismo. que comprove maior neurotoxicidade da ATC em relação aos outros AL. Além disso, outro problema relacionado a anestesia odontológica é a falha anestésica ou um menor grau de analgesia que pode ocorrer em locais com processos inflamatórios instalados. Neste caso, o tratamento clínico se torna extremamente doloroso, estressante e sem alternativas para o controle eficaz da dor. Diante destas duas perspectivas sobre o AL, o foco desta tese foi a utilização de toxicometabolômica para aprofundar os conhecimentos sobre a neurotoxicidade da ATC, comparativamente à lidocaína (Parte 1) e o desenvolvimento de formulações de carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC) para a liberação sustentada de ATC, visando aumentar sua potência anestésica em tecidos inflamados (Parte 2). Parte 1: Nesta primeira etapa utilizamos metabolômica por Ressonância Magnética Nuclear de hidrogênio (RMN-1H) para estudar a toxicidade da ATC em relação à lidocaína (LDC, "padrão ouro" em odontologia) através das alterações metabólicas ocasionadas em células neuronais. Apesar da literatura indicar que não há diferenças entre ATC e outros AL em relação à toxicidade in vitro, a análise metabolômica em células de Schwann (CS) mostrou que a ATC produz alterações metabólicas diferentes em relação a LDC. Especificamente em CS, descobriu-se que a ATC estimula a glicólise e induz aumento nos níveis intracelulares de vários aminoácidos (leucina, isoleucina, valina, fenilalanina, metionina, histidina, tirosina e glicina), cuja concentração diminuiu nas células tratadas com LDC. Além disso, a expressão de proteínas de estresse de retículo e de apoptose foram encontradas nas células tratadas com ATC. Assim, o estudo in vitro da metabolômica identificou respostas metabólicas diferenciais que nos permitem questionar se sua toxicidade da ATC é a mesma que a de aos outros AL. Parte 2: Nesta parte, utilizou-se de forma associada o planejamento experimental (DoE) e modelo de peixe-zebra para selecionar o melhor excipiente funcional, óleo de copaíba (OC) e uma formulação otimizada de NLC-ATC. A formulação otimizada foi caracterizada por DSC, DRX e MET e in vivo, no modelo de dor inflamatória induzida por carragenina, promoveu aumento (50%) da atividade anestésica e prolongamento da ação, em comparação com ATC livre, com a ação sinérgica (entre OC e ATC) no controle da dor inflamatória. Além disso, os resultados de farmacocinética, utilizando microdiálise in situ, identificaram que o maior efeito anestésico decorre da liberação prolongada do AL pela NLC-ATC no tecido inflamado, evitando sua remoção sistêmica acelerada, em resposta ao processo inflamatório. Assim, a formulação NLC-ATC (funcionalizada e otimizada) apresentou resultados promissores contra a falha anestésica em tecido inflamado, constituindo possível opção inovadora para o mercado odontológico Abstract: Articaine (ATC) is one of the new local anesthetics (LA) released in the market, although it is already the second most used LA in the dental clinic. While it is considered an anesthetic of the amino-amide type, it has some chemical peculiarities such as a thiophene ring and an ester group, which bring some advantages, namely its use in a higher clinical concentration. Although all LAs present neurotoxicity, there are reports of a higher rate of paresthesia associated with the use of ATC. However, the reason for this is not clear and there is no concise literature about the greater neurotoxicity of ATC compared to other LAs. In addition, another problem related to dental anesthesia is the anesthetic failure, or a lower degree of analgesia, that can occur in places with an inflammatory process. In this case, the clinical treatment becomes extremely painful, stressful and without alternatives for effective pain control. Given these two perspectives about LAs, the focus of this work was the use of toxicometabolomics to deepen the knowledge about the neurotoxicity of ATC in relation to lidocaine (LDC) (Part 1) and the development of formulations of nanostructured lipid carriers (NLC) for sustained release of ATC to increase its anesthetic potency in inflamed tissue (Part 2). Part 1: In this part, we used Proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) metabolomics to study the biological effects of ATC in relation to LDC (LDC, "gold standard") through the detection of metabolic changes caused in neuronal cells. Despite the literature indicating that there are no differences between ATC and other LAs in relation to in vitro toxicity, metabolomics analysis in Schwann cells (SC) showed that ATC produces different metabolic changes in relation to LDC. Specifically, ATC was found to stimulate glycolysis and to induce increases in intracellular levels of several amino acids (leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, methionine, histidine, tyrosine, and glycine), while the concentration of these amino acids decreased in lidocaine-treated SC. In addition, ATC produces greater changes in the rate of cellular oxygen consumption compared to LDC. Besides, the expression of proteins indicates the presence of reticulum stress and apoptosis in ATC-treated cells. Thus, the in vitro metabolomics study of ATC identified differential metabolic responses which allow us to question whether its toxicity is the same in relation to other LAs. Part 2: In this part, Design of Experiments (DoE) and zebrafish model were used to select the best functional excipient, copaiba oil (CO), and to obtain an optimized formulation of NLC-ATC. Afterwards, optimized NLC-ATC were characterized by DSC, XRD and MET. In vivo, in the carrageenan-induced inflammatory pain model, NLC-ATC showed an increase (50%) in the anesthetic activity and a prolonged action time compared to free (non-encapsulated) ATC, with synergistic activity between ATC and CO being observed on inflammatory pain control. In addition, using local tissue microdialysis, the pharmacokinetic results revealed the greatest anesthetic effect to be associated with the ability of prolonged delivery of ATC by NLC-ATC in the inflamed tissue, preventing its accelerated systemic removal due to the inflammatory process. Thus, the functionalized NLC-ATC formulation developed showed promising results in relation to anesthetic failure in inflamed tissue, with an innovative perspective for the dental market Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2017/15174-5 CNPQ 142331/2017-1

Orientadores: Eneida de Paula, Márcia Cristina Breitkreitz Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O baixo tempo de ação e toxicidade sistêmica dos anestésicos locais (AL) limitam sua aplicação clínica. Bupivacaína é o AL mais frequentemente usado em procedimentos cirúrgicos, no mundo. A descoberta que o seu enantiômero S(-) é menos tóxico que o R(+), levou a introdução no mercado de produtos com excesso enantiomérico (bupivacaína S75:R25, aqui representada por BVCS75). Porém, o tempo de ação da bupivacaína ainda é curto; para superar isto, BVCS75 foi encapsulada em carreadores lipídicos nanoestruturados (NLC). Este trabalho apresenta o desenvolvimento de uma formulação usando métodos quimiométricos de planejamento experimental para estudo dos componentes da formulação e espectroscopia Raman de imagem, para estudar a miscibilidade dos lipídios sólidos e líquidos. A formulação selecionada de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo bupivacaína S75:R25 (NLCBVC) mostrou-se físicoquimicamente estável, por 12 meses à temperatura ambiente, em relação ao tamanho de partículas, índice de polidispersão (PDI), potencial Zeta e eficiência de encapsulação. A caracterização por DSC, XDR e MET confirmou a encapsulação da BVCS75 na matriz lipídica, sem mudanças na estrutura das nanopartículas. No estudo de liberação in vitro as NLC prolongaram o tempo de liberação do AL para 28 h, e no teste de efeito anestésico in vivo o tempo de ação duplicou em relação à BVCS75 livre. Além de melhorar o tempo de ação, não foi encontrada diferença estatística significativa no bloqueio do nervo ciático de ratos entre NLCBVC 0,125% e BVCS75 0,5%. Assim, a formulação permite a redução da dose de anestésico, diminuindo a toxicidade sistémica da bupivacaína, e abrindo novas possibilidades para futuras aplicações clínicas Abstract: The short time of action and systemic toxicity of local anesthetics limit their clinical application. Bupivacaine is the most frequently used local anesthetic in surgical procedures worldwide. The discovery that its S(-) enantiomeric form is less toxic than the R(+) form led to the introduction of products with enantiomeric excess (S75:R25 bupivacaine) in the market. Nevertheless, the time of action of bupivacaine is still short; to overcome that, S75:R25 bupivacaine (BVCS75) was encapsulated in nanostructured lipid carriers (NLC). In this work, we report the development of a formulation, using Chemometric tools (experimental design) to study the formulation factors, and Raman mapping associated with classical Least Squares (CLS) to study the miscibility of solid and liquid lipids. The selected formulation of nanostructured lipid carriers containing bupivacaine S75:R25 (NLCBVC) was found stable for 12 months under ambient temperature, regarding particle size, polydispersion, Zeta potential and encapsulation efficiency. Its characterization by DSC, XDR and TEM confirmed the encapsulation of BVCS75 in the lipid matrix, without changing the nanoparticles structure. Encapsulation of BVCS75 in the nanoparticles prolonged its in vitro release for up to 28 h. The in vivo analgesic effect elicited by NLCBVC was twice that of free BVCS75. Besides improving the time of action, no statistical difference in the blockage of the sciatic nerve of rats was found between 0.125% NLCBVC and 0.5% free BVCS75. Therefore, the formulation allows a reduction in the required anesthesia dose, decreasing the systemic toxicity of bupivacaine, and opening up new possibilities for different clinical applications Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 2014/14457-5 CNPQ G.H.R.S