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Nas últimas cinco décadas, vários grupos de pesquisa vêm se dedicando a estudar o enovelamento das proteínas. Elas são macromoléculas biológicas codificadas linearmente pelos ribossomos e seu enovelamento ocorre espontaneamente e em um curto intervalo de tempo. A teoria da superfície de energia ajudou a superar esse paradoxo ao comparar o processo de enovelamento com uma difusão de estados em um funil de energia rugoso e multidimensional. Essa teoria vêm sendo aplicada com sucesso nos mais diversos contextos, como o enovelamento de proteína, cadeias de ácido nucleico, e mudanças conformacionais de proteínas, ácidos nucleicos e dos ribossomos. Simulações do modelo baseado na estrutura estão fundamentadas na teoria do funil de energia e são analisadas pelas trajetórias de uma coordenada de reação, escolhida para descrever o processo simulado. Neste trabalho, o método estocástico DrDiff de determinação dos coeficientes de drift, difusão e energia livre dependentes da coordenada, é comparado com outras metodologias disponíveis, utilizando um sistema difusivo ideal e dados de simulações de enovelamento/desenovelamento da proteína príon. Viu-se, em todos os contextos, que o método DrDiff obteve excelentes resultados, recuperando os parâmetros de entrada do sistema difusivo ideal, e extraindo o perfil de energia livre da príon. Também foi possível obter o formato de “X” do tempo de primeira passagem e o comportamento linear do tempo de passagem pelo estado de transição, calculados usando os coeficientes de drift e difusão obtidos pelo algoritmo DrDiff. O DrDiff também foi aplicado na análise da trajetória de experimentos de espectroscopia de força em um RNA hairpin e na proteína BR. Os perfis de energia livre obtidos concordaram com os mais refinados resultados apresentados nos respectivos trabalhos experimentais, e os coeficientes de difusão calculados ofereceram um insight do possível efeito do aparato nas medidas. O modelo baseado na estrutura tipo SMOG também pode ser utilizado para simular a dinâmica dos ribossomos, motores macromoleculares, compostos por cadeias proteicas e de ácido nucleico. Durante o processo de síntese das proteínas, os ribossomos passam por enormes mudanças conformacionais descritas pela rotação da sua subunidade menor. Todos os trabalhos teóricos até hoje disponíveis tratavam da rotação dos ribossomos procariotas, menores e mais simples que os eucariotas. Nesse trabalho são reportadas rotações da subunidade menor do ribossomo da levedura Saccharomyces cerevisiae. Foram obtidas rotações reversíveis e não enviesadas, iniciando de ambos os estados (rotacionado e não-rotacionado), usando um único campo de força tipo SMOG modificado. As estruturas médias em cada estado são altamente correlacionadas com as estruturas iniciais correspondentes e os perfis de energia livre obtidos para as trajetórias do ângulo da subunidade menor indicam uma escala temporal comparável aos dados experimentais. As análises feitas até aqui e com as que estão em andamento irão auxiliar na determinação do papel dos efeitos entrópicos e estéricos na rotação do ribossomo eucariota, e traçar paralelos entre ele e seu similar procariota. Over the last five decades, several research groups have been studying the protein folding problem. Proteins are biological molecules linearly synthesized by the ribosomes, and their folding process happens spontaneously and in a short time lapse. The energy landscape theory has helped to overcome this paradox by comparing the folding process to the diffusion of ensembles over the rough multidimensional energy funnel. This theory has been applied to a range of contexts, from folding in proteins and nucleic acids, through conformational changes up to the ribosome dynamics. Structure-based model simulations are underpinned by the energy landscape theory, and the resulting trajectories are analyzed using a reaction coordinate chosen to describe the processes. In this work, the stochastic method for coordinate-dependent drift, diffusion, and free energy coefficients evaluation called DrDiff is compared with other available methods, using both an ideal diffusive system and the PrP protein folding/unfolding simulation data. DrDiff method has shown reliable results in recovering the ideal diffusive system inputs and the PrP free energy profile. The folding/unfolding “X” shape time and the linear transition path time trend were obtained using drift and diffusion coefficients resolved by the DrDiff method. The DrDiff method was also applied to analyze force spectroscopy experiment data from two cases: the RNA hairpin and the BR protein. The captured free energy profiles were similar to the most refined results shown in the respective original works, and the obtained diffusion coefficients offered some insights into the possible role of the apparatus in the measure. The SMOG structure-based model has also been applied to simulate the ribosome dynamics. Ribosomes are macromolecular motors formed by protein and nucleic acid chains complexed. During the protein synthesis, they overcome massive conformational changes described by their small subunit body rotation. Most theoretical papers currently available are focused on prokaryotic ribosome aspects. The eukaryotic ribosomes are bigger, more complex, and less studied. In this work, simulations of small subunit body rotation are reported for the yeast (Saccharomyces cerevisiae) ribosome. Beginning from both rotated and unrotated structures, these simulations have shown reversible and unbiased rotations using a modified SMOG force field. The average structures associated with each state have shown a high correlation with their respective initial structure. Besides that, the obtained free energy profiles suggest a timescale comparable to experimental results. While the data analysis is still in progress, the results may help to establish the role of entropic and steric effects on yeast small subunit body rotation and compare to the prokaryotic ribosome results. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Submitted by ANGÉLICA HOLLUNDER KLIPPEL null (angelicahklippel@yahoo.com.br) on 2017-10-03T18:02:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Angélica Hollunder Klippel_ repositório.doc: 34816 bytes, checksum: 73436168e63b674c7897cf716f5f4f68 (MD5) Rejected by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão do trabalho submetida ao Repositório Institucional UNESP deve conter o texto completo. A equipe do Repositório se encarregará de disponibilizar apenas o conteúdo parcial que segundo a Portaria UNESP 396 de 10 de setembro de 2015 consiste em: Artigo 3º V - conteúdo parcial: as páginas pré-textuais (a folha de rosto, a dedicatória, os agradecimentos, a epígrafe, o resumo na língua vernácula, o resumo em língua estrangeira, as listas de ilustrações, de tabelas, de abreviaturas, de siglas e de símbolos e o sumário), a introdução, a conclusão ou as considerações finais e as referências do trabalho. Lembrando que: é necessário informar no formulário de submissão que a versão do trabalho a ser disponibilizada deve ser a parcial e indicar em quanto tempo a versão integral deverá ser disponibilizada, ao atingir a data limite o sistema automaticamente disponibilizará a versão completa do trabalho. Caso necessite prorrogar o prazo para disponibilização do texto completo, de acordo com o artigo 6º da Portaria UNESP 396: A data para a disponibilização do conteúdo integral poderá ser prorrogada por até mais 2 (dois) anos mediante a apresentação, via ofício, de justificativa pelo Autor ao programa de pós-graduação com no mínimo 90 (noventa) dias de antecedência à data informada para a disponibilização do conteúdo integral. A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Corrija estas informações e realize uma nova submissão contendo o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2017-10-03T18:28:53Z (GMT) Submitted by ANGÉLICA HOLLUNDER KLIPPEL null (angelicahklippel@yahoo.com.br) on 2017-10-03T19:10:41Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Angélica Hollunder Klippel Depósito.pdf: 4077140 bytes, checksum: 24b0981f59b42809900ce573e066499a (MD5) Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-10-04T19:53:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 klippel_ah_me_arafcf_par.pdf: 1063725 bytes, checksum: d51927cf546bf2bd668ee8ba81d8343c (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-04T19:53:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 klippel_ah_me_arafcf_par.pdf: 1063725 bytes, checksum: d51927cf546bf2bd668ee8ba81d8343c (MD5) Previous issue date: 2017-09-04 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O fator de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e sofre uma modificação pós-traducional única e essencial chamada hipusinação. Embora tenha sido sugerida inicialmente uma função para eIF5A no início da tradução, foi na etapa de elongação que sua função foi melhor demonstrada. Estudos prévios mostraram que eIF5A tem algum papel na translocação de proteínas pela via co-traducional e que mutantes desse fator possuem níveis aumentados de proteínas envolvidas com o estresse de retículo endoplasmático (RE). Desta forma, nesse trabalho, foi estudada a correlação entre eIF5A e a via de resposta ao estresse de RE (Unfolded Protein Response - UPR). Considerando que o fator de transcrição Hac1 é um elemento essencial da via UPR em Saccharomyces cerevisiae, foi inicialmente verificado se eIF5A afetava o splicing citoplasmático do mRNA de HAC1, o qual é dependente da ativação de Ire1, um sensor de proteínas desenoveladas no interior do RE. Para isto, foi realizada a quantificação dos níveis de mRNA maduro e imaturo de HAC1 por meio de ensaios de qPCR e RT-PCR semiquantitativa, análises estas que não revelaram qualquer diferença de comportamento do mutante hyp2-3 de eIF5A em relação ao selvagem. Por outro lado, diferentes mutantes de eIF5A mostraram sensibilidade a DTT e resistência a tunicamicina, um comportamento ainda não descrito na literatura e que difere de mutantes da via de SRP (via co-traducional de translocação de proteínas para o RE). Além disso, este comportamento de mutantes de eIF5A não foi modificado pela superexpressão dos componentes de SRP. Ainda, o fenótipo de mutantes de eIF5A frente ao DTT e à tunicamicina difere daquele de linhagens que apresentam nocaute de proteínas ribossomais, nocaute de um fator de biogênese de ribossomo ou de um mutante dominante-negativo de eEF2 (translation elongation factor 2). Assim, estes resultados sugerem que a sensibilidade ao DTT e a resistência à tunicamicina, com a diminuição da função de eIF5A, não esteja diretamente relacionada com a via de SRP ou a um defeito geral na tradução. Também foi demonstrado que o fenótipo de resistência a tunicamicina dos mutantes de eIF5A não depende de Ire1 ou Hac1. Para entender melhor estes fenótipos dos mutantes de eIF5A, foi realizada uma determinação do perfil proteômico (utilizando a estratégia de Synthetic Genetic Array e a coleção GFP de S. cerevisiae) do mutante hyp2-3 na presença de DTT, tunicamicina ou na condição controle sem tratamento. A análise destes resultados revelou proteínas que estão diminuídas no mutante hyp2-3 em relação ao selvagem e que podem contribuir para explicar os fenótipos observados. Por fim, a análise deste perfil proteômico, assim como de outros dados obtidos nesse trabalho, não sugerem uma pré-ativação de UPR perante a diminuição da função de eIF5A em S. cerevisiae, como observado em um trabalho recente com células HeLa. The eukaryotic translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in archaea and eukaryotes and undergoes a unique and essential post-translational modification called hypusination. Although a function for eIF5A was initially suggested at the initiation of translation, it was in the elongation step that its function was best demonstrated. Previous studies have shown that eIF5A has a role in protein translocation by the co-translational pathway and that mutants of this factor have increased levels of proteins involved with endoplasmic reticulum (ER) stress. Therefore, in this work, the correlation of eIF5A with the stress response pathway of ER (the Unfolded Protein Response - UPR) was studied. Considering that the Hac1 transcription factor is an essential element of the UPR pathway in Saccharomyces cerevisiae, it was first verified whether eIF5A affects the cytoplasmic splicing of the HAC1 mRNA, which is dependent on the activation of Ire1, a sensor of unfolded proteins in the RE. To test it, we did the quantification of the mature and immature mRNA levels of HAC1 by means of qPCR and semi-quantitative RT-PCR assays, which did not reveal any difference in the behavior of the eIF5A mutant hyp2-3 in comparison to the wild-type. On the other hand, different mutants of eIF5A show sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin, a behavior not yet described in the literature and that differs from mutants of the SRP pathway (co-translocation pathway for RE) and also this behavior of eIF5A mutants was not modified by overexpression of SRP. In addition, the eIF5A mutant phenotype in DTT and tunicamycin differs from that of knockout strains of ribosomal proteins, knockout of a ribosome biogenesis factor or a dominant-negative mutant of eEF2 (translation elongation factor 2). Thus, these results suggest that the sensitivity to DTT and resistance to tunicamycin upon decreased eIF5A function is not an effect related to the SRP pathway or a general translation defect. Furthermore, the tunicamycin resistance phenotype of the eIF5A mutants has been shown to be Ire1 or Hac1 independent. To better understand these UPR-related eIF5A phenotypes, we determined the proteome profile (using the Synthetic Genetic Array strategy and the S. cerevisiae GFP colection) of the hyp2-3 mutant on treatment with DTT, tunicamycin or in the untreated control condition. Analysis of these results revealed proteins that are decreased in hyp2-3 when compared to the wild-type and that could contribute to explain the phenotypes observed for this mutant. Finally, analysis of this proteomic profile and other data from this study do not suggest a pre-activation of UPR with the decrease of eIF5A function, as observed in a recent work using HeLa cells. FAPESP: 2015/07728-5