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Orientador: Rejane Maira Góes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A reprogramação metabólica ao longo do processo carcinogênico confere suporte à alta demanda anabólica e energética. Este ajuste também é observado no câncer de próstata (CaP), em especial a desregulação mitocondrial e da lipogênese, vulnerabilidades exploradas como estratégias terapêuticas. O ácido docosahexaenóico (DHA) é um ácido graxo poli-insaturado ômega-3 com propriedade antiproliferativa em diferentes tipos tumorais, inclusive na próstata, cujos mecanismos ainda não estão esclarecidos, mas parecem envolver o metabolismo celular. Este trabalho avaliou a propriedade antitumoral do DHA em diferentes contextos androgênicos do CaP e os mecanismos subjacentes, associados à modulação do metabolismo tumoral. Primeiramente, avaliamos o potencial do DHA em reduzir o crescimento celular associado à regulação da via androgênica, de sensores metabólicos que co-regulam morte e proliferação celular, como também a mitocondrial. Para isso, foram utilizadas células epiteliais prostáticas humanas pré-maligna (PNT1A, AR-positiva) e tumorais resistentes à castração (CRPC) 22rv1 (AR-positiva) e PC3 (AR-negativa). O DHA (100µM, 48h) modulou o crescimento celular diferentemente, reduzindo a fase S e induzindo morte celular nas AR-positivas, enquanto provocou parada do ciclo em G2/M na AR-negativa. Nestas linhagens, este ômega-3 induziu estresse oxidativo, acúmulo lipídico e disfunção mitocondrial. A PNT1A mostrou-se mais responsiva quanto à regulação de genes envolvidos com o metabolismo, resposta a hormônios, estresse, como também na fisiologia mitocondrial. Apesar de menor quantidade, o DHA desregulou genes nas células malignas que estão frequentemente alterados de forma oposta no CaP. Na PNT1A, o ômega-3 ainda prejudicou a biogênese mitocondrial e provocou a fragmentação da sua rede. Em seguida, nas mesmas condições experimentais, foi avaliado o metabolismo lipídico em células tumorais malignas AR-positivas LNCaP, andrógeno-responsiva, C4-2 e 22rv1, ambas CRPC. O DHA induziu parada do ciclo celular em todas as linhagens, sendo incorporado em triacilgliceróis e ésteres de colesterol, como também em fosfolipídios com consequente aumento da insaturação na membrana celular, o que sensibiliza células a danos oxidativos. Tal incorporação foi acompanhada de menor regulação da via lipogênica, lipogênese a partir de glicose e redução proteica de FASN. Além disso, o DHA estimulou a oxidação de ácidos graxos, sendo que a linhagem 22rv1 apresentou preferência pelo ômega-3. A redução da lipogênese não ocorreu devido à regulação da via androgênica, mesmo com redução da expressão proteica de AR-FL e AR-V7. Tendo em vista os desafios terapêuticos do CRPC, avaliamos o efeito do DHA sobre o crescimento de organoides MSK-PCa3 e em modelo xenográfico com a linhagem 22rv1 (DHA 10mg/kg/dia/28 dias), o qual teve seu diâmetro reduzido e o crescimento tumoral inibido, respectivamente. Por fim, testamos o efeito simultâneo do DHA e inibidores da lipogênese (FASNi/ACCi-100nM/28 dias) e observamos potencialização na redução do diâmetro dos organoides. A administração de FASNi (100mg/mL/28 dias) e DHA reduziu o crescimento do tumor em mais de 80%. Em conclusão, o DHA é um agente antitumoral multialvo em diferentes contextos androgênicos por vias que culminam na parada do ciclo ou indução de morte celular, associadas ao metabolismo, sendo a mitocondrial prevalente em estágio inicial e o metabolismo lipídico em estágios avançados do CaP Abstract: Metabolic reprogramming during carcinogenesis supports the increased anabolic and energetic demand in proliferating cells. Such adjustment is also observed in the prostate cancer (PCa), mainly the dysregulation of mitochondria and lipogenesis, both vulnerabilities often explored as therapeutic strategies. Docosahexaenoic acid (DHA) is an omega-3 polyunsaturated fatty acid with antiproliferative property in different cancers, including prostate, but the mechanisms are not elucidated yet and seem to be related with cell metabolism regulation. This study evaluated the DHA antitumoral property on distinct androgenic contexts of PCa and the underlying mechanisms, associated with tumor metabolism. Firstly, we tested the DHA potential in decrease cell growth due to regulation of the androgenic pathway, metabolic sensors that also co-regulate death and proliferative pathways, in addition to induce mitochondria dysfunction. For this purpose, we incubated with DHA at 100µM for 48h human epithelial prostate cells from pre-malignant, (PNT1A, AR-positive) and castrated-resistant stage (CRPC) 22rv1 (AR-positive) and PC3 (AR-negative). DHA differently modulated the cell growth by reducing S-phase and inducing cell death in AR-positive while led AR-negative to cell cycle arrest in G2/M. In these cell lines, the omega-3 raised oxidative stress, lipid accumulation and mitochondrial dysfunction. PNT1A was more responsive regarding to regulation of genes related with metabolism, response to hormones and stress as well as mitochondrial physiology. In 22rv1 and PC3, DHA regulated less genes compared to PNT1A, but they are often altered in PCa samples. In PNT1A, the omega-3 also impaired mitochondrial biogenesis and led to its network fragmentation. Secondly, under same experimental conditions, we evaluated the lipid metabolism in AR-positive malignant cells LNCaP (androgen-responsive), C4-2 and 22rv1, both CRPC. DHA induced cell cycle arrest on these cell lines, being incorporated into triacylglycerol and cholesterol esters as well as phospholipids, which showed increase in unsaturation status hence in the cell membrane, turning cells prone to oxidative damage. Such incorporation was followed by downregulation of the lipogenic pathway, lipogenesis from glucose and reduction of FASN protein levels. Moreover, DHA stimulated fatty acids oxidation, being 22rv1 the cell line with preference for the omega-3 itself. Lipogenesis impairment was not due to androgenic pathway regulation, even though DHA decreased AR-FL and AR-V7 protein levels. Considering the therapeutic challenges of the CRPC stage, we evaluated the DHA effect on MSK-PCa3 organoids growth and 22rv1 xenografts (DHA 10mg/kg/day/28 days). It decreased the organoids diameter and suppressed tumor growth, respectively. Lastly, we tested the concomitant administration of DHA with lipogenesis inhibitors (FASNi/ACCi-100nM/28 days) and observed an enhancement in the reduction of organoids diameters. The FASNi (100mg/mL/28 days) and DHA administration reduced tumor growth in at least 80%. In conclusion, DHA is an antitumor agent at different androgenic contexts and has several targets that culminate in cell cycle arrest and cell death induction. The involved pathways are associated with the metabolism, being mitochondria the major one at early stages and the lipid metabolism in the advanced PCa Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural CAPES 001 FAPESP 2018/21891-4

TNF-α is a key cytokine involved in process of carcinogenesis, including prostate cacrinogenesis, being TNFR-1 the responsible for the majority of its answers. This receptor triggers two opposite pathways: cell death or cell survival. So, due to this paradoxal role, a TNFR-1 knockout model is interesting in order to clarify the real effect of TNF in prostate cancer. Thus, this investigation had as a general propose to evaluate the role of TNF signalling pathway in prostate carcinogenesis by chemical induction in mice. Therefore, C57bl/6 wild type (WT) and TNFR-1 knockout mice (KO) were treated with mineral oil or MNU in association with testosterone (MNU+T) during 6 months. After this period of induction, prostate samples were processed for histological and biochemical analysis. It was observed that the treatment with MNU+T led to development of benign and malign lesions in both WT e KO animals. However, the incidence of malign lesions was significantly higher in the former, indicating the involvement of TNFR-1 with cellular survival and proliferation pathaway. These data were supported by proliferative profile analysis, which showed that proloferation was significantly lower in KO, even after carcinogenesis. Moreover, knockout animals had smaller prostate amounts of mTOR after treatment with MNU+T in comparison to WT, suggesting the potential of TNFR-1 in activating this proliferative pathway. It was also observed a decrease in AR quantities in prostate after carcinogenesis in both KO and WT. Since AR expression may be regulated as a result of PI3K/AKT/mTOR pathway activation, it is suggested that the decrease of AR in KO may have occurred as a result of smaller quantities of mTOR in these animals. Moreover, it s suggested that TNF-α /TNFR-1 has key role in MMP2 expression, reducing the content of this enzyme in its absence, and that the decrease of MMP2 may be responsible to the accumulation of fibronectin in KO. Finally, it was observed a similar increase in apoptosis in WT and KO group after carcinogenesis, showing clearly that TNFR-1 in this model was not involved in the induction of cell death. Therefore, it is concluded that the cytokine TNF-α, through its receptor TNFR-1 promoted cell proliferation and cell survival by activation of the AKT/mTOR pathway, which implicates its role in prostate carcinogenesis in this experimental model. O TNF-α é uma das principais citocinas envolvidas com o processo de carcinogênese, inclusive da próstata, sendo o TNFR-1 o receptor responsável pela maioria das suas respostas. Esse receptor desencadeia duas vias opostas: morte ou sobrevivência celular. Assim, devido a esse seu papel paradoxal, um modelo de knockout de TNFR-1 é interessante para esclarecer de forma mais específica o real efeito do TNF no câncer de próstata. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo geral avaliar o papel da via de sinalização TNF-α na carcinogênese através da indução química do câncer de próstata em camundongos. Para tanto, camundongos C57bl/6 selvagens (WT) e knockout (KO) para o receptor TNFR-1 foram tratados com óleo mineral ou MNU associado a testosterona (MNU+T) durante o período de 6 meses. Após esse período de indução, observou-se que o tratamento com MNU+T levou ao desenvolvimento de lesões benignas e malignas em ambos animais WT e KO. Entretanto, a incidência de lesões malignas foi significativamente maior no primeiro grupo, indicando o envolvimento do TNFR-1 com a via de sobrevivência, proliferação celular e, assim, com a carcinogênese prostática. Esses dados foram reforçados pelas análises do perfil proliferativo das células, os quais mostraram que a proliferação foi substancialmente menor em KO, mesmo após a carcinogênese. Além disso, os animais KO apresentaram menores quantidades de mTOR após o tratamento com MNU+T, ao contrário do observado em WT, evidenciando o potencial de TNFR-1 em ativar a via que leva à fosforilação dessa proteína. Observou-se ainda uma queda nas quantidades de AR após o período de tratamento com carcinógeno tanto nos animais KO quanto nos WT. Devido ao fator de a expressão desse receptor poder ser regulada como resultado da ativação da via PI3K/AKT/mTOR, sugere-se que a diminuição de AR possa ter ocorrido como consequência da menor quantidade de mTOR nesses animais. Sugere-se ainda que a via TNF-α /TNFR-1 tenha papel fundamental na expressão de MMP2, reduzindo seu conteúdo na sua ausência, e que a diminuição da mesma pode ter relação com o aumento de fibronectina em KO. Por fim, foi observado um aumento da apoptose de maneira igual no grupo WT e em KO após o tratamento com MNU+T, deixando evidente que TNFR-1, nesse modelo, não teve envolvimento com a indução da morte celular. Portanto, conclui-se que a citocina TNF-α, através de seu receptor TNFR-1, promoveu proliferação e sobrevivência celular por meio da ativação da via AKT/mTOR, o que comprova seu papel na carcinogênese da próstata nesse modelo experimental. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) is very important during pregnancy, working mainly through the angiotensin II (Ang II) that can interfere with the activation of Mitogenic-Activated Protein Kinases (MAPK) cascade. In addition, pregnancy is associated with marked increase in renal hemodynamics that may also be affected by diabetes mellitus (DM). The objectives were to evaluate the effects of DM induced in Wistar rats during pregnancy and maintained in the postpartum period on the renal expression of PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), α-SMA (Smooth Muscle Actin) and p-p38 and p-JNK MAPK as well as in studies of renal function and systolic blood pressure (SBP) in Wistar rats. For this, there were two groups (G): non-pregnant and pregnant. In the first G, the rats were divided into: G1 (non-pregnant controls rats), females that received intraperitoneal injection (ipi) of 0.9% saline solution and G2 (non-pregnant diabetic rats), females that received ipi of alloxan (100 mg/kg) diluted in 0.9% saline solution. In the second G, pregnant rats were divided into: G3 (control mothers), mothers that received ipi of 0.9% saline solution and G4 (diabetic mothers), mothers that received ipi of alloxan (100 mg/kg) diluted in 0.9% saline solution. Blood glucose was observed 2 days after induction and the animals were considered diabetic if they had blood glucose higher than or equal to 150 mg/dL. About 50 days after delivery for G3 and G4 and corresponding time for G1 and G2, the rats were subjected to indirect measurement of SBP by plethysmography and the determination of glomerular filtration rate (GFR) by creatinine clearance. Then, the animals were anesthetized and their kidneys were removed for histological, immunohistochemical and morphometric studies. The results showed that G2 and G4 animals had blood glucose levels (mg/dL) and urinary volume (mL) higher than animals from G1 and G2, even several days after DM induction. The SBP (mmHg) were not different among the groups, but there was a tendency for reduction in GFR (mL/min) from G4 when compared to the other G. There was also a significant increase in kidney weight (right and left)/body weight ratio of G4 in relation to other G. Morphometric analysis showed a reduction of total renal sectional area from G4 and an increase in G3. The glomerular area and the capsular space did not differ between G studied, but there was an augment in glomerular tuft area in G3 and G4. Quantification of the percentage of cortical collagen showed that G2 and G4 presented higher distribution, while the identification and count of mast cells did not differ between G. Regarding PCNA immunoreactivity, G3 showed increased glomerular proliferating cells, while in G4 it was decreased. On the other hand, in the tubulointerstitial (TBI) compartment cell proliferation was higher in G4. Glomerular expression of α-SMA and TBI were increased in G4 compared to other G. Immunoreaction for glomerular p-p38 expression showed a pattern similar to PCNA, with a reduction of p-p38 in G4 relative to other G. The immunoreactivity of p-JNK was higher in both the glomeruli and TBI compartment in G4 compared to G1, G2 and G3. It is concluded that the DM induced during pregnancy and maintained in the postpartum period in Wistar rats resulted in significant structural changes and moderate functional impairmet in kidney, showing that pregnancy has an enhancing effect of renal damage induced by diabetes and these alterations may be related to changes in the expression of p-p38 and p-JNK MAPK. O sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) é de suma importância durante a gestação, atuando principalmente através da angiotensina II (Ang II) que pode interferir na ativação da cascata de Mitogenic-Activated Protein Kinases (MAPK). Além disso, a gravidez está associada a aumentos marcantes na hemodinâmica renal, que também pode ser afetada pelo diabetes mellitus (DM). Os objetivos do trabalho foram avaliar os efeitos do DM induzido em ratas Wistar durante a gestação e mantido no período pós-parto na expressão renal de PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), α-SMA (Smooth Muscle Actin) e das MAPKs p-p38 e p-JNK, bem como nos estudos de função renal e pressão arterial sistólica (PAS) de ratas Wistar. Para isso, foram realizados dois grupos (G): não-gravídico e gravídico. No primeiro G, as ratas foram divididas em: G1 (controles sem gravidez), fêmeas que receberam injeção intraperitoneal (iip) de solução salina 0,9% e G2 (diabéticas sem gravidez), fêmeas que receberam iip de aloxana (100mg/kg) diluída em solução salina 0,9%. No segundo G, as ratas grávidas foram divididas em: G3 (mães controles), mães que receberam iip de solução salina 0,9% e G4 (mães diabéticas), mães que receberam iip de aloxana (100mg/kg) diluída em solução salina 0,9%. A glicemia foi verificada 2 dias após a indução e os animais foram considerados diabéticos se apresentassem glicemia maior ou igual a 150mg/dL. Cerca de 50 dias após o parto para G3 e G4 e em tempo correspondente para G1 e G2, as ratas foram submetidas à aferição indireta de PAS por pletismografia, bem como à determinação da Taxa de Filtração Glomerular (TFG) pelo clearance de creatinina. Em seguida, os animais foram anestesiados e tiveram seus rins retirados para as análises histológica, morfométrica e imunohistoquímica. Os resultados mostraram que os animais de G2 e G4 apresentaram glicemia (mg/dL) e volume urinário (mL) maiores que os animais de G1 e G2 vários dias pós-indução do DM do tipo 1. Os valores de PAS (mmHg) não foram diferentes entre os grupos analisados, mas constatou-se uma tendência à redução da TFG (mL/min) de G4 quando comparado aos demais G. Observou-se também um aumento significativo da relação peso rim/peso do corpo (direito e esquerdo) dos animais de G4 em relação aos demais G. As análises morfométricas evidenciaram redução da área de secção renal total de G4 e aumento em G3. A área glomerular e o espaço capsular não diferiram entre os G estudados, mas houve aumento da área de tufo glomerular em G3 e G4. A quantificação da porcentagem de colágeno cortical mostrou que G2 e G4 tiveram maior expressão, ao passo que a identificação e contagem de mastócitos não diferiram entre os G. Quanto à imunorreação para PCNA, o G3 apresentou aumento de células PCNA+ glomerulares, ao passo que em G4 diminuiu. Por outro lado, no compartimento tubulointersticial (TBI) a proliferação celular foi maior em G4. Já a expressão de α-SMA glomerular e TBI foram aumentadas em G4 em comparação aos demais G. A marcação para p-p38 glomerular apresentou um padrão de expressão semelhante ao PCNA, com redução de células p-p38+ em G4 em relação aos outros G. A imunorreação para p-JNK mostrou-se elevada tanto nos glomérulos quanto no compartimento TBI de G4 em relação a G1, G2 e G3. Conclui-se que o DM induzido durante a gestação e mantido no período pós-parto em ratas Wistar resultou em alterações estruturais significativas e funcionais renais moderadas, evidenciando que a gravidez possui um efeito intensificador dos danos renais induzidos pelo diabetes e que estas alterações podem estar relacionadas com as mudanças na expressão das MAPK p-p38 e p-JNK. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Orientadores: Mary Anne Heidi Dolder, Sebastiâo Roberto Taboga Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A Ciclosporina A (CsA) é um imunossupressor amplamente utilizado no tratamento pós-transplante de órgãos e contra doenças auto-imunes. Entretanto, diversos efeitos colaterais estão relacionados ao tratamento com esta droga, dentre eles nefrotoxicidade, hepatoxicidade, tremor, hipertensão, hiperlipidemia, hipercalcemia, hipertricose e hiperplasia gengival. Além destes, danos à reprodução masculina como redução na produção de testosterona e disfunção testicular são extensivamente documentados. Heteropterys aphrodisiaca é uma planta arbustiva típica do Cerrado brasileiro. É conhecida como nó-de-cachorro, sendo utilizada popularmente como tônica e afrodisíaca. Estudos anteriores confirmam a eficiência da infusão de H. aphrodisiaca contra os efeitos colaterais a CsA nos testículos. Visto isso, o objetivo do presente trabalho foi determinar os possíveis efeitos colaterais da CsA na próstata ventral de ratos Wistar e verificar se a infusão de H. aphrodisiaca seria eficiente em minimizá-los. Trinta ratos Wistar adultos (90 dias) foram divididos em cinco grupos (n=6 em cada): Grupo I (controle): tratado com água; grupo II: tratado com CsA; grupo III: tratado com infusão de H. aphrodisiaca; grupo IV: tratamento simultâneo de CsA e H. aphrodisiaca; e grupo V: tratamento com CsA e H. aphrodisiaca em dias alternados. A CsA foi administrada na dose de 15 mg/kg/dia e a infusão de nó-de-cachorro no volume de 0,5 ml por animal (infusão preparada com 25 g de raiz seca e moída em 100 ml de água fervida). Todos os tratamentos foram realizados diariamente, durante 56 dias. Após este período os animais foram pesados e eutanasiados. Testículo, epidídimo, glândula vesicular, glândula de coagulação e próstata ventral foram coletados e pesados. A próstata ventral foi dividida em três porções. Uma foi fixada em Karnovsky e processada para inclusão em metacrilato; este material foi utilizado para análises morfológicas, morfométricas e estereológicas do tecido. A segunda porção, também fixada com Karnovsky, foi processada para inclusão em Epon; este material foi utilizado para realização de análises em microscopia eletrônica de transmissão. Por fim, a terceira porção foi fixada em Metacarn e incluída em parafina para realização de imunohistoquímica para detecção de receptor de andrógeno e técnica para detecção de apoptose (TUNEL). As análises morfológicas, morfométricas, estereológicas e ultraestruturais mostraram que o tratamento com a infusão de H. aphrodisiaca não causou nenhuma alteração na próstata ventral. Por outro lado, o tratamento com CsA causou severos danos a este tecido como redução nos volumes de lumen, epitélio, estroma muscular e não muscular, além de atrofia do epitélio. A análise ultraestrutural mostrou que nas células do epitélio atrofiado havia redução das organelas relacionadas à secreção de proteínas (retículo endoplasmático rugoso e complexo de Golgi), o que provavelmente leva à diminuição de sua atividade secretora. O tratamento conjunto de CsA e H. aphrodisiaca aparentemente reduziu os danos causados na próstata, o que foi evidenciado pela normalização nos parâmetros analisados que haviam sido prejudicados pela administração somente da CsA. Nenhuma alteração entre os grupos experimentais foi observada no padrão de marcação imunohistoquímica para receptores de andrógeno e no índice apoptótico. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com CsA causa danos na estrutura prostática que provavelmente refletem em danos funcionais ao tecido. Além disso, foi confirmada a ação protetora da infusão de H. aphrodisiaca contra os efeitos colaterais da CsA na próstata ventral de ratos Wistar Abstract: Cyclosporin A (CsA) is an immunosuppressive drug widely used in the post-operative treatment after organ transplants and against auto-immune diseases. However, various side effects have been associated with the use of this drug, including nephrotoxicity, hepatotoxicity, tremors, hypertension, hyperlipidemy, hypercalcicity, hypertrichosia and hyperplasticity of the gums. Besides these, damage to the male reproductive system, such as diminished testosterone production and testicular dysfunction, have been extensively documented. Heteropterys aphrodisiaca is a bush, typical of the Brazilian "Cerrado" region. It is known as "nó-de-cachorro" and used in traditional medicine as a tonic and an aphrodisiac drink. Previous studies confirm the efficiency of H. aphrodisiaca against the side effects of CsA in rat testicles. As a consequence, this research was undertaken with the aim of determining the possible collateral effects of CsA in the ventral prostate of Wistar rats and to verify whether the infusion of H. aphrodisiaca would be efficient to diminish the possible collateral effects of CsA in this organ. Thirty adult Wistar rats (90 days old) were divided into five groups (n=6 in each). Group I (control) was treated with water, Group II with CsA, group III received the H. aphrodisiaca infusion, group IV was treated simultaneously with CsA and H. aphrodisiaca infusion and group V received CsA or H. aphrodisiaca infusion on alternate days. CsA was administered in the dose of 15 mg/kg/day and the infusion in a volume of 0.5 ml per animal (infusion prepared with 25 g of dry ground roots in 100 ml of boiling water). All treatments were given daily for 56 days. After this period the rats were weighed and euthanized. Testis, epididymis, vesicular gland, coagulating gland and the ventral prostate were collected and weighed. The ventral prostate was divided into three portions. One was fixed in Karnovsky fixative and processed for inclusion in methacrylate. This portion was used for morphological, morphometrical and stereological analysis of the tissue. A second portion, fixed in the same manner, was processed for inclusion in Epon and analyzed with the transmission electron microscope. The last portion was fixed in Metacarn and included in paraffin to be used for immunohistochemistry of the androgen receptor and the TUNEL technique for apoptosis. The morphological, morphometrical, stereological and ultrastructural analyses showed that the H. aphrodisiaca infusion did not cause any alteration of the prostatic tissue. On the other hand, CsA treatment resulted in severe damage to the tissue, reducing the lumen, epithelium, muscular and non-muscular stroma. Atrophied epithelium was observed after CsA administration. Ultrastructural analysis showed that the atrophied epithelium had reduced organelles involved in protein secretion (rough endoplasmic reticulum and Golgi complex) which probably causes decreased secretory activity of the cells. The simultaneous treatment of CsA and H. aphrodisiaca apparently reduced the prostatic damage, since these were less damaged when compared to the prostate of animals that received only CsA. No alteration was found in the pattern of immunohistochemical labeling for androgen receptors and the apoptotic index, for all experimental groups. The results showed that CsA treatment caused structural damage to the prostate which probably reflected functional damage to the organ. The protective action of the H. aphrodisiaca infusion against the collateral effects of CsA was also confirmed for this organ. Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais A IL-9 é uma citocina pleiotrópica, recentemente reconhecida como pertencente às células Th9 que estão envolvidas em diversas patologias. Nós objetivamos avaliar o papel da IL-9 no curso da fibrose hepática e renal. Camundongos C57BL/6 fêmeas foram tratados, por via subcutânea, com IL-9 100ng e 200ng durante 40 dias, alternando de 5 em 5 dias cada aplicação, cujo controle negativo foi tratado com PBS e controle positivo com CCL4. IL-9 manifestou atividade fibrogênica, levando aumento da deposição de colágeno I e III tanto no fígado quanto no rim, bem como desencadeou hepatite lobular com a fibrose no estágio 1. Além disso, induziu resposta inflamatória com o recrutamento de linfócitos, neutrófilos e macrófagos em ambos os órgãos. A inflamação foi presente na região da zona portal e parenquimal no fígado, e na zona cortical e medular nos rins. IL-9 regulou a expressão gênica de TGF-β1 e α-SMA, sendo sugerida como possíveis responsáveis pela ativação das células de Ito e miofibroblastos renais. A atividade pró-inflamatória da IL-9 desencadeou estresse oxidativo, levando a oxidação das proteínas e dos lipídios presentes na membrana celular dos hepatócitos e nas células renais. Concomitante, ocorreu diminuição da atividade das enzimas antioxidantes, bem como da capacidade total antioxidante do fígado e do rim. Nossos resultados sugerem papel deletério da IL-9 no aumento da fibrose hepática e renal, com exacerbação da resposta inflamatória, indicando que a mesma poder ser alvo terapêutico para o tratamento dessas doenças. IL-9 is a pleiotropic cytokine, recently recognized as belonging to Th9 cells that are involved in various pathologies. We aimed to evaluate the role of IL-9 in the course of hepatic and renal fibrosis. Female C57BL/6 mice were treated subcutaneously with IL-9 100ng and 200ng during 40 days, alternating every 5 days each application, the negative control of which was treated with PBS and positive control with CCL4. IL-9 demonstrated fibrogenic activity, leading to increased collagen I and III deposition in both liver and kidney, as well as triggering lobular hepatitis with stage 1 fibrosis. In addition, IL-9 induced an inflammatory response with recruitment of lymphocytes, neutrophils, and macrophages In both organs. The inflammation was present in the region of the portal and parenchymal zone in the liver, and in the cortical and medullary zone in the kidneys. IL-9 regulated the gene expression of TGF-β and α-SMA, being responsible for the activation of Ito cells and renal myofibroblasts. The proinflammatory activity of IL-9 triggered oxidative stress, leading to oxidation of proteins and lipids present in the cell membrane of hepatocytes and renal cells. At the same time, there was a decrease in the activity of antioxidant enzymes as well as the total antioxidant capacity of the liver and kidney. Our results suggest deleterious role of IL-9 in the increase of renal and hepatic fibrosis, with exacerbation of the inflammatory response, indicating that it may be a therapeutic target for the treatment of these diseases. Dissertação (Mestrado)

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais O diabetes materno interfere na sinalização hormonal e afeta a estrutura da próstata de roedores adultos. Contudo, os efeitos do ambiente hiperglicêmico sobre a próstata de neonatos não são bem descritos. Além de se desenvolverem sob condições hiperglicêmicas os filhotes de ratas diabéticas podem nascer moderadamente hiperglicêmicos. Visto que os eventos pós-natais são críticos para o desenvolvimento e maturação prostáticos, é essencial esclarecer o impacto de concentrações aumentadas de glicose nos primeiros dias após o nascimento. O trabalho teve como objetivo avaliar in vitro os efeitos de diferentes concentrações de glicose no desenvolvimento pós-natal da próstata. As próstatas foram removidas de ratos recém-nascidos (dia 0) e cultivadas por 1, 2 e 3 dias em DMEM com glicose a 100 mg/dL (Controle), 225 mg/dL (glicose moderada) ou 450mg/dL (alta glicose). As amostras foram processadas para análise histológica (coloração por H&E e Picrosirius); imunohistoquímica para α-actina de músculo liso e PCNA; ou homogeneizadas para avaliação da atividade de caspases, concentração de TGF-β pelo método ELISA e quantificação das proteínas p- ERK1/2 e MMP-2 por Western blot. Como resultado, observou-se que a alta concentração de glicose reduz o número de brotos prostáticos e leva à perda maciça de células em proliferação, tanto epiteliais como estromais, em relação ao grupo controle. O aumento natural na deposição de colágeno observado no controle durante os primeiros 3 dias de desenvolvimento é afetado pelos níveis aumentados de glicose, sendo que os grupos tratados apresentam severa diminuição na distribuição dessa proteína. Além disso, a frequência de células musculares lisas também é reduzida pelos ambientes de concentrações moderada e alta de glicose. A atividade da caspase é significativamente maior em próstatas incubadas em concentração moderada de glicose e há aumento expressivo da concentração de TGF-β nos grupos tratados em relação ao controle. Por fim, observou-se que a produção de p-ERK1/2 e MMP-2 foi desestimulada nos grupos tratados. Esses dados mostram que o desenvolvimento pós-natal da próstata de ratos é afetado por níveis elevados de glicose visto que estes comprometem a estrutura glandular pela redução de células em divisão; pelo prejuízo a importantes moléculas sinalizadoras que participam dos processos de proliferação e sobrevivência celular; por meio do aumento de morte celular e diminuição de elementos estromais. Maternal diabetes interferes with hormone signaling and affects the adult rodent prostate structure. However, the effects of the hyperglycemic environment on the prostate of neonates are not well described. In addition to developing under hyperglycemic conditions, pups of diabetic rats may be born moderately hyperglycemic. Since postnatal events are critical for prostate development and maturation, clarifying the impact of increased glucose concentrations in the first few days after birth is essential. We aimed to evaluate in vitro effects of different glucose concentrations on postnatal prostate development. Prostates were removed from newborn rats (day 0) and cultured for 1, 2 and 3 days in DMEM under glucose at 100 mg / dL (Control), 225 mg / dL (moderate glucose) or 450 mg / dL (high glucose) . Samples were processed for histological analysis (H&E and Picrosirius staining); immunohistochemistry for smooth muscle α-actin and PCNA; or homogenized for evaluation of caspase activity, TGF-β concentration by the ELISA method and quantification of p- ERK1/2 and MMP-2 proteins by Western blot. High glucose concentration reduces the number of prostatic buds and induces massive loss of proliferating cells, both epithelial and stromal, compared to control. The natural increase in collagen deposition observed in the control during the first 3 days of development is affected by increased glucose concentrations since treated groups presented drastic reduction on collagen distribution. In addition, the frequency of smooth muscle cells is also reduced by environments of moderate to high glucose concentrations. The activity of caspase is significantly higher in prostates incubated at moderate glucose concentration and there is an expressive increase of TGF-β concentration in the treated groups compared to control. Finally, it was observed that the activation of p-ERK1 / 2 and the content MMP-2 decreased in the treated groups. These data show that rat prostate postnatal development is affected by elevated glucose levels, imparing glandular structure by mitosis reduction; damage to important signaling molecules, who have part on cell proliferation and survival; by increasing cell death and decreasing stromal elements. Dissertação (Mestrado)

Atualmente tem se discutido uma possível relação entre obesidade e câncer de próstata. No entanto, a obesidade está associada a desordens multifatoriais (hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia, inflamação) e avaliar o impacto delas em células normais e tumorais é de grande relevância para a elaboração de estratégias terapêuticas. A metformina é uma droga antidiabética que apresenta efeitos antiproliferativos e tem sido apontada como tratamento para o câncer. Entretanto, sua eficiência em condições de intenso estímulo proliferativo ainda é desconhecida. Assim, este estudo objetivou analisar o efeito de altas concentrações de ácido graxo e/ou insulina, com ou sem metformina,em células normais e tumorais de próstata, com ênfase no perfil de proliferação e migração destas células. Foram utilizadas duas linhagens de células epiteliais humanas de próstata, sendo elas normais (PNT1A) e tumorais (PC3). Estas células foram tratadas com altas concentrações de ácido graxo saturado (100 gM palmitato, HF), e/ou insulina (50gU), na presença ou ausência de metformina (100 gM), por 24hrs ou 48hrs. Posteriormente, estas células foram submetidas às análises de apoptose, viabilidade/proliferação celular (MTT), migração e imunofluorescência para vimentina. Os resultados mostram que, de maneira geral, os tratamentos nas concentrações usadas não causaram morte celular nas células estudadas. O MTT revelou que as células PNT1A e PC3 proliferaram em maior quantidade quando tratadas com altas concentrações de ácido graxos (HF) e de insulina (HI) após as primeiras horas de tratamento. O mesmo resultado não foi observado para o grupo HFI. A metformina por si só estimulou a proliferação celular, mas em associação à HF foi capaz de reduzi-la em ambas as linhagens. Contudo, ela não inibiu a proliferação celular desencadeada por HI nas células normais.As análises de migração mostraram que PNT1A foram estimuladas a migrar para todos os tratamentos, enquanto PC3 foi influenciada somente por HF. A metformina inibiu a migração estimulada por todos eles. Em paralelo à migração, foi observado que os tratamentos HF e HI para PNT1A e HF para PC3 estimularam a maior expressão de vimentina, demonstrando maior transição epitélio mesenquima nessas células, e, consequentemente, estimulando a migração celular. A metformina inibiu a expressão de vimentina estimulada pelos meios tanto nas células normais como nas tumorais. Assim, conclui-se que as altas concentrações de ácido graxo saturado e insulina interferem nas células prostáticas estimulando atividades celulares que sabidamente influenciam na carcinogênese, tais como proliferação e migração celular.A metformina foi capaz de reverter boa parte das alterações estimuladas por esses meios, se mostrando uma boa ferramenta no controle da proliferação e migração celular em situações de hiperlipidemia e hiperinsulinemia. Assim, o potencial dessa droga para a terapia de pacientes obesos que sabidamente apresentam maior risco para câncer de próstata deverá ser investigado. A potential association between obesity and prostate cancer has been proposed by several studies. Obesity is related with multifactorial disorders, such as hyperglycemia, hyperinsulinaemia, dyslipidemia, and inflammation. Regarding the impact of such disorders on normal and tumor cells is of great relevance for the development of therapeutic strategies. Metformin, an antidiabetic drug, has antiproliferative effects, being proposed as a cancer treatment. However, under intense proliferative stimulation conditions, its efficiency is still uncertain. The main objective of the present study was to analyze the effects of fatty acid and/or insulin under high concentrations, in the presence or not of metformin, on normal and prostate tumor cells, regarding their proliferation and migration profile. Two human prostate epithelial cell lines were used: non cancer (PNT1A) and tumor (PC3). These cells were treated with high concentrations of saturated fatty acid (100 gM palmitate, HF), and/or insulin (50 gU) in the presence or absence of metformin (100 gM) for 24 or 48 hours. After treatments we performed analyzes for caspase, cell viability/proliferation (MTT), migration and immunofluorescence for vimentin. The results showed that the concentration of all treatments was not cytotoxic. MTT revealed that PNT1A and PC3 cells had higher proliferation when treated with HF and HI after the first few hours of treatment. Similar results were not found for the HFI group. Metformin alone has stimulated cell proliferation, but in association with HF, has reduced it in both cell lines. However it did not inhibit the proliferative action of HI in PNT1A cells. Migration analyzes showed that PNT1A were stimulated to migrate after all treatments, whilst PC3 was influenced only by HF and that metformin inhibited the migration stimulated by all of them. Both HF and HI treatments in PNT1A and HF in PC3 stimulated greater vimentin expression, resulting in a larger epithelium-mesenchymal transition in these cells, which, in turns, has stimulated cell migration. Metformin inhibited vimentin expression in both normal and tumor cells. It is possible to conclude that higher concentrations of saturated fatty acid and insulin influence prostatic cells, stimulating cellular activities that could trigger carcinogenesis and/or sustain cancer progression, such as cell proliferation and migration. Most of these stimuli were inhibited by using Metformin, being efficient in the control of cell proliferation and migration in conditions of hyperlipidemia and hyperinsulinemia. Thus, the efficiency of this drug for obese patients therapy, which is a potential group for prostrate cancer risk, should be investigated. Dissertação (Mestrado)

As queimaduras encontram-se entre as causas principais de morbidade e mortalidade nos países em desenvolvimento e é o ambiente ideal para infecção sendo responsável por pelo menos 75% dos casos de óbito. A mortalidade é bimodal com um pico precoce associado ao choque do queimado e/ou injúrias inalatórias e um pico ligado à complicações sépticas. Durante o período de 15 anos 2000-2015 duzentos e vinte e três (68%) foram classificados como tendo queimaduras graves, satisfazendo os critérios e foram incluídos no nosso estudo. O Tabagismo esteve presente aumentando a chance de infecção em 5,37 vezes, Etilismo não foi significativo quando relacionado a infecção em queimados. O risco de infecção em pacientes foi 4,4 vezes maior naqueles internados mais de 15 dias. Os pacientes que sofrem queimadura na rua apresentam o risco 3,7 vezes maior de infecção do que os pacientes que sofrem queimadura em outros ambientes. A infecção esteve presente em 90 casos (39,1%)com cultura positiva Infecção no local da queimadura (17,4%), urina (6,5%), pulmonar (6,1%)infecções da corrente sanguínea (5,2%), infecções do cateter (3,25%). Os agentes isolados foram Staphylococcus aureu (4,3%), Pseudomonas sp.(3,9%) Escherichia coli (3,5%) Acinetobacter baumanni(3,0%). Burns are among the leading causes of morbidity and mortality in developing countries and is the ideal environment for infection accounting for at least 75% of death cases. Mortality is bimodal with an early peak associated with the shock of burnt and / or inhalation injuries and a peak linked to septic complications. During the 15 year period 2000-2015 two hundred twenty-three (68%) were classified as having severe burns, satisfying the criteria and were included in our study. The smoking was present increasing the chance of infection in 5.37 times, Alcoholism was not significant when related to infection in burn. The risk of infection in patients was 4.4 times higher among those hospitalized longer than 15 days. Patients suffering from sunburn on the street have the 3.7 times greater risk of infection than patients suffering burns in other environments. The infection was present in 90 cases (39.1%) with positive culture infection in burn site (17.4%), urine (6.5%), lung (6.1%) bloodstream infections (5, 2%), catheter infection (3.25%). The agents were Staphylococcus aureu (4.3%), Pseudomonas sp. (3.9%) Escherichia coli (3.5%) Acinetobacter baumannii (3.0%). Tese (Doutorado)

Gestational diabetes is defined as any degree of reduction of glucose tolerance, whose early detection occurs during pregnancy and may or may not persist after delivery. Studies indicate that the offspring of diabetic mothers display abnormal changes in development as well as metabolic disorders. The prostate gland is androgen-dependent and highly sensitive to hormonal disorders as well as to changes in blood glucose. Recent studies have shown that diabetes causes drastic atrophy in the prostate of rodents, interferes with the proliferation and apoptosis of epithelial cells, alters expression of androgen receptor and leads to significant stromal remodeling. However, little is known about the effects of diabetes later in embryonic development of the prostate. This study was important because there are no studies that show the effects of diabetes on the development of prostate rats whose mothers were diabetic. The aim of this study was to evaluate the organization of epithelial and stromal prostate of adult rats whose embryonic development was under the influence of gestational diabetes. Diabetes was induced in Wistar pregnant females rats by intraperitoneal injection of alloxan (100mg/kg body weight). Male rats offspring of diabetic (PD) and normal mothers (PC) were killed at 12 weeks of age and the ventral prostate was removed, weighed and fixed. The prostate was evaluated for general histology, frequency of collagen fibers, cell death (TUNEL), immunohistochemistry (fibroblasts, fibronectin, smooth muscle cells, cell proliferation - PCNA), western blotting (PCNA, metalloproteinases - MMP-2 and -9, androgen receptors, AKT), zymography and total antioxidant activity and catalase. The prostate of PD animals showed lower weight compared to the PC group and these animals also exhibited hyperglycemia and a significant reduction of testosterone. Cell proliferation as well as the levels of AKT and AR were higher in the offspring of diabetic mothers. The stromal analysis showed that the PD group showed a reduction of -actin, while vimentin and fibronectin did not change. The activity of MMP-2 is increased in PD animals, although the distribution of this MMP was lower in this group. This finding was associated with a significant decrease in collagen distribution. The prostate of the offspring of diabetic rats also showed reduced activity of catalase and total antioxidant activity. The results indicate that rats that developed in a diabetic environment have glycemic and hormonal changes that impact on structural changes in the ventral prostate. Among them, there is greater cell proliferation triggered by AR and AKT and stromal remodeling, which was characterized by increased activity of MMP-2 and collagen degradation. This situation may interfere with tissue architecture and homeostasis glandular. Moreover, the stroma is negatively affected by a decrease in smooth muscle cells, possibly impairing the contraction of the gland as well as the epithelium-stroma interaction stimulated by these cells. This work also shows that gestational diabetes may increase oxidative stress by reducing the activity of enzymes control. O diabetes gestacional é definido como qualquer grau de redução da tolerância à glicose, cujo início ou detecção ocorre durante a gravidez, podendo ou não persistir após o parto. Estudos indicam que a prole de mães diabéticas exibe mudanças anormais no desenvolvimento, bem como desordens metabólicas. A próstata é uma glândula andrógeno-dependente e altamente sensível aos distúrbios hormonais e também às variações de glicemia. Estudos recentes mostram que o diabetes causa drástica atrofia na próstata de roedores, interfere na proliferação e apoptose de células epiteliais, altera a expressão de receptores androgênicos e leva à importante remodelação estromal. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos efeitos posteriores do diabetes no desenvolvimento embrionário da próstata. Este estudo é relevante pelo fato de não existirem trabalhos que evidenciem os efeitos do diabetes no desenvolvimento da próstata de ratos cujas mães eram diabéticas. O objetivo geral deste estudo foi avaliar a próstata de ratos adultos cujo desenvolvimento embrionário ocorreu sob influência do diabetes materno. O diabetes foi induzido em ratos Wistas fêmeas prenhas com uso de injeção intraperitoneal de aloxana (100mg/kg de peso corporal). Os ratos machos proles de mães diabéticas (PD) ou normais (PC) foram mortos com 12 semanas de idade e a próstata ventral foi removida, pesada e fixada. A próstata foi avaliada para histologia geral, freqüência de fibras colágenas, morte celular (TUNEL), imunohistoquímica (fibroblastos, fibronectina, células musculares lisas, proliferação celular - PCNA); western blotting (PCNA, metaloproteinases - MMP-2 e -9, receptores de andrógeno, AKT), zimografia e atividade antioxidante total e catalase. A próstata dos animais PD apresentou menor peso em relação ao grupo PC e esses animais também apresentaram hiperglicemia e redução significativa de testosterona. A proliferação celular, bem como os níveis de AR e AKT, foram maiores nos ratos proles de mães diabéticas. A avaliação dos componentes estromais mostrou que o grupo PD apresentou redução de -actina, enquanto a vimentina e fibronectina não apresentaram alteração. A zimografia detectou que a atividade de MMP-2 está aumentada nos animais PD, embora a distribuição dessa MMP tenha sido menor nesse grupo. Esse dado esteve associado à significativa diminuição de colágeno. A próstata da prole de ratas diabéticas apresentou ainda reduzida atividade de catalase e atividade antioxidante total. Os resultados indicam que os ratos que passaram por um ambiente diabético durante o seu desenvolvimento apresentam alterações glicêmicas e hormonais que impactam em modificações estruturais na próstata ventral. Dentre elas, destaca-se maior proliferação celular desencadeada por AR e AKT e reorganização estromal, que foi caracterizada por maior atividade de MMP-2 e degradação de colágeno, podendo interferir na arquitetura tecidual e na homeostase glandular. Além disso, o estroma é afetado negativamente pela diminuição de células musculares lisas, podendo prejudicar a contração da glândula bem como nas interações epitélio-estromais estimuladas por essas células. Esse trabalho mostra ainda que o diabetes gestacional pode aumentar o estresse oxidativo através da redução na atividade de enzimas de controle. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

The skin covers the entire body, because it is the largest organ of the body is composed of three distinct layers, it is extremely important physiological. The present study was conducted surgical incisions in rats and tested the effectiveness of two drugs, comfrey and silver sulfadiazine in tissue repair analyzing extracellular matrix, level of re-epithelialization of skin collagen quantification, counting of mast cells,Count of blood vessels, Determination of hemoglobin Dosage ,Dosage of NAG activity, and activity myeloperoxidase. Soon this work aims and main scope is to provide a more thorough analysis and scientific content of Symphytum officinale (comfrey) widely used in popular culture for its healing properties anti-inflammatory and healing in dermatological treatment comparing well with agent widely used silver sulfadiazine 1%. Concludes that the comfrey plays a key role in wound healing with its anti-inflammatory and certainly opens up new possibilities for action, based on the mechanism of degranulation of mast cells and neutrophils during the repair phase, decreased angiogenesis best arrangement of collagen and has the potential to provide better performance for the healing of wounds. A pele reveste todo o corpo, devido a isso é considerado o maior órgão do corpo e é composta por três camadas distintas, sendo de extrema importância fisiológica. Feridas na pele podem comprometer a integridade tecidual da mesma e trazer problemas maiores ao organismo. Para tanto são utilizados, rotineiramente, fármacos que tentam controlar principalmente, a resposta inflamatória que pode se tornar prejudicial para o reparo eficiente. Embora o uso de algumas plantas pela medicina popular, seja extremamente difundido, existe uma carência de dados científicos relacionados a este uso. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo analisar o reparo em pele após lesão cirúrgica, através da aplicação de pomada de confrei (uma planta que apresenta propriedades anti-inflamatórias) e sulfadiazina de prata. Tendo como foco de análise o comportamento da matriz extracelular no processo de reparação tecidual. Logo este trabalho almeja proporcionar uma análise mais aprofundada e com conteúdo científico do Symphytum officinale (confrei), devido a sua utilização como agente cicatrizante. Para tanto, os animais tiveram sua pele dorsal lesionada e os fármacos foram aplicados por 3 e 7 dias após a lesão. O material foi processado para a morfologia ou foi congelado para que fossem feitas as análises bioquímicas. O grupo de animais tratado com o confrei mostrou uma melhor evolução do reparo, se comparado com os demais grupos. Portanto, se conclui que a pomada de confrei auxilia, favorece a cicatrização com suas propriedades anti-inflamatórias ao diminuir a angiogênese, melhorar a deposição do colágeno e controlar a presença de células inflamatórias e tem o potencial de assegurar um melhor desempenho para a cura dos ferimentos. Em resumo a utilização do confrei abre novas possibilidades para sua utilização na prática médica. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Orientador: Rejane Maira Góes Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The abstract is available with the full electronic document Mestrado Biologia Celular Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Sebastião Roberto Taboga, Silvana Gisele Pegorin de Campos Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Um dos principais desafios no campo de pesquisa do câncer prostático é a busca por sistemas modelo que permitam a investigação dos aspectos patológicos, bioquímicos e genéticos desta doença. O gerbilo Meriones unguiculatus tem possibilitado a avaliação de lesões prostáticas e sua evolução de estágio benigno para maligno (invasivo) após período relativamente curto de tratamento com o carcinógeno N-Metil-N-Nitrosuréia (MNU), um potente causador de metilação do DNA por ação direta. Assim, o presente trabalho teve por objetivos: 1) Determinar a incidência, multiplicidade e latência tumoral de lesões espontâneas e quimicamente induzidas nos lobos prostáticos ventral e dorsolateral do gerbilo; 2) Investigar se o estradiol exerce papel protetor e/ou promotor sobre neoplasias induzidas por MNU; 3) Avaliar o potencial promotor da dieta hiperlipídica sobre a carcinogênese induzida na próstata ventral; 4) Analisar a participação de produtos alterados de genes ras e do status global de metilação do DNA do epitélio prostático no processo tumoral mediado por MNU. Para tanto foram utilizados animais adultos submetidos à dose única intraperitoneal de MNU (50mg/Kg), exceto o grupo controle. Os grupos experimentais foram submetidos à exposição crônica de andrógeno, estradiol ou dieta hiperlipídica por 14 e 28 semanas. As metodologias aplicadas envolveram análises quantitativas e estatísticas de multiplicidade e incidência de lesões prostáticas, peso corporal, acúmulo de gordura corporal, peso prostático, dosagens hormonais, índice proliferativo, cariometria, frequência de células AR-positivas e basais, status global de metilação e determinação da expressão de proteínas. O modelo de indução tumoral prostática por MNU associado à testosterona no gerbilo se mostrou eficaz, pois reduziu a latência tumoral e permitiu o estudo de estágios avançados da carcinogênese após curto período. As neoplasias se manifestam inicialmente no lobo dorsolateral e requerem um tempo maior para se estabelecer no lobo ventral. No entanto, a progressão de lesões pré-malignas para malignas ocorre de maneira mais significativa no lobo ventral. Isso indica que a progressão tumoral ocorre de maneira distinta entre os lobos prostáticos e que vias alternativas estão possivelmente envolvidas nesse processo. A longa exposição a altas doses de estrógeno foi capaz de prevenir e reduzir a taxa de crescimento tumoral. Apesar dos efeitos terapêuticos contra a progressão neoplásica, a terapia estrogênica levou ao estabelecimento de um epitélio com características distintas da próstata normal, como: mudanças no padrão de metilação do DNA e aumento de células basais e AR positivas. Juntos, esses eventos contribuíram para criar um ambiente epitelial instável que pode provocar a recidiva das lesões em períodos subsequentes. A associação entre MNU e dieta hiperlipídica promoveu aumento na incidência de lesões estimuladas pelo carcinógeno isoladamente, as quais apresentaram maior número de células AR-positivas, ruptura da camada de músculo liso indicando microinvasão tumoral, e alta reatividade para metaloproteinase do tipo 2. A análise molecular indicou alta expressão das proteínas Ras em tecidos induzidos por MNU, sugerindo a participação dessa via na promoção e progressão de tumores prostáticos. Assim, conclui-se que a dieta hiperlipídica pode ser considerada um agente promotor da carcinogênese prostática, e o gerbilo representa um bom modelo para estudos histopatológicos Abstract: One of the major challenges in the field of prostate cancer research is the search for model systems that allow the investigation of pathological, biochemical and genetic factors of this disease. The gerbil Meriones unguiculatus has enabled the evaluation of prostate lesions and evolution from benign to malignant (invasive) stage after a relatively short period of treatment with the carcinogen N-methyl-N-nitrosourea (MNU), a potent causative of DNA methylation by direct action. Thus, this study aimed to: 1) Determine the incidence, multiplicity, and tumor latency of spontaneous and chemically-induced lesions in ventral and dorsolateral gerbils' prostatic lobes; 2) Investigate whether estradiol exerts protective and/or promoter hole on neoplasms induced by MNU; 3) Evaluate the promotional potential of high-fat diet on induced-carcinogenesis in ventral prostate; 4) Analyze the involvement of altered ras gene products and the global DNA methylation status of prostate epithelium on MNU-mediated tumor process. Therefore, we used adult animals subjected to a single intraperitoneal dose (50mg/kg) of MNU, except the control group. The experimental groups were subjected to chronic exposure of androgen, estradiol or high-fat diet for 14 and 28 weeks. The methodologies involved quantitative and statistical analysis of multiplicity and incidence of prostatic lesions, body weight, body fat accumulation, prostate weight, hormonal measurements, proliferative index, karyometry, frequency of AR-positive and basal cells, global methylation status and determination of protein expression. The model of prostatic tumor induction by MNU associated with testosterone in the gerbil was effective because it reduced tumor latency and allows the study of advanced stages of carcinogenesis after short period. Neoplasms manifest initially in dorsolateral lobe and require a longer time to be established in ventral lobe. However, the progression from premalignant to malignant lesions occurs more significantly in the ventral lobe. This indicates that tumor progression occurs differently between prostatic lobes and alternative pathways maybe possibly involved in this process. Long exposure to high doses of estrogen was able to prevent and reduce the rate of tumor growth. Despite therapeutic effects against neoplastic progression, estrogen therapy led to the establishment of an epithelium with distinct characteristics from normal prostate, such as changes in the pattern of DNA methylation and increased amount of basal cell and ARpositive cells. Together, these events contributed to create an unstable epithelial compartment that can cause lesions recurrence in subsequent periods. The association between MNU and high-fat diet promoted an increase in incidence of lesions stimulated by carcinogen alone, which had a higher number of AR-positive cells, disruption of the smooth muscle layer indicating tumor microinvasion and high reactivity for metalloproteinase type 2. Molecular analysis indicated high expression of Ras proteins in tissues induced by MNU, suggesting the involvement of this pathway in the promotion and progression of prostate tumors. Thus, we conclude that the high-fat diet can be considered a promotional agent of prostate carcinogenesis and that gerbil is a good model for histopathological studies Doutorado Biologia Celular Doutora em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Sebastião Roberto Taboga Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A próstata, glândula do sistema genital que tem origem embrionária a partir do seio urogenital, não é exclusiva do sistema reprodutor masculino, sendo também encontrada em fêmeas de vários mamíferos, incluindo humanos e roedores. No macho ela pode apresentar-se altamente desenvolvida em razão da maior quantidade do hormônio testosterona, e, apesar de pouco desenvolvida em fêmeas, devido à baixa quantidade desse mesmo tipo hormonal, é uma glândula funcional. Em fêmeas adultas de gerbilos, a próstata possui uma localização parauretral, exibindo íntimo contato com a parede proximal e medial da uretra, a qual é homóloga a próstata ventral de roedores machos. Embora se conheça a influência da progesterona na fisiologia do sistema reprodutor feminino e masculino, poucos estudos exploram a sua influência, especificamente, sobre a glândula prostática. Desta forma, este trabalho avaliou os aspectos morfofuncionais da glândula prostática masculina e feminina, resultantes da influência da progesterona, e de suas interações com o estradiol e a testosterona. Para isso, gerbilos machos e fêmeas foram castrados cirurgicamente no início do período puberal, aos 45 dias de idade. Ao completarem 90 dias de idade, os gerbilos receberam doses subcutâneas de progesterona ou desse somado a estradiol e testosterona, durante 14 dias. Nos animais castrados de ambos os sexos a próstata mostrou uma morfologia regredida, com uma redução significativa na sua capacidade de secreção, da quantidade de células receptoras de androgênio (AR) e receptoras de estrógeno ? (ER?), porém sem alterar a marcação para receptor de estrógeno ? (ER?). Dessa forma, a castração cirúrgica foi bastante importante, uma vez que permitiu mimetizar de forma satisfatória um ambiente prostático com baixos níveis hormonais. Nos dois sexos, a administração de progesterona isoladamente conseguiu reverter alguns desses efeitos, com uma melhora considerável no padrão secretório da glândula, porém estruturalmente essas mudanças ocorreram de forma moderada. Nesses animais, foi observado um aumento expressivo dos ERs ? e ?, além da presença de células receptoras de progesterona (PR). Em relação aos ARs foi evidenciado que a progesterona pode apresentar características indutoras ou inibitórias dependendo da sua concentração. O tratamento, simultâneo com a progesterona, de estradiol e testosterona desencadeou uma reestruturação glandular mais intensa nos machos e fêmeas, resultando em hipertrofia e hiperplasia do epitélio e do estroma glandular, recuperação do padrão de secreção e amplitude alveolar. Essas características, no entanto, foram acompanhadas pelo surgimento de lesões prostáticas como neoplasias intraepiteliais e o surgimento de debris celulares. A interação da progesterona com o estradiol também regulou positivamente os AR, ER? e ER?, porém não apresentou qualquer efeito sobre os PRs quando comparado aos animais tratados somente com progesterona. Em adição, nesses animais houve um aumento acentuado da proliferação celular, o qual foi contrabalanceado pelo aumento também do índice de morte celular. Nos animais tratados com progesterona e testosterona, a próstata também se desenvolveu e mostrou um aumento das células AR-positivas e do índice apoptótico, havendo, entretanto uma redução dos ER?, ER? e PR. Dessa forma, é razoável concluir que a próstata feminina e masculina comporta-se de forma bastante semelhante frente à ação dos hormônios progesterona, estradiol e testosterona. Ademais, embora a progesterona apresente efeitos estruturais razoáveis na glândula prostática, a sua interação com o estrógeno e a testosterona é capaz de promover uma intensificação desses efeitos, sem recriar, porém um ambiente homeostático semelhante aos dos animais intactos. A progesterona também mostrou ser um fator regulador em potencial da atividade proliferativa e apoptótica prostática, opondo-se aos efeitos da testosterona e do estradiol. Outro fator importante é a descoberta de que a progesterona pode induzir ou inibir a presença de células AR-positivas na glândula, e que esse dualismo funcional é resultado do efeito dose-dependente desse hormônio sobre a próstata Abstract: The prostate is a gland of reproductive system that arises from the urogenital sinus, being located around the urethra below the bladder. The existence of this gland is not exclusive of the male reproductive system, being found in females of various species, including rodents and humans. In the male, it can be highly developed due to the increased amount of the testosterone, and although poorly developed in females, due to the low quantity of this hormone, it is a functional gland. The prostate of female gerbils has a paraurethral location, showing a closer contact with the proximal and medial urethra wall, being homologous to the ventral prostate of male rats. This study evaluates the morphofunctional aspects of the prostate gland in males and females, regarding the influence of progesterone, and their interactions with estradiol and testosterone. For this, male and female gerbils were surgically castrated in early pubertal period, at 45 days of age. At 90 days of age, the gerbils received subcutaneous doses of progesterone alone or associated to testosterone or estradiol during 14 days. In castrated animals of both sexes, prostate showed a regressed morphology, with a significant reduction in its secretion capacity, the amount of androgen receptor cells (AR) and estrogen receptor ? (ER?), but without changing the labeling for estrogen receptor ? (ER?). Thereby, surgical castration was very important, since it allowed mimetize a prostatic environment with low hormone levels. In both sexes, the administration of progesterone alone could reverse some of these effects with a considerable secretion improvement, but structurally these changes occurred in a moderate way. In these animals, we observed a significant increase of ER ? and ?, besides the presence of progesterone receptor (PR) cells. Regarding ARs, it was shown that progesterone can have inductor or inhibitory characteristics depending on its concentration. The treatment with progesterone plus estradiol and progesterone plus testosterone triggered a more intense prostate restructuration in male and female, resulting however in a hypertrophy and hyperplasia of the glandular epithelium and stroma, besides recovery of the alveoli amplitude and pattern of cellular secretion. These characteristics, however, were followed by the development of prostatic lesions like intraepithelial neoplasia and cellular desquamation. The progesterone and estradiol interaction also upregulated the AR, ER? and ER?, however had no effect on the PRs when compared to the animals treated with progesterone alone. In addition, in these animals there was a marked increase in cellular proliferation, which was counterbalanced by increased cell death. In animals of either sex treated with progesterone and testosterone, the prostate also became developed and showed an increase of AR-positive cells and apoptotic index, although there was a reduction of ER?, ER? and PR. Thus, it is reasonable to conclude that the female and male prostate behaves similarly after the progesterone, estradiol and testosterone administration. Moreover, although the progesterone has reasonable structural effects on the prostate gland, its interaction with estrogen and testosterone can intensificate these effects, but do not recover a homeostatic environment similar to that of intact animals. The progesterone also proved to be a potential regulatory factor of the proliferative and apoptotic activity, opposing the effects of testosterone and estradiol. Another important finding is that progesterone can induce or inhibit the presence of ARpositive cells in the gland, and this functional dualism is the result of dose-dependent effect of this hormone on the prostate Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Sebastião Roberto Taboga, Fernanda Cristina Alcântara dos Santos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital quando liberada Abstract: The abstract is available with the full electronic document when available Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A espécie Heteropterys aphrodisiaca é amplamente utilizada como afrodisíaca. Estudos mostram o potencial efeito estimulante sobre o tamanho das vesículas seminais e de populações de células de Leydig em ratos, ambos andrógenos dependentes. Neste trabalho foi proposto o tratamento com a infusão de H. aphrodisiaca aliado ao exercício de resistência física com o intuito de observar seus efeitos nos testículos de ratos. Foram utilizados ratos Wistar (90 dias) divididos em 4 grupos (n=10, cada): controles - água, sedentário e com treinamento físico; tratados com H. aphrodisiaca (104mg/kg/dia) sedentário e com treinamento físico. O experimento teve duração total de 56 dias. Foi realizada dosagem de testosterona plasmática e avaliados parâmetros morfométricos e estereológicos do parênquima testicular. No epitélio seminífero, foram contados os números de células germinativas e somáticas, calculando-se o rendimento da espermatogênese, índices mitótico e meiótico e eficiência e capacidade de células de Sertoli. Foi realizado Western Blotting para quantificação da concentração de receptores de andrógeno, e TUNEL para determinação de porcentagem de células apoptóticas. A concentração de testosterona circulante foi significativamente maior nos animais tratados e sedentários. Os diâmetros médios tubulares dos animais treinados foram maiores quando comparados aos dos animais sedentários. Não ocorreram variações significativas quanto ao volume do tecido intersticial, na proporção de macrófagos, espaço linfático e vasos sanguíneos. Entretanto, ocorreram diminuições significativas na proporção de tecido conjuntivo em ambos os grupos que receberam a infusão vegetal. Houve aumentos significativos do diâmetro e volume nucleares das células de Leydig dos animais treinados. Houve diminuição significativa do número de células de Leydig por grama de parênquima testicular nos animais controle/treinados quando comparados aos outros grupos experimentais. O grupo tratado/treinado apresentou o maior índice de mitoses espermatogoniais, sendo significativamente maior que a média do grupo sedentário/tratado. As curvas de rendimento e índice mitótico possuem mesmo padrão de distribuição, entretanto, para o índice meiótico, o grupo sedentário/tratado mostrou as maiores médias quando comparado aos dois grupos controle, sedentário e treinado. Não houve alteração de índices apoptóticos tampouco na concentração de receptores androgênicos entre os grupos experimentais. O protocolo de treinamento aplicado no presente experimento não acarretou em danos no parênquima testicular, como tem sido afirmado em outros experimentos envolvendo exercício aeróbico. Contudo, a infusão de nó-de-cachorro parece influenciar tanto no estímulo de células de Leydig, com aumento do volume celular, quanto no comportamento espermatogonial, induzindo mitoses e aumentando o rendimento geral do processo espermatogênico Abstract: The species Heteropterys aphrodisiaca is traditionally used as an aphrodisiac. Some studies showed its stimulating potential of seminal vesicle and Leydig cell population growth, both androgen dependent. In this study, we proposed to observe the effects of H. aphrodisiaca infusion treatment combined with endurance exercise protocol. For this investigation, 40 adult Wistar rats (90 days) were used (4 groups, n = 10 each): two controls receiving water, sedentary and trained, and two treated with H. aphrodisiaca (104mg/kg/dia), sedentary and trained. The experiment lasted for 56 days. Plasma testosterone concentration was measured by radioimmunoassay. Morphometrical and stereological parameters were evaluated from the testicular parenchyma. The numbers of somatic and germ cells were estimated by counting the seminiferous epithelium cell population. Also, the spermatogenic yield, meiotic and mitotic index, efficiency and capacity of Sertoli cells were estimated. Western blotting was performed to quantify the concentration of androgen receptors, and TUNEL technique to determine the percentage of apoptotic cells within the seminiferous tubules. Control/trained animals showed a significant decrease in body mass gain compared to sedentary animals. The testosterone concentrations were significantly higher in treated/sedentary animals. The mean tubular diameters of trained animals were higher when compared to sedentary animals. There were no significant differences regarding the volume of interstitial tissue, the proportion and volume of macrophages, lymphatic space and blood vessels. However, the treated/sedentary group showed lower connective tissue content compared with the control/sedentary, as well as the diminished volume of Leydig cells, compared with the treated/trained group. There was a significant increase of both nuclear diameter and volume of Leydig cells in trained animals. On the other hand, there was a significant decrease of Leydig cell number per gram of testicular parenchyma in control/trained animals. Considering the spermatogenesis dynamics, both treated groups showed the highest spermatogenic yield, in relation to the control/trained group. The treated/trained group showed the highest index of spermatogonial mitosis - significantly higher than the sedentary/treated one. Spermatogenic yield and mitotic index showed the same distribution pattern when plotted on graphs; however, the meiotic index was significantly higher only in the sedentary/treated group. The apoptotic indexes, as well as the androgen receptor concentrations were not affected by the protocols employed. Treatment with the plant infusion did not lead to an increase of the parameters analyzed. However, the infusion seems to stimulate either the Leydig cell (increase of cell volume) or the spermatogonial behavior, inducing more mitosis and increasing the spermatogenic yield Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural