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The molecular pathways of DNA repair in tumors may play a role in tailoring patient therapy. The Fanconi anemia DNA repair pathway operates in the repair of DNA interstrand crosslink induced by several chemotherapeutic drugs. In this study we evaluated the expression of Fanconi anemia DNA repair genes (FANCA, C, D2, F, BRCA1 and PALB2) in 46 primary breast tumors and ten non-compromised breast samples, by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR, and to correlated gene expression with breast cancer subtypes and clinico-pathological parameters. Tumor samples were classified in subtypes based on immunohistochemistry markers, and clinico-pathological parameters were obtained from the medical reports. FANCD2 was twice more expressed in tumors than in the non-compromised group (p= 0.02). BRCA1 showed a differential expression in the luminal group, three times less expressed in Luminal-B than in Luminal-A group (p= 0.01). In conclusion, the higher level of expression of FANCD2 in tumors may indicate activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway, which has been implicated in breast carcinogenesis and in chemotherapeutic resistance. The loss of BRCA1 expression in the Luminal-B group may indicate that the use of cisplatin-based neo/adjuvant therapies is preferable, and that the use of taxol-based therapies should be avoided due to the risk of drug resistance.

Objetivos: Descrever os achados oftalmológicos, dermatológicos e de microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) de nova distrofia macular associada à síndrome dos cabelos anágenos frouxos (SCAF). Métodos: Uma família de sete pacientes, quatro deles afetados, foi examinada. Os pacientes foram submetidos ao exame oftalmológico completo, teste de cores (Ishihara e Farnsworth D-15), ecografia, angiografia, exames laboratoriais e dermatológico, teste do suor, microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura dos fios de cabelo. Resultados: Em duas irmãs afetadas encontramos no fundo de olho dispersões pigmentares em pólo posterior da retina, com estafiloma da mácula. Em dois irmãos foram encontradas as mesmas dispersões pigmentares em pólo posterior, com maior pigmentação e coloração amarelada em área macular e sem estafiloma. A avaliação na microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura dos indivíduos afetados confirmou a SCAF. Em uma mulher e em um homem não afetados todos os exames foram normais, exceto que na MO e MEV encontramos algumas semelhanças com os indivíduos afetados. Quanto ao modo de herança, o heredograma é compatível com herança autossômica recessiva com expressão parcial no heterozigoto. Conclusões: Há somente um relato na literatura internacional da associação de SCAF e coloboma ocular. Neste trabalho descrevemos os achados de nova distrofia macular associada à síndrome dos cabelos anágenos frouxos, distrofia cujos achados fundoscópicos são diferentes entre homens e mulheres. Por se tratar do primeiro relato na literatura, os achados descritos sugerem fortemente que esta associação pode ser parte de uma nova entidade nosológica. Purpose: To describe the ophthalmological, dermatological, light microscopy (LM) and scanning electron microscopy (SEM) findings of a new macular dystrophy associated with the loose anagen hair syndrome (LAHS). Methods: A family of seven patients, four of them affected, was examined. The patients underwent a complete ophthalmological examination, color test (Ishihara and Farnsworth D-15), ecography, angiography, laboratory and dermatological tests, sweat test, light microscopy and scanning electron microscopy of the hair. Results: In two affected sisters we found on eye fundoscopy pigmentary dispersions in the posterior pole of the retina, with macular staphyloma. In two brothers, the same pigmentary dispersions in the posterior pole was found, with more pigmentation and a yellow coloring in the macular area and without staphyloma. The light microscopy and scanning electron microscopy evaluation of the affected individuals confirmed loose anagen hair syndrome. In a not affected woman and man all examinations were normal, except the light microscopy and scanning electron microscopy that showed some similarities with the affected individuals. As for the way of inheritance, the pedigree is compatible with autosomal recessive inheritance with partial expression of the heterozygote. Conclusions: There is only one report in the international literature of loose anagen hair syndrome association with ocular coloboma. In this study we describe the findings of a new macular dystrophy associated with the loose anagen hair syndrome, a dystrophy whose fundoscopy findings are different between men and women. Since it is the first report in the literature, the described findings strongly suggest that this association can be part of a new nosological entity.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadoras: Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro e Drª. Talita Helen Bombardelli Gomig Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 18/03/2022 Inclui referências Resumo: O câncer de mama é uma doença com altos índices de incidência, mortalidade e impactos sociais e econômicos. Os tumores mamários são classificados em subtipos, visando direcionar o tratamento e predizer o prognóstico dos pacientes, porém, a classificação atual, baseada em quatro marcadores imunoistoquímicos, não é suficiente para uma classificação satisfatória destes tumores. Além disso, as características biológicas que geram as diferenças entre tumores não são completamente conhecidas. Neste sentido, as tecnologias proteômicas e interatômicas têm grande relevância, tanto na investigação das diferenças biológicas entre subtipos através da identificação de proteínas diferencialmente expressas, as quais influenciam vias e processos relacionados com as diferenças clínicas e biológicas dos subtipos, quanto na identificação de marcadores proteicos que possam complementar e otimizar a classificação e discriminação entre subtipos. Neste estudo, mais especificamente no capítulo 1, métodos proteômicos baseados em espectrometria de massas LC-MS/MS livre de marcação foram utilizados para obtenção e comparação do proteoma total de tumores mamários de diferentes subtipos (luminal A, Luminal B, HER2+ enriquecido e triplo negativo) e, através da aplicação de análises computacionais de enriquecimento funcional e de predição de interatoma, a relevância biológica de proteínas diferencialmente expressas foi evidenciada. Além disso, a tecnologia de machine learning baseada em supported vector machines foi aplicada para a obtenção de painéis proteicos com potencial para servirem como painéis de discriminação e de classificação de tumores mamários em subtipos. Proteínas diferencialmente expressas (DEPs) puderam ser identificadas entre todos os subtipos, identificando oncogenes e supressores de tumor que possuem padrões de expressão que variam segundo a subdivisão entre subtipos. Através das análises de enriquecimento, os contextos biológicos nos quais se incluem estas DEPs puderam ser explorados, sendo identificados processos e vias biológicas que possuem níveis de atuação e ativação/inativação que diferem segundo o subtipo do tumor, incluindo alterações, por exemplo, nas vias de endocitose mediada por clatrinas, metabolismo de glucose e carboidratos, citoproteção por HMOX1 e regulação da estabilidade e atividade de PTEN. Os painéis proteicos aqui propostos obtiveram bom desempenho, alcançando taxas de falso-positivos sempre menores que 10%, e sensibilidade e especificidade sempre maiores que 75%. O capítulo 2 desta dissertação, por sua vez, traz análises sobre as proteínas ribossomais (RPs) no contexto do câncer de mama, trazendo novas informações acerca do padrão de expressão proteômico e transcriptômico das RPs, bem como de seu potencial para predição de prognóstico e do o panorama funcional e mutacional das RPs no câncer de mama. Abstract: Breast cancer is a disease with high rates of incidence, mortality, and social and economic impacts. The mammary tumors can be classified into subtypes, aiming to manage patient treatment and predict patient prognostics, however, the actual classification method, based in four immunohistochemical markers, is not sufficient to a satisfactory classification of the tumors. Furthermore, the biological characteristics involved in the differences between subtypes are not fully known. In this context, proteomic and interatomic technologies have great relevance both in the investigation of the biological differences between subtypes through the identification of differentially expressed proteins, which influence biological pathways and processes related to clinical and biological differences among the subtypes, and in the identification of proteic biomarkers that can be used to complement and optimize the classification and discrimination between subtypes. In this study, more specifically in chapter 1, label free mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) based proteomics was applied to obtain and compare total proteomes of breast tumors of different subtypes and, through application of computational enrichment analysis and interatomic predictions, the biological relevance of the differentially expressed proteins (DEPs) was investigated. Further, machine learning-based technologies were applied to obtain proteic panels with the potential to discriminate and classify breast tumors in subtypes. We found DEPs in thecomparisons of all subtypes, identifying oncogenes and tumor suppressor genes with expression patterns that vary accordingly with the subtype classification. Through the enrichment analysis, the biological context in with the DEPs take part was explored, being that processes and pathways that shows differential behavior among the subtypes were found, including, for example, clathrinmediated endocytosis, glucose and carbohydrates metabolism, HMOX1 mediated cytoprotection and PTEN stability and activity regulation. The proteic panels proposed achieved great performances, both in the cross-validation and in the independent cohort validation, reaching rates of false-positives under 10%, and sensibility and specificity over 75%. The chapter 2, in turn, describes the analysis about the ribosomal proteins (RPs) in breast cancer, contributing with new data about the RPs proteomic and transcriptomic expression pattern, as well about its potential as prognostic markers and mutational and functional landscape in breast cancer.

Orientadora: Profa. Dra. Jaqueline Carvalho de Oliveira Coorientadora: Profª. Drª. Enilze M. S. F. Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/01/2020 Inclui referências: p. 180-195 Resumo: No mundo todo, o câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mulheres e compreende um grupo heterogêneo de doenças, resultando em prognósticos e respostas clínicas distintas. Atualmente existem vários sistemas de classificação, sendo um dos mais usados o baseado em imunoistoquímica. Nessa classificação os tumores de mama são divididos em quatro grupos principais: luminal A, luminal B, HER2+ e triplo negativo. Apesar da classificação, ainda há uma heterogeneidade dentre os pacientes de cada grupo, fazendo com que o curso da doença e a resposta ao tratamento se diversifique. No genoma humano, foram identificadas 481 regiões ultraconservadas (UCRs) que apresentam 100% de identidade entre humanos, camundongos e ratos, e também com alta taxa de conservação em outras espécies. Tais regiões possuem de 200-781 pares de bases. Essas regiões podem ser transcritas (TUCRs: transcribed ultraconserved regions), e alterações em seus perfis de expressão têm sido associados a doenças, incluindo alguns tipos de tumores, porém, pouco se sabe da influência dessas regiões no câncer de mama. Além disso, apenas 4% dos transcritos foram totalmente descritos. Na busca por entender melhor o papel desses transcritos no desenvolvimento do câncer de mama, o nível de expressão das 481 T-UCRs foi analisado através de dados depositados no banco TCGA (The Cancer Genome Atlas). Através dessa análise foi verificado que a expressão diferencial de 302 (~63%) das T-UCRs estão associadas com algum parâmetro envolvido no desenvolvimento do câncer de mama como: subtipo molecular (43,45%), receptor de estrógeno (35,76%), receptor de progesterona (32,85%), amplificação de HER2 (16,63%), estadiamento (12,47%), terapia (36,59%) e sobrevida (9,56%). Dessas regiões analisadas fizemos um filtro em busca de regiões que estavam expressas em mais de 80% da amostra, localizadas em regiões intronicas e intergênicas, e qua apresentavam diferença de expressão enre subtipos para a confirmação da diferença de expressão em pacientes brasileiras (n=102) por RT-qPCR, e obtivemos a confirmação da diferença de expressão entre subtipos das regiões uc.147 e uc.193. O transcrito uc.147 está em uma região intrônica do gene LRBA, sendo transcrita no sentido contrário desse gene, e com expressão restrita ao núcleo. Já o transcrito uc.193 está na região 3'UTR do gene SYNCRIP, transcrita no sentido oposto desse gene, e com localização predominante citoplasmática. Adicionalmente, o aumento de expressão da uc.147 foi associada com uma pior sobrevida entre os pacientes luminal A. Com as técnicas de northern blotting e rapid amplification of cDNA ends (RACE), identificamos e descrevemos um transcrito de ~2800nt para a uc.147. O silenciamento da uc.147 nas linhagens celulares do subtipo luminal CAMA-1 e BT474, diminuiu a viabilidade celular. Além disso, na linhagem luminal A CAMA- 1, esse silenciamento também provocou uma diminuição na formação de colônias, aumentou a apoptose e provocou uma parada na fase G1 do ciclo celular. Essas alterações não foram vistas quando o gene LRBA foi silenciado, sugerindo um importante papel do uc.147 em câncer de mama. Adicionalmente, através do ensaio de pull-down nós observamos que existem muitas proteínas que interagem fisicamente com o transcrito e estão envolvidas no processo de tumorigênese. Esse trabalho é o primeiro a fazer uma análise global das T-UCRs em câncer de mama, e o primeiro a caracterizar e sugerir uma importante função 9 ao uc.147, além de apresentar um potencial como biomarcador de prognóstico no câncer de mama. Palavras-chave: Câncer de mama. T-UCRs. Biomarcadores. Tumorigênese. Abstract: Breast Cancer (BC) is the most commonly diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among women. BC is a heterogeneous disease with a rage of clinical and molecular characteristics. There are many classification systems for BC. Based on immuno-histochemical analysis, BC is subdivided in four main groups: luminal A, luminal B, HER2 and triple negative. Although, the number of BC classification system and the stratification of patients improved the therapy, inside of each subtype, patients can still have different outcomes. So, the identification of new biomarkers is important to a better prognosis, and development of more specific therapy. There are 481 ultra-conserved regions (UCRs) described in the genome, being longer than 200bp and 100% conserved among human, rat, and mouse. Most UCRs are transcribed (T-UCR) and some are differentially expressed in tumors. In addition, T-UCRs have already been described participating of the tumorigenesis process. However, the influence that T-UCRs impose on BC remains unclear. Furthermore, only 4% of T-UCRs present information on molecular details. Through analysis of all T-UCRs in the TCGA (The Cancer Genome Atlas) BC data, we found 302 regions associated with important clinical features in BC: 43% associated with molecular subtype, 36% of estrogen-receptor-positive, 17% with ERBB2 expression, 12% with clinical staging and 10% with overall survival. Looking for regions that were expressed in more than 80% of the samples, located in noncoding region and with a greater difference among subtypes we chose 12 T-UCRs to confirm differential expression in Brazilian patients (n=102) by RT-qPCR. We confirmed the differential expression among subtypes in uc.147 and uc.193. Furthermore, the strand specific RT-qPCR indicated that uc.147 and uc.193 are transcribed in the opposite direction from their host genes, LRBA and SYNCRIP, respectively. RT-qPCR. Through subcellular fractionation we demonstrated that uc.147 is located in the nucleus and uc.193 is most cytosolic. Additionally, high expression of uc.147 is associated with poor survival in luminal A patients. Northern blotting results indicated that the uc.147 transcript is around 2800nt and its sequence was confirmed by rapid amplification of cDNA ends (RACE). In addition, the silencing of uc.147 in luminal cell lines CAMA-1 and BT474 reduces cell viability, and in luminal A CAMA-1 cells the silencing reduces colony formation, increases apoptosis, and arrests cells in G1 phase of cell cycle. The same effects are not observe knocking down the LRBA. Besides, using pull-down assay we discover that many proteins associated with tumorigenesis process are binding to uc.147. This study is the first screening of all T-UCRs in BC, the first to characterize uc.147, and demonstrate its potential as prognostic marker in BC. Keywords: Breast Cancer. T-UCRs. Tumorigenesis. Biomarker.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadoras: Prof.a Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro e Dra. Talita Helen Bombardelli Gomig Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 11/03/2020 Inclui referências: p. 79-92 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil é o segundo mais frequente (superado pelo de pele não melanoma). A heterogeneidade tumoral dessa neoplasia é uma das dificuldades que interferem na terapêutica precisa e consequentemente no prognóstico da doença. A imunoistoquímica classifica os tumores em subgrupos orientando a utilização do melhor tratamento. A utilização de biomarcadores é fundamental para uma classificação mais apropriada desta doença, considerando inclusive a facilidade de obtenção de amostras em fluidos, como sangue e biópsia, para a identificação de potenciais marcadores evidenciando a importância de estudos nessas amostras biológicas. Métodos proteômicos podem auxiliar na identificação de proteínas com alterações no perfil de expressão entre amostras biológicas distintas. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo obter o proteoma de tecidos mamários não tumorais: do tumor primário de mama (T) de pacientes diagnosticados com diferentes subtipos moleculares de câncer de mama (Triplo Negativo e Luminal B) para avaliar diferenças significativas na expressão proteica, de relevância na discriminação destes subtipos da doença. As amostras de tecidos mamários não tumorais, do tumor primário de mama e do linfonodo axilar metastático foram previamente processadas e preparadas para a espectrometria de massas e, em seguida, foram efetuadas a análise comparativa, a validação das proteínas e a anotação funcional. As comparações foram entre proteínas presentes entre subtipos (Triplo Negativo e Luminal B), a análise das proteínas diferencialmente expressas foi obtida através de testes estatísticos não paramétricos in-silico e a validação por técnicas moleculares. A anotação funcional das proteínas diferencialmente expressas e a predição de suas interações permitiu a seleção de alvos de interesse para o estudo do câncer de mama. Proteínas que apresentaram relevância funcional na tumorigênese e que constituam potenciais marcadores para a discriminação entre os subtipos foram avaliadas na literatura e em bancos de dados de interação proteica, sendo elas a Culina 3, B-catenina1 e Fibronectina 1. A validação da expressão proteica foi realizada através do método Western Blotting, demonstrando a expressão diferencial dessas proteínas entre subtipos distintos do câncer mama, a qual pode ter importância na progressão da doença, principalmente no que se refere a migração celular e invasão. Estudos adicionais envolvendo suas interações com outras proteínas poderão ampliar a compreensão das funções desempenhadas por essas proteínas no contexto do câncer de mama triplo negativo, evidenciando seu potencial como marcadores moleculares da doença. Abstract: Breast cancer is the most common type of cancer among women in the world and in Brazil is the second most frequent (surpassed by non-melanoma skin). The tumor heterogeneity of this neoplasm is one of the difficulties that interfere in the therapy accurately and consequently in the prognosis of the disease. Immunohistochemistry classifies tumors into subgroups guiding the use of the best treatment. The use of biomarkers is fundamental for a more appropriate classification of this disease, including considering the ease of obtaining samples in fluids, such as blood and biopsy, for the identification of potential markers evidencing the importance of studies in these biological samples. Proteomic methods can help identify proteins with changes in the expression profile between distinct biological samples. In this context, the present study aims to obtain the proteoma of non-tumor breast tissues: the primary breast tumor (T) of diagnosed patients with different molecular subtypes of breast cancer (Triple Negative and Luminal B) to evaluate significant differences in protein expression, of relevance in the discrimination of these subtypes of the disease. Samples of non-tumor breast tissues, primary breast tumor and metastatic axillary lymph node were previously processed and prepared for mass spectrometry and then comparative analysis, protein validation and functional annotation. The analysis of differentially expressed proteins was obtained through in-silic nonparametric statistical tests, and validation by molecular techniques, comparisons were between proteins present between subtypes (Triple Negative and Luminal B). Functional annotation of differentially expressed proteins and the prediction of their interactions allowed the selection of targets of interest for the study of breast cancer. Proteins that presented functional relevance in tumorigenesis and that constitute potential markers for discrimination between subtypes were evaluated in the literature and in protein interaction databases, which are Culina 3, B-catenine1 and Fibronectin 1. Protein expression validation was performed using the Western Blotting method, demonstrating the differential expression of these proteins among distinct subtypes of breast cancer, which may be important in the progression of the disease, especially with regard to cell migration and invasion. Additional studies involving their interactions with other proteins may broaden the understanding of the functions performed by these proteins in the context of triple negative breast cancer, evidencing its potential as molecular markers of the disease.

Orientadora: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientador: Dr. José Cláudio Casali da Rocha Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 13/03/2020 Inclui referências: p. 79-94 Resumo: A Síndrome de Lynch (SL) é uma das síndromes de predisposição hereditária ao câncer mais comuns. Ela tem herança autossômica dominante e é causada por mutação germinativa de um dos genes de reparo de malpareamento de bases, sendo os principais deles MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Os indivíduos com SL apresentam um risco aumentado para o desenvolvimento de vários tipos de tumor durante a vida, sendo os principais deles o câncer colorretal (CCR) e o de endométrio. O objetivo desse trabalho é caracterizar aspectos clínicos e moleculares das famílias com suspeita ou diagnóstico de SL desde a implantação do Serviço de Oncogenética do Hospital Erasto Gaertner, além de avaliar o acesso desses pacientes aos métodos diagnósticos da SL no contexto do Sistema Único de Saúde (SUS). Para isso, foram revisados retrospectivamente os prontuários de todos os pacientes atendidos no serviço entre julho de 2012 e dezembro de 2018, buscando pacientes que atendessem os critérios de inclusão propostos nesse estudo. Foram então incluídos 32 probandos, sendo 18 mulheres (56,3%) e 14 homens (43,7%), com idade média de 41,3 anos de idade ao diagnóstico do primeiro tumor. Apenas 43,3% dessas 32 famílias incluídas preenchia critérios de Amsterdam I/II. Cada um desses probandos teve de um a cinco tumores, num total de 57 tumores. Entre os 32 tumores índice, 84,4% pertenciam ao espectro da síndrome e 75% dos casos foram diagnosticados antes dos 50 anos de idade. Apenas dez desses probandos (31,2%) tiveram a oportunidade de realizar teste genético, apesar de todos os 32 terem a indicação por terem apresentado imunoistoquímica (IHQ) do tumor anormal ou história pessoal e/ou familiar sugestiva de SL. Os casos que não tiveram acesso a teste genético tiveram seu gene causal de SL inferido pelo resultado da IHQ, de modo que todos os 32 casos foram atribuídos a algum dos genes de reparo. Dos 32 casos, 13 (40,6%) foram atribuídos ao gene MSH2, 7 (21,9%) a MLH1, 7 (21,9%) a PMS2 e 5 (15,6%) a MSH6. Essa distribuição difere do sugerido pela literatura, principalmente devido a um excesso de casos relacionados a PMS2 (p=0.004) e escassez de MLH1 (p=0.005). Entre os dez pacientes que realizaram teste genético, cinco probandos não relacionados tiveram uma mesma mutação detectada - MSH2:c.2152C>T (p.Gln718*). Essa mutação foi relacionada a um efeito fundador num estudo recente em Portugal, mas ainda não foi descrito efeito fundador no Brasil. Essa população de estudo nunca havia sido incluída em estudos prévios sobre a SL no Brasil. Os achados desse estudo evidenciaram algumas barreiras à adequada identificação de famílias portadoras de SL no cenário do SUS. São necessárias estratégias para melhorar o rastreamento da SL e diagnóstico de indivíduos acometidos, assim como a identificação, captação e testagem dos familiares em risco, para que esse diagnóstico possa se traduzir na prevenção de câncer em maior escala. Abstract: Lynch Syndrome (LS) is among the most common hereditary cancer syndromes. It is an autosomal dominant disorder caused by a germline mutation in one of the mismatch repair genes, mainly MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Individuals with LS are at an increased lifetime risk for several types of tumors, but mostly colorectal and endometrial cancers. This study aims to describe clinical and molecular aspects of families suspected for or diagnosed with LS since the implementation of the Oncogenetics Department at Hospital Erasto Gaertner, and also to evaluate the access of these patients to molecular diagnostic methods within the context of the Brazilian Public Health System. For this purpose, we made a retrospective chart review of all patients seen at the Oncogenetics clinics from July 2012 to December 2018, aiming to identify patients who fulfilled inclusion Criteria for this study. Thus, 32 probands were included, comprising 18 females (56,3%) and 14 males (43,7%), with a mean age of 41,3 years at their first tumor diagnosis. Only 43,3% of these 32 families fulfilled Amsterdam Criteria I/II. Each one of the probands had one to five tumors diagnosed during their lifetime, for a total of 57 tumors. Among 32 index tumors, 84,4% were included in the tumor spectrum of the syndrome, and 75% of the cases were diagnosed at 50 years old or younger. Only ten of these probands (31,2%) had access to genetic testing, even though all of them had the indication to have it done due to abnormal immunohistochemistry (IHC) results or suspect personal and/or family history. Untested cases were assigned to a causal gene based on IHC results, so that all 32 cases were assigned to one of the mismatch repair genes. Out of 32 cases, 13 (40,6%) were assigned to MSH2, 7 (21,9%) to MLH1, 7 (21,9%) to PMS2 and 5 (15,6%) to MSH6. This distribution is inconsistent with data in the literature, mainly due to an excess of PMS2 cases (p=0.004) and a lack of MLH1 (p=0.005). Among ten patients who underwent genetic testing, five unrelated probands had the same mutation identified - MSH2:c.2152C>T (p.Gln718*). A founder effect has recently been described for this mutation in Portugal, but a founder effect has not yet been described in Brazil. The population of this study had not been included in previous studies regarding LS in Brazil. Our findings show there are some barriers to appropriate identification of LS families in the setting of the Brazilian Public Health System. Improvements are needed to a better screening and diagnosis of the syndrome, as well as for the identification and testing of relatives at risk. Such efforts are important to achieve cancer prevention and control in a larger scale.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadora: Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 22/02/2019 Inclui referências Resumo: O câncer de mama é o mais comum em mulheres no mundo e o segundo mais incidente em mulheres no Brasil, após o câncer de pele não melanoma. Em homens, é uma malignidade pouco frequente representando cerca de 1,8% dos casos de câncer de mama em geral. Tecnologias de alta resolução aliadas à bioinformática têm sido utilizadas como estratégias de estudo para auxiliar no diagnóstico, na seleção da terapia e no prognóstico do câncer. Nesse contexto, as análises de proteoma e interatoma consistem em importantes abordagens para evidenciar os principais processos biológicos associados à tumorigênese, uma vez que níveis de expressão proteica alterados podem influenciar vias celulares críticas e redes de interações, e comprometer a homeostase do ambiente tecidual, contribuindo para o desenvolvimento do câncer. Neste estudo, a espectrometria de massa baseada na quantificação livre de marcação, seguida da anotação/enriquecimento funcional e da predição de redes de interação proteína-proteína, foi realizada para obter um panorama do proteoma diferencial e seu contexto biológico funcional no câncer de mama feminino e masculino. Os níveis de expressão proteica dos tumores primários de mama foram avaliados simultaneamente aos linfonodos axilares metastáticos e tecidos mamários não tumorais para identificar as proteínas diferencialmente expressas entre esses tecidos. Análises in sílico dos dados proteômicos foram utilizadas para identificar as vias de sinalização e metabólicas, funções e processos biológicos mais relevantes, bem como redes de interação que envolvem proteínas com alteração de expressão. Os dados referentes à análise do câncer de mama feminino demonstraram um alto nível de similaridade no perfil proteômico de ambos os tecidos mamários não tumorais (contralateral e adjacente) e entre os malignos (tumor primário de mama e linfonodo axilar metastático). O contexto biológico geral dessa análise incluiu as vias de LXR/RXR, óxido nítrico, eNOS, eIF2 e sirtuínas; metabolismo de ácidos graxos; estresse oxidativo; funções relacionadas ao tumor; e o processo metastático; além de funções biológicas agrupadas nos hallmarks clássicos do câncer e em fenótipos de estresse, processos metabólicos e vias de sinalização. O proteoma comparativo do câncer de mama masculino, por sua vez, evidenciou várias proteínas diferencialmente expressas entre os tecidos analisados. Em geral, essa análise identificou as vias de sinalização de granzima B, sirtuínas, eIF2, citoesqueleto de actina, eNOS, cálcio e resposta de fase aguda relacionadas às proteínas com alteração de expressão. A análise proteômica comparativa adicional, realizada entre os tecidos de tumor mamário masculino e o de uma paciente do sexo feminino com o mesmo subtipo da doença e parâmetros clinicopatológicos similares, indicou um relevante conjunto de proteínas diferencialmente expressas, envolvido principalmente em processos relacionados ao câncer e na transdução de sinal. Ao todo, este estudo revela perfis proteômicos diferenciais em processos associados e interconectados de sinalização no câncer de mama feminino e masculino e fornece fontes de dados relevantes para a pesquisa do câncer, as quais podem contribuir para procedimentos clínicos no câncer de mama. Para isso, abordagens complementares e estudos de validação são recomendados para confirmar o potencial de proteínas individuais e/ou de vias como marcadores biológicos na tumorigênese mamária. Abstract: Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and the second most incident in women in Brazil, after non-melanoma skin cancer. In men, it is a rare malignancy accounting for about 1.8% of overall breast cancer cases. High-throughput technologies allied to bioinformatics have been used as study strategies to assist in the diagnosis, therapy selection, and prognosis of cancer. In this context, proteome and interactome analyses consist in important approaches to highlight the main biological processes associated with tumorigenesis, since the protein levels altered expression can influence critical cellular pathways and interactive networks, and compromise the tissue environment homeostasis contributing to cancer development. In this study, the mass spectrometry-based label-free quantification followed by functional annotation/enrichment and protein-protein interaction networks prediction were performed to obtain a landscape of the differential proteome and its functional biological context in the female and male breast cancer. Protein expression levels of the primary breast tumors were evaluated simultaneously with the corresponding metastatic axillary lymph nodes and the non-tumor breast tissues to identify the differentially expressed proteins among these tissues. In silico analyses of the proteomic data were used to identify the most relevant signaling and metabolic pathways, biological functions and processes as well as interaction networks related to the deregulated proteins. Data from female breast cancer analysis demonstrated a high level of similarity in the proteome profile of both non-tumor breast tissues (contralateral and adjacent) and between the malignant ones (primary breast tumor and axillary metastatic lymph nodes). The general biological context of this analysis included the pathways of LXR/RXR, nitric oxide, eNOS, eIF2 and sirtuins; fatty acid metabolism; oxidative stress; tumor-related functions; metastatic process; and to biological roles grouped into the classic hallmarks of cancer and in stress phenotypes, metabolic processes and signaling pathways. The comparative proteome of male breast cancer, on the other hand, highlights various differentially expressed proteins among the tissues analyzed. In general, this analysis identified the signaling pathways of granzyme B, sirtuins, eIF2, actin cytoskeleton, eNOS, calcium and acute phase response related to the deregulated proteins. The additional proteomic comparative analysis, performed between the tissues of the male breast tumor and the ones of a female patient matched for the breast cancer subtype and similar clinic-pathological parameters, indicated an interesting set of differentially expressed proteins, which were mainly involved in cancer-related biological processes and signal transduction. Altogether, this study reveals differential proteomic profiles in cancer associated and interconnected signaling processes in female and male breast cancers and provides relevant data sources for the cancer research, which can ultimately contributes to the clinical approaches in the breast cancer. Therefore, complementary approaches and validation studies are recommended to confirm the potential of individual proteins and/or pathways and cellular processes as biological markers in breast tumorigenesis.

Orientadora: Profª Drª Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/10/2017 Inclui referências: p. 84-100 Resumo: O câncer de mama é a neoplasia mais frequente em mulheres e apresenta o maior índice de mortalidade. A transição epitelial-mesenquimal (TEM) contribui para o processo metastático visto que é um evento onde células epiteliais neoplásicas ganham características mesenquimais. Para isso, uma série de mudanças podem ocorrer como alterações na expressão e no número de cópias dos genes. O gene VIM codifica a vimentina, uma proteína estrutural do citoesqueleto que contribui para a manutenção celular, garantindo a integridade citoplasmática, dando forma à célula e suporte às organelas. Quando a célula adquire a capacidade de deslocamento, a expressão de VIM se encontra alterada assim como a de CDH1. Este gene codifica a E-caderina, proteína que atua na adesão de células epiteliais apresentando baixa expressão quando relacionada com presença de metástase, diminuição da diferenciação do tumor e pior sobrevida. A análise da expressão destes genes e de dois mecanismos de regulação dos mesmos (número de cópias e status de metilação dos promotores) contribuirá para o entendimento da TEM em carcinomas primários de mama. As amostras (total de 137 tumores, 15 não tumorais e 28 linfonodos) foram cedidas pelo Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. As análises das expressões gênicas de CDH1 e VIM indicaram que nas amostras do sítio primário predominava o fenótipo epitelial. Posteriormente, foi observada a inversão das respectivas expressões com a progressão da doença, quando se analisou a expressão em linfonodo axilar metastático (2,85 para 0,30; 0,81 para 1,74, respectivamente para CDH1 e VIM). Foram analisados dois mecanismos que poderiam interferir na expressão gênica: o número de cópias gênicas e a metilação da região promotora. Para avaliar a variação do número de cópias foi utilizado PCR em tempo real, através da comparação com controle endógeno conhecido. Na análise de metilação da região promotora dos genes alvos foi utilizado o método de MSRE-PCR. Para o gene CDH1 verificou-se que a variação do número de cópias e a metilação parecem ter maior influência na regulação da expressão do que para o gene VIM. Em relação aos parâmetros clínicos e histopatológicos, verificou-se que a expressão dos genes e a alteração de seus números de cópias não são bons marcadores para distinguir subgrupos, porém o padrão de expressão é um forte indicador de progressão da doença. Palavras-chave: Câncer, transição, CDH1, VIM, TEM, gene, PCR Abstract: Breast cancer is the most frequent type of cancer in women and has the highest mortality rate. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) contributes to the metastatic process since it is an event where neoplastic epithelial cells gain mesenchymal characteristics. For this, a number of changes may occur like changes in expression and in number of copies of genes. The VIM gene encodes vimentin, a structural protein of the cytoskeleton that contributes to cell maintenance by ensuring cytoplasmic integrity, giving cell shape and organelle support. When the cell acquires displacement capacity, the expression of VIM is altered, as well as CDH1 expression. This gene encodes E-cadherin, a protein that acts on the adhesion of epithelial cells, presenting low expression when related to the presence of metastasis, decreased tumor differentiation and worst survival. The analysis of gene expression, copy number and promoter methylation status of these genes will contribute to the understanding of EMT in primary breast carcinomas. The samples were provided by Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. DNA extraction was performed using the Phenol-Chloroform method. Analysis of the CDH1 and VIM gene expression indicated that the epithelial phenotype predominated at the primary site samples. Subsequently, inversion of the respective expressions with disease progression was observed when the expression of metastatic axillary lymph node was analyzed (2.85 to 0.30, 0.81 to 1.74, respectively for CDH1 and VIM). Two mechanisms that could interfere with gene expression, number of gene copies and methylation of the promoter region, were analyzed. For the CDH1 gene it was found that the copy number variation and methylation appear to have a greater influence on the regulation of expression than for the VIM gene. Regarding the clinical and histopathological parameters, it was verified that the expression of genes and the alteration of their copy numbers are not good markers to distinguish subgroups, but the expression pattern is a strong indicator of disease progression. Keywords: Cancer, transition, CDH1, VIM, TEM, gene, PCR

Orientadora: Profa. Dra. Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientadores: Prof a. Dra. Danielle Malheiros Ferreira, Prof. Dr. Iglenir João Cavalli, Dra. Luciane Regina Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 25/10/2018 Inclui referências Resumo: O câncer de mama (CM) é a maior causa de morte por câncer em mulheres no mundo. A detecção precoce ainda é o fator determinante para um melhor curso da doença e aumento da sobrevida das pacientes e miRNAs derivados de vesículas extracelulares (VE-miRNAs) têm sido sugeridos como potenciais biomarcadores moleculares para o CM. Os VE-miRNAs estão associados a processos tumorigênicos no CM, como invasão, metástase e angiogênese, e a investigação de suas funções no contexto da doença é importante para uma melhor compreensão da patogênese. Apesar de uma série de marcadores moleculares terem sido descritos com potencial diagnóstico e prognóstico no CM, a utilização de VE-miRNAs como biomarcadores não é comprovada. Neste estudo, o objetivo foi avaliar o potencial diagnóstico e prognóstico de VE-MiRNAs isoladas de amostras de biópsias líquidas de pacientes com CM e controles, além de investigar a sua ação na modulação do potencial tumorigênico em linhagens celulares de mama. A expressão diferencial de VE-miRNAs foram identificadas por análise de RNAseq em amostras de soro de pacientes em comparação com controles. As VEs foram isoladas utilizando um kit de precipitação e o seu RNA extraído com kit comercial. A caracterização das VEs foram feitas por análise de rastreamento de partículas, microscopia eletrônica de transmissão e western blotting. O painel composto por alta expressão de miR-142-5p, miR- 320a e miR-4433b-5p, foi capaz de diagnosticar o CM com uma acurácia de 0,84 (sensibilidade de 93,33%, especificidade de 68,75%), e a combinação da alta expressão dos miR-142-5p e miR-320a gerou uma área sob a curva (AUC) de 0,94, com 100% de sensibilidade e 93,80% de especificidade para distinguir o subgrupo Luminal A. Foi verificado também que a baixa expressão dos miR-142-5p e miR-150-5p foi associada com grau de tumor 3 (p

Orientadora: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientadores: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli e Dr. Rodrigo Coutinho de Almeida Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/03/2018 Inclui referências: p.70-78 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente na população feminina brasileira, sem considerar os tumores de pele não melanoma e mundialmente é considerado a principal causa de morte por câncer entre as mulheres. Tumores têm alterações genéticas que afetam os produtos da expressão gênica e, neste contexto, os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel importante no desenvolvimento do câncer, modulando a expressão de oncogenes e genes supressores de tumor. Polimorfismos localizados em genes que codificam miRNAs são capazes de alterar sua interação com o substrato, o RNA mensageiro, interferindo, gerando ou removendo os sítios de ligação dos miRNAs e alterando seu nível de expressão. Essas variantes genéticas podem ser de grande impacto para a biologia pois cada miRNA regula diferencialmente um grande número de alvos. No presente estudo foi avaliado o polimorfismo rs2910164, localizado na região seed do miR-146a, em 326 pacientes portadoras de câncer de mama esporádico e em 411 controles sem histórico de neoplasias, provenientes de uma população brasileira da cidade de Curitiba, PR. Para a genotipagem dos pacientes e controles foi utilizada a técnica de PCRSSP e, para complementar, foram realizadas análises in silico para se acessar dados de expressão do MIR146A no banco de dados de câncer TCGA. A análise da variância e o teste do Qui-Quadrado foram utilizados, respectivamente, na comparação entre as médias das idades e na análise de parâmetros histopatológicos (invasão de linfonodos regionais, grau de diferenciação tumoral e subtipo imunoistoquímico) dentre os diferentes genótipos. O estudo de associação caso-controle indicou presença de associação positiva quando analisados os genótipos CC/GC versus o genótipo GG (OR=1,38 - IC95%=1,03- 1,85). O teste do Qui-Quadrado de homogeneidade também foi utilizado para o teste do modelo dominante do alelo de risco (C) corroborando o resultado do OR com ?²= 4,66 e p

Orientadora: Profa. Dra. Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientadores: Profa. Dra. Luciane R. Cavalli, Prof. Dr. Iglenir J. Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/03/2018 Inclui referências Resumo: As disparidades da saúde consistem em diferenças no status de saúde de indivíduos estratificados em grupos específicos devido a alguma característica ou fator epidemiológico específico. Os tumores mamários triplo-negativos (TNBC) constituem um subtipo de carcinoma mamário clinicamente agressivo, frequentemente diagnosticado em mulheres jovens e de grupos populacionais específicos como negras americanas, hispânicas e latinas. Essas diferenças na incidência e prognósticos do TNBC em determinadas populações indicam a existência de disparidades da saúde do câncer de mama. Os TNBC são um grupo bastante heterogêneo uma vez que são caracterizados apenas pela ausência de expressão dos receptores hormonais de estrogênio e progesterona, e a não superexpressão do HER2. Neste estudo, foram analisados os padrões de alterações de números de cópias de DNA (CNA) e de expressão de microRNA de amostras TNBC e não-TNBC (NTNBC) de pacientes negras americanas (AA), brancas americanas não-hispânicas (NHW) e brasileiras (LA). Um total de 164 amostras foi obtido do Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brasil) e do Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). A análise comparativa da expressão de microRNAs foi realizada entre os subtipos TNBC e NTNBC de cada grupo populacional, resultando em 194 miRNAs diferencialmente expressos (DEmiRNAs) entre as pacientes AA, 336 DEmiRNAs entre as pacientes NHW, e 163 DEmiRNAs entre as pacientes LA. A determinação dos DEmiRNAs entre as amostras AA TNBC e NHW TNBC resultou em 256 miRNAs diferencialmente expressos entre os dois grupos; a análise integrada com dados de CNAs das amostras AA TNBC resultou em um painel de 26 miRNAs que apresentaram dados concordantes de expressão de miRNAs e CNAs. Análises de curva de ROC indicaram um bom poder discriminatório desses miRNAs individuais e do painel em diferenciar as amostras AA TNBC e NHW TNBC. Análises de bioinformática indicaram que os 26 miRNAs podem estar envolvidos em vias de sinalização importantes na carcinogênese como via do PI3K-Akt, MAPK e Insulina. Entre os 26 miRNAs, o miR-150-5p foi selecionado para estudos funcionais que permitiram a determinação de seu potencial oncogênico no câncer de mama, principalmente em AA TNBC. A modulação da expressão do miR-150-5p através da utilização de inibidores e mimetizadores foi realizada seguida de análises da capacidade proliferativa (MTS e Ensaio Clonogênico), migratória, expressão de marcadores de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e resistência a tratamento. A análise integrada dos dados de expressão de miRNAs e CNAs das pacientes LA resultou em um painel de 17 miRNAs com dados concordantes das duas análises. Este painel apresentou alto poder de discriminar amostras TNBC e NTNBC de pacientes brasileiras, com valor de AUC de 0.953. Em resumo, foram observadas diferenças biológicas no nível molecular (DNA e RNA) entre os tumores mamários das três populações estudadas que podem auxiliar na elucidação das disparidades de saúde observadas. Estes resultados indicam que os miRNAs são importantes na tumorigênese mamária e a integração com dados de CNAs permitem uma seleção de miRNAs para estudos como biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e desenvolvimento de tratamentos. Palavras-chave: Câncer de mama. microRNAs. Disparidades de saúde. Abstract: Health disparities are differences in health status of individuals separated in specific groups because of specific characteristic or epidemiological factor. Triple negative breast cancer (TNBC) is a clinically aggressive subtype of breast cancer frequently presented in younger women from specific populations as African American, Hispanic and Latina. The differences in TNBC incidence and prognosis of specific populations show that breast cancer presents health disparities. TNBC is a highly heterogeneous group of diseases characterized by lack of expression of estrogen and progesterone receptors and lack of superexpression of HER2. In this study we analyzed DNA copy number alterations (CNA) and microRNAS expression patterns of TNBC and non-TNBC samples from African American (AA), non-Hispanic white (NHW) and Brazilian (LA) women. One hundred sixty four samples were obtained from Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brazil) and Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). Comparative analysis of miRNA expression were performed between TNBC and NTNBC samples of each population, resulting in 194 differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) between AA subgroups, 336 DEmiRNAs between NHW subgroups, and 163 DEmiRNAs between LA subgroups. Two hundred and fifty six DEmiRNAs were obtained when AA TNBC and NHW TNBC samples were compared; integrative analysis of miRNA expression and CNA data of TNBC samples resulted in 26 miRNAs with concordant data of both analysis. ROC analysis indicates a good power of both individual miRNAs and combined panel of 26 miRNAs in discriminating AA TNBC and NHW TMBC samples. Bioinformatic analysis indicate that these 26 miRNAs may be involved in important signaling pathways for carcinogenesis, as PI3K-Akt, MAPK and Insulin pathways. Among the 26 miRNAs, miR-150-5p was selected for further functional analysis uncovering its oncogenic potential in breast cancer, especially in AA TNBC. Modulation of miR-150-5p expression by using inhibitors and mimics was performed followed by proliferation (MTS and Clonogenic Assay), migration, epithelial-tomesenchymal transition (EMT) markers expression and cytotoxic assays. Integrative analysis of miRNA expression and CNA data of LA patients resulted in 17 miRNAs with concordant data. This panel presented high power in discriminating TNBC and NTNBC subtypes of the Brazilian patients, with AUC of 0.953. In conclusion, there are biological differences at molecular levels (DNA and RNA) among breast tumors of the three populations of this study that might help elucidate health disparities observed. These results indicate that miRNAs are important for breast tumorigenesis and integration with CNA data allow a fine selection of miRNAs as diagnostic, prognostic biomarkers and for treatment development. Key-words: Breast cancer. microRNAs. Health disparities

Orientadora : Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientadora : Profª. Drª. Angelica Beate Winter Boldt Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 25/11/2016 Inclui referências : f. 123-144 Área de concentração Resumo: Os Menonitas são um grupo Anabatista cristão que foi perseguido na Europa devido à sua crença, passando a constituir grupos fechados, em que a prática de casamentos consanguíneos se tornou frequente. Ao migrarem para o Brasil formaram comunidades como a Colônia de Witmarsum (PR). O câncer é um conjunto de doenças que apresenta diversas causas e uma grande complexidade podendo ocorrer de forma hereditária, quando uma mutação ocorre na linhagem germinativa e é transmitida ao longo das gerações de uma família dando origem às síndromes familiais. A comunidade de Witmarsum, por intermédio de uma representante, manifestou o desejo de ser estudada devido à percepção de que ali ocorriam muitos casos de câncer. Deste modo, foi proposto um estudo voluntário para se realizar o levantamento dos casos de câncer nas famílias desta comunidade e o aconselhamento genético. Dez famílias se voluntariaram, das quais três preencheram os critérios estabelecidos para síndromes conhecidas, como a Síndrome de Câncer de Mama e Ovário Hereditária (HBOC) em duas famílias e a Neurofibromatose do Tipo 1 (NF1) em uma terceira. Membros destas famílias foram selecionados para análises moleculares, que confirmaram os diagnósticos clínicos. Em ambos os casos foram encontradas mutações que alteram o quadro de leitura levando à produção de proteínas truncadas, sendo c.1961delA em BRCA1 no indivíduo da família com HBOC e c.3601delT em NF1 em cinco indivíduos da família com Neurofibromatose do Tipo 1. As demais famílias analisadas não preencheram critérios clínicos para síndromes já descritas e foram classificadas como portadoras de casos esporádicos de câncer. Palavras-chave: Menonita. Aconselhamento genético. Câncer hereditário. Abstract: Mennonites are a Christian Anabaptist group that were persecuted in Europe due to their belief, and since then constitute closed groups, where the practice of consanguineous marriage has become common. In Brazil, they migrated and formed communities such as "Witmarsum Community (PR)". Cancer is a multifactorial and complex group of diseases that can occur in hereditary form, when a germline mutation happens and is transmitted through family generations, giving rise to familial syndromes. The Witmarsum Community, through an agent, expressed the desire to be studied once they have noticed a high number of cancer cases in their population. In this way, a voluntary study was proposed to carry out the survey of cancer cases in the families of this community and the genetic counseling. Ten families volunteered, of which three met the established criteria for known syndromes. Two families were classified as Hereditary Breast and Ovarian Cancer (HBOC) and one as Neurofibromatosis type 1. Families members were selected for molecular analysis, that confirmed the diagnosis. In both cases were found frameshift mutations, that cause the production of truncated proteins, which are c.1961delT in BRCA1 in the HBOC family and c.3601delT in NF1 in the Neurofibromatosis type 1 family. The other families analyzed did not meet clinical criteria for syndromes already described and were classified as presenting sporadic cases of cancer. Key-words: Mennonite. Genetic counseling. Hereditary cancer

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Profº Dr. Juliano Javert Lourenço e Profº Dr.Iglenir João Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 14/02/2011 Inclui referências : f. 64-80-94-99 Área de concentração Resumo: O Câncer de Cólon e Reto (CCR) é um dos cânceres mais frequentes do mundo. Esta doença compreende subgrupos que se caracterizam por alterações genéticas e anatomopatológicas específicas e pode ser dividida em câncer esporádico e hereditário, sendo o Câncer de Cólon e Reto Hereditário Não-Polipomatoso (HNPCC) uma das formas mais comuns de CCR hereditário. Essa síndrome tem como principal característica a instabilidade de microssatélites (MSI), porém cerca de 10 a 15% dos CCR esporádicos também apresentam MSI. A análise da mutação V600E no proto-oncogene BRAF foi proposta para identificar CCR esporádico com MSI, e distingui-lo do HNPCC. O objetivo deste trabalho foi estimar a frequência da mutação V600E em CCRs esporádicos em uma população do Sul do Brasil e verificar se há correlação com MSI correlacionando os resultados com os dados clínicos e anátomopatológicos. Para isso, foi realizada a extração do DNA de 84 amostras em parafina, a amplificação dessas por PCR e, em seguida, para identificação da V600E foi realizado o sequenciamento. A mutação V600E não foi encontrada em nenhuma das amostras analisadas. Já para a análise de instabilidade de microssatélites foram genotipados três marcadores: BAT25, BAT26 e CAT25. A MSI foi observada em 12 (14,28%) amostras, sendo sete (58,33%) classificadas com alta instabilidade de microssatélites (MSI-H) e cinco (41,67%) com baixa instabilidade de microssatélites (MSI-L). Em relação à correlação de MSI-H com os dados clínicos e anátomopatológicos encontramos que um (10%) paciente apresentava idade ? 50 anos; três (8,33%) variavam entre 51-69 anos; e dois (6,45%) apresentavam idade ? 70 anos. Dos sete casos com MSI-H, cinco (10,87%) eram do sexo feminino e em, 17,85% os tumores estavam localizados no cólon direito/proximal. A proporção de MSI encontrada neste estudo foi a esperada e demonstrou associação com o local do tumor, reafirmando sua importância na abordagem inicial dos pacientes com CCR por se caracterizar como um importante auxiliar prognóstico e preditivo. Palavras-chave: Câncer de Cólon e Reto. BRAF V600E. Instabilidade de Microssatélites Abstract: The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most frequent cancers worldwide. Itcomprises sub-groups which are characterized by genetic and pathological alterations and can be divided into sporadic and hereditary cancer. One of the most common forms of hereditary CRC, is the Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). The main feature of this syndrome is the microsatellite instability (MSI), but MSI also have been reported in 10-15% of sporadic CRC. A V600E mutation the BRAF proto-oncogene has been proposed to identify sporadic CRC with MSI, and distinguish it from HNPCC. The aim of the present study was to determinate the frequency of V600E mutation in sporadic CRCs of the southern Brazil population, its association with MSI and evaluate the association between clinical and anatomic pathological data. Initially, the extraction of DNA of 84 samples formalin-fixed paraffinembedded was performed. The samples were amplified by PCR. Sequencing was utilized to analyze the V600E. The V600E mutation was not detected in any of the samples. For the microsatellite analysis, it was done a genotyping of three markers: BAT25, BAT26 and CAT25. MSI was observed in 12 samples (14.28%), seven (58.33%) of them presented high microsatellite instability (MSIH) and five (41,67%) low microsatellite instability (MSI-L). As regards the correlation of MSI-H with clinical and pathological anatomical data, we observed that one (10%) patient was ? 50 years old; three (8.33%) were between 51-69 years old; and two (6.45%) were ? 70 years old. Of the seven patients with MSIH, five (10.87%) of them were female and 17.85% tumors were located in right/proximal colon. The proportion of MSI in this study was as expected and demonstrated association with the tumor location, it reaffirms its importance inthe initial approach to patients with CRC for assisting in the prognostic and predictive. Key-words: Colorectal Cancer. BRAF V600E. Microsatellite Instability.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadora : Profª. Drª. Enilze M. S. F. Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 22/11/2016 Inclui referências : f. 63-80 Resumo: O câncer de mama é o tipo mais comum dos casos de câncer diagnosticados em adultos com mutações germinativas no gene TP53, representando 27% de todos os tipos de câncer que apresentam mutação nesse gene. O estudo do gene supressor de tumor TP53 possibilitou a identificação da mutação R337H TP53 que se caracteriza por codificar uma histidina no lugar de arginina (R337H), no exon 10 do gene TP53, no domínio de tetramerização da proteína p53. Esta mutação ocorre em 95% dos pacientes pediátricos do Sul do Brasil portadores de Tumor de Córtex Adrenal (TCA), sendo de 0,27% a sua frequência populacional. Em uma análise de 171.649 recém-nascidos do Estado do Paraná, as famílias de indivíduos com a mutação R337H TP53 foram analisadas, sendo observado que o câncer de mama foi o tipo mais frequente de neoplasia encontrada nos adultos, correspondendo a 14,55% dos casos. O objetivo principal deste trabalho foi verificar, através da técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan e Sequenciamento de Sanger, a frequência da mutação R337H TP53 em uma amostra de DNA tumoral de 700 pacientes portadoras de carcinomas mamários atendidas nos Hospitais Nossa Senhora das Graças e de Clínicas de Curitiba, PR, e analisar a instabilidade genômica, por array-CGH, nas pacientes com (n=5) e sem (n=9) a mutação R337H TP53. Das 700 pacientes, onze eram heterozigotas para a mutação estudada, com frequência genotípica de 0,0157 e alélica de 0,0079. A frequência genotípica observada na amostra analisada foi demonstrada ser 5,93 vezes maior do que a descrita previamente (0,27%), em uma amostra de 171.649 recém-nascidos do Estado do Paraná, indicando a relevância desta mutação na carcinogênese mamária. Após a comparação dos dados clínicos histopatológicos das pacientes com e sem a mutação, foi observada diferença estatisticamente significativa entre as médias de idade dos dois grupos de pacientes (t=1,97; P

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Prof. Dr.Iglenir João Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 26/06 2015 Inclui referências : f. 89-119 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres e cerca de 57.000 novos casos são esperados para a população brasileira em 2015. Um conhecimento sólido sobre a expressão proteica é essencial para a compreensão biológica, diagnóstico precoce e tratamento do câncer de mama. Os principais objetivos deste trabalho foram identificar proteínas diferencialmente expressas entre amostras pareadas de carcinoma ductal invasivo e tecido não tumoral de mama, e na seleção de possíveis alvos, avaliar e comparar a expressão de RNAm e proteica de STIP1 entre amostras de tecido de mama tumoral, não tumoral e de linfonodo metastático. A análise proteômica comparativa foi realizada pelo método de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida para cinco amostras pareadas, sendo consideradas apenas as bandas com diferença de expressão acima de duas vezes (p

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/03/2015 Inclui referências : f. 80-92 Área de concentração Resumo: O câncer de mama é uma das principais causas de morte nas mulheres em todo o mundo, sendo este tipo de câncer o mais incidente na população feminina, desconsiderando o de pele não melanoma. Os tumores mamários são divididos em diferentes subtipos de acordo com o padrão de expressão gênica, no entanto, na prática laboratorial, usa-se a imuno-histoquímica como forma de classificação, baseando-se no status dos receptores hormonais e do HER2, subdividindo os tumores nos subtipos Luminal A, Luminal B, HER2+ e Triplo-Negativos. A região cromossômica 11q13 é comumente encontrada amplificada em tumores de mama e os genes FOSL1, GSTP1 e CCND1, localizados nesta região, têm sido apontados como genes alvos para a iniciação e progressão tumoral. Com o objetivo de avaliar a presença ou ausência de alteração do número de cópias dos referidos genes de acordo com os subtipos de tumores de mama, 77 amostras foram analisadas, sendo 26 luminal A, 29 luminal B, 10 HER2+ e 12 triplo-negativas. Verificamos que houve ganho de cópias nos três genes analisados, sendo 70% para o FOSL1, 23% para o GSTP1 e 26% para o CCND1. Através do teste de Kruskal-Wallis, observamos que FOSL1 foi o único gene que apresentou diferença estatisticamente significativa (p < 0,0001) entre os subtipos de tumor, tendo maior número de cópias os tumores triplo-negativos em relação aos luminais A e B. Pelo teste de regressão linear, foi possível observar que a alteração do número de cópias deste gene é dependente do subtipo de tumor (b = 0,79 ± 0,20; t = 3,95; p < 0,001) e independente das alterações nos outros dois genes. Análises de alteração do número de cópias de acordo com os parâmetros clínicos e histopatológicos não apresentaram diferença estatisticamente significativa para nenhum dos genes. Em conclusão, a alteração observada no gene FOSL1 sugere que este é um potencial marcador prognóstico e para a diferenciação dos subtipos de tumores. Palavras-chave: Câncer de mama. FOSL1, GSTP1, CCND1. Subtipo tumoral. Número de cópias de DNA. Abstract: Breast cancer is a leading cause of death in women worldwide. This type of cancer is the most frequent in the female population, after non-melanoma skin cancer. Mammary tumors are divided into subtypes according to the pattern of gene expression, however, in the laboratory routine, it is used a immunohistochemistry classification, based on the hormonal receptor and HER2 status, thus subdividing the tumors in subtypes Luminal A, Luminal B, HER2+ and triple-negative. The 11q13 region is commonly found amplified in breast tumors. FOSL1, GSTP1 and CCND1 genes are located in this region, and have been identified as target genes for tumor initiation and progression. Aiming to evaluate the copy number of these genes according to the subtypes of breast tumors, 77 samples were analyzed, 26 out of those were luminal A, 29 luminal B, 10 HER2+ and 12 triple-negative. We found gain in the copy number in all genes analyzed, 70% for FOSL1, 23% for GSTP1 and 26% for CCND1. Through Kruskal-Wallis test, we found that FOSL1 was the only one that showed a statistically significant difference (p < 0.0001) among tumor subtypes, with more copies in triple-negatives tumors compared to luminal A and luminal B. By linear regression test, we found that the change in the number of copies of this gene is dependent on the tumor subtype (b = 0.79 ± 0.20; t = 3.95; p < 0.001) and independent of the alterations in the other two genes. Copy number alteration according to the clinical and histopathological parameters showed no statistically significant differences for any of the genes. In conclusion copy number alterations in FOSL1 suggest that this gene may be a potential prognostic marker and for the differentiation and tumor subtypes. Keywords: Breast Cancer. FOSL1, GSTP1, CCND1. Tumor subtype. DNA copy number.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/09/2015 Inclui referências : f.86-96 Resumo: As alterações no número de cópias de DNA e na expressão gênica são fatores importantes no câncer de mama. Nosso objetivo foi investigar a possível associação dos genes FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD e CCND1, selecionados a partir de uma análise de CGHarray prévia, no desenvolvimento e na progressão dos tumores, assim como sua possível função como preditores de prognóstico. Com este objetivo, foram selecionadas amostras de pacientes com tumor primário sem (LN-) e com (LN+) metástase nos linfonodos axilares, e usando esse parâmetro como marcador da progressão da doença. O número de cópias de DNA e a expressão do RNAm foram analisadas utilizando ensaios TaqMan® em 137 tumores primários, sendo 53 LN- e 84 LN+. Todos os genes estudados mostraram aumento do número de cópias de DNA (58,07% da amostra total) com ênfase para os genes NTSR1, FADD e CCND1. Com exceção do gene FADD no grupo LN+, o nível de RNAm não mostrou dependência do número de cópias de DNA, sugerindo que outros mecanismos podem estar envolvidos na regulação. Em relação aos parâmetros clínicos e histopatológicos (tamanho, grau e estágio do tumor, expressão dos receptores hormonais e evolução clínica), não foi observada associação com as alterações de número de cópias de DNA. Os resultados indicam que o aumento do número de cópias em NTSR1, FADD e CCND1 provavelmente esteja envolvido nos estágios iniciais da tumorigênese mamária, uma vez que não foram observadas diferenças ao comparar LN- e LN+. Palavras-chave: Número de cópias de DNA, expressão gênica, câncer de mama, linfonodos, metástase, FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD, CCND1. Abstract: Changes in genes copy number and mRNA expression are important factors in breast cancer. We aimed to investigate the possible association of the genes FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD and CCND1, selected after previous array-CGH analysis, in tumor development and progression as well their possible role as prognostic predictors. With this objective, we selected samples from patients with primary tumors without (LN-) or with (LN+) metastasis in lymph nodes, taking this parameter as a marker of disease progression. The DNA copy number and mRNA expression were analyzed using TaqMan® assays in 137 primary breast tumors being 53 LN- and 84 LN+. All genes studied showed an increased copy number (58.07% of the total sample) with emphasis to NTSR1, FADD and CCND1. With the exception of FADD in LN+ group, the mRNA level did not show dependency of the copy number, suggesting that other mechanisms can be involved in the regulation. Regarding the histopathological and clinical parameters (tumor size, grade and stage, the hormonal receptors status and clinical evolution) no association with the copy number alterations were observed. The results indicated that the increased copy number in NTSR1, FADD and CCND1 is probably involved in the early stages of breast tumorigenesis, since no difference were observed when LN- and LN+ were compared. Key words: DNA copy number, gene expression, breast cancer, lymph node, metastasis, FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD, CCND1.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/03/2015 Inclui referências : f. 97-114;138-143 Área de concentração Resumo: A glândula mamária humana apresenta uma estrutura complexa, com um sistema integrado de renovação tecidual, regulado por diversos fatores que, em conjunto, atuam no remodelamento cíclico da mama. As constantes alterações na estrutura e nos níveis de fatores reguladores do desenvolvimento podem predispor o tecido a doenças mamárias, incluindo o câncer. A tumorigênese mamária é um evento complexo, com diferentes proteínas envolvidas. Alterações na expressão de proteínas-chave podem comprometer múltiplas vias relacionadas à proliferação, inibição da apoptose, migração, invasão e metástase. O estabelecimento do perfil proteico para o tecido mamário não tumoral, incluindo o contralateral pela sua localização em relação ao tumor, é fundamental para caracterizar a mama em estado saudável e possibilitar a inferência de alterações envolvidas na transformação e progressão neoplásica. Neste contexto, a proteômica consiste em um método de relevância para a caracterização de proteomas, contribuindo para a identificação de biomarcadores de utilidade no diagnóstico, na terapêutica e no prognóstico. No presente estudo, a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) combinada com a espectrometria de massa MALDI-TOF foram utilizadas para analisar as proteínas expressas pelo tecido mamário não tumoral contralateral, comparando com respectivas amostras de tumor. Cento e dez spots foram identificados e corresponderam a 62 proteínas distintas, categorizadas em nove classes funcionais. Para 45 spots, verificou-se a mesma identificação no tecido não tumoral da mama com o tumor e o matching entre este e o tecido contralateral indicou relevante similaridade entre ambos. A comparação com o tumor primário resultou na identificação de seis proteínas diferencialmente expressas, sendo duas exclusivas para o tumor, duas para o tecido contralateral e três comuns a ambos, com expressão elevada no tecido sadio. Os dados apresentados fornecem informações adicionais para a caracterização do tecido mamário não tumoral e indicam proteínas que podem ter função na tumorigênese mamária como alvos relevantes para futuras análises. Palavras-chave: Câncer de mama; tecido mamário não tumoral contralateral; proteoma; proteômica. Abstract: The human mammary gland presents a complex cellular structure, with an integrated system of tissue renewal that is controlled by several factors acting in cyclic remodeling of the breast. Continuous changes in the structure and in the levels of development-regulating factors may predispose the breast tissue to diseases, including cancer. The mammary tumorigenesis is a complex event, with different proteins involved. Expression changes in protein keys can compromise multiple pathways related to cell proliferation, inhibition of apoptosis, migration, invasion and metastasis. The establishment of the protein profile to the non-tumoral breast tissue, including the contralateral tissue according to its location in relation to the tumor, is essential to characterize the breast in healthy state and can allow the inference of changes involved in the transformation and neoplasic progression. In this context, the proteomics consists in an important method for the characterization of proteomes, contributing for the identification of useful biomarkers in the diagnosis, treatment and prognosis. In the present study, the two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) combined with mass spectrometry MALDI-TOF were used to analyze the proteins expressed in contralateral non-tumor breast tissue, compared with the respective tumor samples. There was identified 110 spots and corresponded for 62 distinct proteins, categorized into nine functional classes. For 45 spots, the same identification was found in contralateral and ipsilateral non-tumor breast tissues, indicated relevant similarity between both healthy tissues. Comparison with primary tumor resulted in the identification of six differentially expressed proteins, two exclusive for tumor tissue, one for the contralateral tissue and three were common, with increased expression in healthy tissue. These data provide additional information for the characterization of non-tumor breast tissue and indicate proteins that may have function in the mammary tumorigenesis as relevant targets for future analysis.Keywords: Breast cancer; contralateral non-tumor breast tissue; proteome; proteomics.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As Neoplasias Mieloproliferativas são originadas por uma proliferação clonal de um progenitor hematopoético. Descrita inicialmente em 1951 como “Doenças Mieloproliferativas” e reavaliada pela Organização Mundial da Saúde em 2011, as Neoplasias Mieloproliferativas agrupam a Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Miefibrose Primária em um subgrupo chamado de BCR-ABL negativo. De acordo com a revisão dos critérios adotados para o diagnóstico das Neoplasias Mieloproliferativas a presença da mutação JAK2 V617F é considerada critério de maior importância para o diagnóstico do subgrupo BCR-ABL negativo representando um marcador clonal. A Policitemia Vera é principalmente diagnosticada por um aumento na massa eritrocitária independente de fator estimulante, aumento de leucócitos no sangue periférico, esplenomegalia e trombocitose. Ocorre, geralmente, em homens e mulheres com faixa etária de 60 anos, com incidência de 0,7 a 2,6/100.000 habitantes/ano. A mutação V617F no gene JAK2 produz uma proteína alterada que ativa constitutivamente a via JAK-STAT e outras vias downstream de modo que, as proteínas de ativação transcricional e transdutoras de sinal (STAT do inglês Signal Transducerand Activator of Transcription) são fosforiladas posteriormente impactando na expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose e proteínas regulatórias, além de alterar a taxa de proliferação das células hematopoéticas. Neste trabalho foram selecionados 26 pacientes com Policitemia Vera, os quais foram atendidos na cidade de Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram realizadas análises de mutações no gene JAK2 a partir do material genético isolado do sangue periférico. Os dados clínicos de cada paciente foram relacionados entre si e correlacionados com os dados moleculares. Myeloproliferative neoplasms (MPN) are caused by a clonal proliferation of a hematopoietic progenitor. First described in 1951 as “Myeloproliferative Diseases” and reevaluated by the World Health Organization in 2011 (WHO, 2011), the Myeloproliferative Neoplasms gather the Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Mielofibrose in a subgroup called negative BCR-ABL. According to WHO the revised diagnosis criteria for myeloproliferative neoplasms, the presence of JAK2 V617F mutation, is considered the most important criterion for the diagnosis of negative BCR-ABL subgroup representing a clonal marker. The Polycythemia Vera is primarily diagnosed by an independent stimulating factor in red cells mass increasing, followed by an increase of leukocytes in peripheral blood, spleen and thrombocytosis. It usually occurs in men and women of all age groups with higher incidence in 60-year-old patients ranging from 0.7 to 2.6/ 100.000 hab/year. The V617F mutation in the JAK2 gene produces an altered protein that activates constitutively the JAK-STAT pathway and other pathways downstream as a result the protein transcriptional activation and signal transduction (STAT) are subsequently phosphorylated causing impact in the expression of genes involved in regulation of apoptosis and regulatory proteins, as well as altering the rate of proliferation of hematopoietic cells. In this study 26 patients with Polycythemia Vera were selected in Juiz de Fora, Minas Gerais. The peripheral blood was used for genetic material isolation (JAK2 mutation). The clinical data of each patient were related to each other and correlated with the molecular data.