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B-cell receptor (BCR) signaling is central for the pathomechanism of chronic lymphocytic leukemia (CLL), and inhibitors of BCR signaling have substantially improved treatment options. To model malignant and nonmalignant BCR signaling, we quantified five components of BCR signaling (ZAP70/SYK, BTK, PLCγ2, AKT, ERK1/2) in single cells from primary human leukemic cells and from nonmalignant tissue. We measured signaling activity in a time-resolved manner after stimulation with BCR crosslinking by anti-IgM and/or anti-CD19 and with or without inhibition of phosphatases with H

Traumatic Brain Injury (TBI) is a highly complicated pathology involving multiple events occurring simultaneously including, but not limited to, inflammation, blood brain barrier disruption, apoptosis and alteration in neuronal signaling. Due to limited understanding of complex protein interactions and therapeutic exploration so far in TBI, the focus of this thesis. was on mapping large scale signaling architecture originating from the key regulators of multiple signaling events (such as cell proliferation, differentiation, apoptosis); Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) at therapeutically effective time point. We opted for an advanced unbiased approach to explore the temporal dynamics of 14 different RTK families post TBI and developed an R software-based analysis pipeline for analyzing protein array data, available on open-access GitHub repository PROTEAS (PROTein array Expression AnalysiS; github.com/Rida-Rehman/PROTEAS. Our initial investigation of temporal activation revealed that most signaling events initiate as early as 3 hours post TBI, thereby limiting our time window for acute intervention. After establishing the temporal significance, we performed a large-scale in-depth analysis of 223 tyrosine and serine/theronine kinase proteins and identified distinct signaling modules at 3h after trauma. We selected three distinct RTKs and NRTKs from the screening; Met, VEGFR1, Btk and FGFR family to exploit the therapeutic potential. Spatial relevance of these RTKs reveal increase in phosphorylation levels primarily in microglia indicating critical role of these resident immune cells. Proteomics analysis at 3h, 3d and 7d post injury also revealed changes in protein expression over time with interesting immune fingerprint over time. Inhibitor treatment with single dose pre-trauma, against these receptors, revealed positive regulation of immune response and subsequent neuroprotection. Acute and Prolonged treatment (starting 2 hours pre-TBI until 7 days, one dose/day) of Met inhibitor revealed significant behavioral improvement until treatment withdrawal. We concluded that long term pathological outcomes can be mitigated and regulated as early as 1 day post TBI by signal specific RTK treatment during therapeutically effective time window and microglia are drivers of most, if not all, critical immune specific events.

Spinal muscular atrophy (SMA) is a genetic pediatric condition that affects lower motoneurons leading to their degeneration and muscle weakness. It is caused by homozygous loss or mutations in the Survival Motor Neuron 1 (SMN1) gene; however, the pathomechanism leading to motoneuron degeneration is not fully resolved. Cultured embryonic SMA motoneurons display axon elongation and differentiation defects accompanied by collapsed growth cones with a disturbed actin cytoskeleton. Intriguingly, motoneurons cultured from mice deficient for the Tropomyosin-kinase receptor B (TrkB), exhibit similar pathological features. Thus, the question arises whether SMA motoneurons suffer from defective Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/TrkB signaling and whether there is a link to the disturbed actin cytoskeleton. In the recent years, modifier genes such as Plastin 3 (PLS3) were shown to beneficially interfere with SMA pathology. Nevertheless, the mechanism of how the actin-bundler PLS3 counteracts SMN deficiency is not well understood. In this study, we investigated TrkB localization and its activation in cultured SMA motoneurons and neuromuscular junctions (NMJs). While TrkB levels are only mildly affected locally in axon terminals, BDNF-mediated TrkB phosphorylation was massively disturbed. The activity-dependent TrkB translocation to the cell surface and its activation via BDNF were shown to be Pls3-dependent processes, that can be abolished by knockdown of Pls3. In contrast, PLS3 overexpression in SMA motoneurons rescued the defects on morphological and functional level. In particular, the relocation of TrkB to the cell surface after BDNF-induced internalization is disturbed in SMA, which is based on an actin-dependent TrkB translocation defect from intracellular stores. Lastly, AAV9-mediated PLS3 overexpression in vivo in neonatal SMA mice provided further evidence for the capacity of PLS3 to modulate actin dynamics necessary for accurate BDNF/TrkB signaling. In conclusion, we provide a novel role for PLS3 in mediating proper alignment of transmembrane proteins as prerequisite for their appropriate functioning. Hence, PLS3 is required for a key process indispensable for the development and function of motoneurons even beyond the context of SMA., Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine Erkrankung der unteren Motoneurone, die zu deren Degeneration und Muskelschwund führt. Ausgelöst wird sie durch Verlust oder Mutation des Survival Motor Neuron 1 Gens. Kultivierte embryonale Motoneurone von SMA Mäusen zeigen eine veränderte zelluläre Differenzierung, sowie kollabierte Wachstumskegel und ein gestörtes Aktin Zytoskelett. Interessanterweise zeigen Motoneurone mit einem Verlust des Tropomyosinrezeptorkinase B (TrkB) die gleichen zellulären Dysregulationen. Daher stellte sich die Frage, ob SMA Motoneurone eine Störung der Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)/TrkB Signalkaskade entwickeln, die auf einem gestörten Aktin Zytoskelett beruht. Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass modifizierende Gene wie Plastin 3 (PLS3) eine schützende Wirkung auf die SMA Pathophysiologie haben. Allerdings ist der genaue Mechanismus, inwieweit PLS3 F-Aktin-gesteuerte Prozesse reguliert nicht gut verstanden. In dieser Studie haben wir die Lokalisierung und Aktivierbarkeit von TrkB in Motoneuronen und Endplatten von SMA Mäusen untersucht. Obwohl die Lokalisierung von TrkB nur wenig verändert ist, war die Aktivierung von TrkB via BDNF in den Axonterminalen stark beeinträchtigt. Außerdem stellten sich die aktivitätsabhängige TrkB Translokation zur Plasmamembran, als auch dessen BNDF-induzierte Phosphorylierung als Pls3-abhängige Prozesse heraus, die durch Pls3 Knockdown inhibiert werden konnten. Im Gegensatz dazu, bewirkt die PLS3 Überexpression in SMA Motoneuronen eine Wiederherstellung der morphologischen und funktionellen Defekte. Vor allem die gestörte Re-Lokalisierung von TrkB an die Zellmembran nach BDNF-Stimulation, welches auf einer defekten Translokation aus intrazellulären Speichern basiert, konnte durch PLS3 Überexpression verbessert wird. Des Weiteren brachte die Viren-basierte PLS3 Überexpression in SMA Mäusen weitere Beweise für die Fähigkeit von PLS3, die Aktin Dynamik zu regulieren. Zusammenfassend zeigen die Daten eine neue Rolle von PLS3 für die korrekte Anordnung von Transmembranproteinen, als Grundvoraussetzung für deren Funktionalität. Somit wird PLS3 für Schlüsselprozesse benötigt, die für die Entwicklung und Funktion von Motoneuronen, auch über den Kontext von SMA hinaus, unverzichtbar sind.

Das Neurotrophin BDNF beeinflusst über die Aktivierung des TrkB-Rezeptors viele zelluläre Prozesse von neuronalen Zellen. Aufgrund des schlechten pharmakologischen Profils von BDNF und dessen Unfähigkeit die Bluthirnschranke zu passieren, wurden in dieser Arbeit alternative Aktivierungsmechanismen des TrkB-Rezeptors in einer TrkB-überexprimierenden PC12 Zelllinie untersucht und deren Einfluss auf das zelluläre Verhalten analysiert. Dabei konnte nicht nur gezeigt werden, dass die Liganden-Alternative 7,8-DHF, ebenso wie BDNF, das Überleben sowie das Neuritenwachstum fördert, sondern womöglich auch TrkB-unabhängige Wirkungsmechanismen aufweist. Die Transaktivierung des TrkB-Rezeptors über den Adenosin A2A-Rezeptor reduziert das Überleben, wirkt sich jedoch positiv auf die Proliferation und das frühe Neuritenwachstum aus. Im Vergleich dazu fördert eine Stimulation mit EGF, vermutlich über TrkB-unabhängige Mechanismen, neben der Proliferation das Neuritenwachstum nach 5 Tagen am stärksten.

Lungenkrebs ist die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit.[1] In den letzten Jahren hat jedoch die sogenannte Präzisionsmedizin die Krebstherapie von Nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Patienten (NSCLC-Patienten) revolutioniert. Die Identifizierung von prädikativen Biomarkern sowie das detaillierte genetische Verständnis ermöglichte die Entwicklung niedermolekularer Verbindungen zur gezielten Inhibierung der aberranten Zielstrukturen genetisch definierter Patientengruppen. Durch die gezielte Adressierung der onkogenen Zielproteine können die Nebenwirkungen verringert werden, wodurch die Präzisionsmedizin eine vielversprechende Alternative zur platinbasierten Chemotherapie darstellt.[2,3] Genetische Mutationen, die zur Entstehung und zur Progression von NSCLC führen, sind häufig in den Rezeptor-Tyrosinkinasen zu finden. Hierbei sind im Rahmen dieser Arbeit vor allem der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) sowie der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Her2) zu nennen.[4,5] Die Entstehung von Resistenzmutationen innerhalb der Kinase-Domäne von EGFR, während der Behandlung mit zielgerichteten Tyrosinkinase-Inhibitoren, erfordert das stetige Aufklären der Resistenzmechanismen sowie die Entwicklung neuer Wirkstoffe.[6] Daher ist ein detailliertes Verständnis der Mutanten sowie der Protein-Inhibitor-Interaktionen auf molekularer Ebene für die Entwicklung neuartiger Verbindungen erforderlich. Die Proteinkristallographie stellt eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung dar. [7,8] Allerdings sind bis zur finalen Kristallstruktur viele Herausforderungen wie das Konstruktdesign, die Proteinexpression in unterschiedlichen Expressionssystemen sowie die Proteinreinigung und die Identifizierung geeigneter Kristallisation-bedingungen zu meistern. Nach Optimierung der genannten Arbeitsschritte konnten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Kristallisationssysteme Krebs-relevanter EGFR-Varianten etabliert werden, mit deren Hilfe ein verlässliches Wachstum qualitativ hochwertiger Proteinkristalle in Komplex mit niedermolekularen Verbindungen für die Strukturaufklärung ermöglicht werden konnte. Neben dem Interaktionsnetzwerk der Verbindungen und es Zielproteins konnten wichtige strukturelle Einblicke für weitere strukturbasierte Designansätze neuartiger Inhibitoren sowie Optimierungen bereits vorliegende Inhibitoren identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten insgesamt 47 finale Kristallstrukturen der EGFR-Mutationsvarianten generiert werden, von denen bisher zwölf in der Protein Data Bank publiziert wurden. [1] F. Bray, J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. L. Siegel, L. A. Torre, A. Jemal. Global Cancer Statistics 2018: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. Ca: Cancer J. Clin. 2018, 68, 394-424. [2] A. Thomas, S. V. Liu, D. S. Subramaniam, G. Giaccone. Refining the Treatment of NSCLC According to Histological and Molecular Subtypes. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2015, 12, 511-526. [3] S. O. Dolly, D. C. Collins, R. Sundar, S. Popat, T. A. Yap. Advances in the Development of Molecularly Targeted Agents in Non-Small-Cell Lung Cancer. Drugs 2017, 77, 813-827. [4] S. V. Sharma, D. W. Bell, J. Settleman, D. A. Haber. Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer. Nat. Rev. Cancer 2007, 7, 169-181. [5] J. Mendelsohn, J. Baselga. The EGF Receptor Family as Targets for Cancer Therapy. Oncogene 2000, 19, 6550-6565. [6] J. Lategahn, M. Keul, D. Rauh. Lessons To Be Learned: The Molecular Basis of Kinase-Targeted Therapies and Drug Resistance in Non-Small Cell Lung Cancer. Angew. Chem., Int. Ed. 2018, 57, 2307-2313. [7] M. W. Parker. Protein Structure from X-Ray Diffraction. J. Biol. Phys. 2003, 29, 341-362. [8] Z. Sayers, B. Avsar, E. Cholak, I. Karmous. Application of Advanced X-Ray Methods in Life Sciences. Biochim. Biophys. Acta. Gen. Subj. 2017, 1861, 3671-3685.

Multiple myeloma (MM) is a disease of terminally differentiated B-cells which accumulate in the bone marrow leading to bone lesions, hematopoietic insufficiency and hypercalcemia. Genetically, MM is characterized by a great heterogeneity. A recent next-generation sequencing approach resulted in the identification of a signaling network with an accumulation of mutations in receptor-tyrosine kinases (RTKs), adhesion molecules and downstream effectors. A deep-sequencing amplicon approach of the coding DNA sequence of the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 was conducted in a patient cohort (75 MM samples and 68 corresponding normal samples) of the “Deutsche Studiengruppe Multiples Myelom (DSMM)” to further elucidate the role of RTKs in MM. As an initial approach the detected mutations were correlated with cytogenetic abnormalities and clinical data in the course of this thesis. RTK mutations were present in 13% of MM patients of the DSMM XI trial and accumulated in the ligand-binding and tyrosine-kinase domain. The newly identified mutations were associated with an adverse patient survival, but not with any cytogenetic abnormality common in MM. Especially rare patient-specific SNPs (single nucleotide polymorphism) had a negative impact on patient survival. For a more comprehensive understanding of the role of rare RTK SNPs in MM, a second amplicon sequencing approach was performed in a patient cohort of the DSMM XII trial that included 75 tumor and 184 normal samples. This approach identified a total of 23 different mutations in the six RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 and NTRK2 affecting 24 patients. These mutations could furthermore be divided into 20 rare SNPs and 3 SNVs (single nucleotide variant). In contrast to the first study, the rare SNPs were significantly associated with the adverse prognostic factor del17p. IGF1R was among the most commonly mutated RTKs in the first amplicon sequencing approach and is known to play an important role in diverse cellular processes such as cell proliferation and survival. To study the role of IGF1R mutations in the hard-to-transfect MM cells, stable IGF1R-knockdown MM cell lines were established. One of the knockdown cell lines (L363-C/C9) as well as a IGF1R-WT MM cell line (AMO1) were subsequently used for the stable overexpression of WT IGF1R and mutant IGF1R (N1129S, D1146N). Overall, an impact on the MAPK and PI3K/AKT signaling pathways was observed upon the IGF1R knockdown as well as upon WT and mutant IGF1R overexpression. The resulting signaling pattern, however, differed between different MM cell lines used in this thesis as well as in a parallel performed master thesis which further demonstrates the great heterogeneity described in MM. Taken together, the conducted sequencing and functional studies illustrate the importance of RTKs and especially of IGF1R and its mutants in the pathogenesis of MM. Moreover, the results support the potential role of IGF1R as a therapeutic target for a subset of MM patients with mutated IGF1R and/or IGF1R overexpression., Das Multiple Myelom (MM) ist eine maligne Erkrankung ausdifferenzierter B-Zellen, den sogenannten Plasmazellen, welche sich im Knochenmark anhäufen. Symptome des MM sind, unter anderem, Knochenläsionen, Hyperkalzämie und hämatopoetische Insuffizienz. Zusätzlich ist das MM durch eine große genetische Heterogenität geprägt. In einer kürzlich durchgeführten Next-Generation Sequencing Studie wurde eine Akkumulation von Mutationen in Rezeptortyrosinkinasen (RTK), Adhesionmolekülen und den zugehörigen Effektoren identifiziert. Dies erlaubte die Definition eines inter- und intrazellulären Signalnetzwerkes. Um die Rolle der RTKs im MM genauer zu definieren, wurde die kodierende DNA Sequenz der sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in einer einheitlich therapierten Patientenkohorte (75 Patienten) der „Deutschen Studiengruppe Multiples Myelom“ (DSMM) mittels eines Amplikonansatzes sequenziert. Die identifizierten Mutationen wurden im Rahmen dieser Arbeit validiert und anschließend mit zytogenetischen Anomalitäten und klinischen Daten korreliert. RTK Mutationen waren in 13 % der MM Patienten vorhanden und akkumulierten besonders in den Ligandenbindungs- und der Tyrosinkinase- Domänen. Die neu identifizierten RTK Mutationen hatten einen signifikant negativen Einfluss auf das Überleben, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen den Mutationen und zytogenetischen Alterationen festgestellt werden. Besonders seltene, Patienten-spezifische SNPs hatten einen negativen Einfluss auf die Gesamtüberlebenszeit, das ereignisfreie und das progressionsfreie Überleben. Um die Rolle dieser seltenen SNPs im MM besser zu verstehen, wurde ein zweiter Amplikonansatz in einer neuen Patientenkohorte der DSMM XII Studie durchgeführt. Hierbei wurden die sechs RTKs EPHA2, EGFR, ERBB3, IGF1R, NTRK1 und NTRK2 in 75 Tumor und 184 Normalproben sequenziert. Bei diesem Ansatz wurden 23 unterschiedliche Mutationen in 24 Patienten identifiziert. Diese Mutation konnten in 20 seltene SNPs und 3 SNVs (single nuleotide variant) unterteilt werden und waren, im Gegensatz zu Mutationen der ersten Studie, signifikant mit dem negativ prognostischen Faktor del17p assoziiert. IGF1R war bei der initialen Amplikon-Sequenzierstudie unter den am häufigsten mutierten RTKs und spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, z. B. der Zellproliferation und dem Überleben. Um eine funktionelle Untersuchung der IGF1R Mutation in den schwer-zu-transfizierenden MM-Zellen zu ermöglichen, wurden stabile IGF1R-knockdown MM-Zelllinien etabliert. Eine dieser knockdown Zelllinien (L363-C/C9) sowie eine IGF1R WT MM-Zelllinie (AMO1) wurden anschließend für die stabile Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S verwendet. Funktionelle Analysen zeigten, dass sowohl IGF1R-knockdown als auch die Überexpression von IGF1R WT, IGF1R D1146N und IGF1R N1129S einen Einfluss auf den MAPK und den PI3K/AKT Signalweg haben. Der Einfluss des IGF1R WT, als auch der zwei Mutanten IGF1R D1146N und IGF1R N1129S unterschied sich jedoch in den in dieser Arbeit und in einer parallel durchgeführten Masterarbeit verwendeten Zelllinien. Diese Unterschiede verdeutlichen zusätzlich die große Heterogenität für die das MM bekannt ist. Zusammengenommen verdeutlichen die durchgeführten Sequenzier- und funktionellen Studien die wichtige Rolle der RTKs, besonders von IGF1R, im MM. Darüber hinaus unterstützen die erhaltenen Ergebnisse die potenzielle Rolle von IGF1R als therapeutisches Ziel für MM-Patienten mit mutiertem IGF1R und / oder IGF1R-Überexpression.

Traumatic brain injury (TBI) is a worldwide public health problem typically caused by contact and inertial forces acting on the brain with a broad spectrum of symptoms and disabilities. The molecular mechanism underlying the primary and secondary injuries after trauma have not been well investigated. Excess excitation has been hypothesized to be a significant part of the damage after traumatic brain injury. On the other hand, reduced neuronal excitability and a disturbed excitation/inhibition balance have also been detected post TBI. Clinical data show that ethanol intoxication is a potential modifier of TBI outcome. Here, we aimed at understanding the impact of ethanol intoxication on TBI-associated neurological deficits, signaling pathways and pathogenic cascades unfolding after TBI to identify new modifiers of TBI pathophysiology. We also Pharmacologically Selective Activation Module (PSAM) and Pharmacologically Selective Effector Module (PSEM) control of PV-Cre+ neurons and the Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drug (DREADD) control of principal neurons in a blunt model of TBI to explore the role of inhibition in shaping neuronal vulnerability to TBI. We also elucidated that the protective effect of PV inactivation was suppressed during the expression of the nuclear calcium buffer, PV nuclear localization sequence (PV-NLS), thus implying an activity-dependent neuroprotection. Thus, we give an insight into the neuroinflammatory and IEG pathways unfolding after TBI. We identify, for the first time, phosphorylation of ErbB2/ErbB3 in the excitatory synapses of the injured cortex and that ErbB2 inhibitors were able to recapitulate, to a significant effect, the neuroprotective effect of trauma. Finally, we were able to show that sustaining neuronal excitation in the early phase of TBI is neuroprotective by increasing activity dependent survival.

Tyrosinkinasen (TK) sind Schlüsselregulatoren der zellulären Signaltransduktion und beeinflussen Zellzyklus, Zellüberleben, Apoptose, Proliferation und Differenzierung. Die Dysregulation der TK-Aktivität trägt zur Entwicklung von Leukämie und anderen malignen Erkrankungen bei. So sind 25% der akuten lymphatischen Leukämien bei Erwachsenen (ALL) durch die BCR-ABL1-Translokation bedingt. Trotz intensiver Therapie beträgt das 5-Jahres-Überleben von erwachsenen Patienten mit ALL nur etwa 50 %. Als Alternative zu herkömmlichen Chemotherapeutika bietet der Einsatz von spezifisch wirkenden TK-Inhibitoren einen individualisierten Therapieansatz mit idealerweise weniger Nebenwirkungen und einem dadurch verbesserten Outcome. Um mögliche neue therapeutische Ziele zu identifizieren, wurde eine systematische Untersuchung der Expressionsveränderungen des gesamten Tyrosinkinoms durchgeführt. Eine Vielzahl verschiedener Tyrosinkinasen zeigte starke Veränderungen im Expressionsprofil von ALL-Zellen. Ein Teil dieser Expressionsänderungen kam durch das veränderten Methylierungsprofil der ALL-Zellen zustande. EPHA7 und PTK2 sind potentielle Marker für B-Linien ALL und NTRK3, ERBB4 und ZAP70 für T-Linien ALL. Die interindividuell variierende Expression der Tyrosinkinasen EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 und PDGFRB könnte eine genauere Risikoeinstufung ermöglichen. Insbesondere sind die Tyrosinkinasen ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC und TYK2 vielversprechende therapeutische Ziele, die im hämatopoetischen System die Proliferation fördern und / oder die Apoptose hemmen. Eine proliferationsfördernde Wirkung von überexprimiertem FLT4 konnte erstmals gezeigt werden. Die Vielfalt der Veränderungen in der Tyrosinkinase-Expression scheint eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von ALL zu spielen und TK könnte vielversprechende neue therapeutische Ziele sein. Tyrosine kinases (TK) are key regulators of cellular signal transduction and affect cell cycle, cell survival, apoptosis, proliferation and differentiation. Dysregulation of TK activity contributes to the development of leukemia and other malignancies. So are 25 % of adult acute lymphoblastic leukemias (ALL) driven by the BCR-ABL1 translocation. Despite intensive therapy, the 5-year overall survival of adult patients with ALL is about 50 %. In contrast to conventional chemotherapeutic agents, the use of specific-acting TK-inhibitors offers an individualized therapeutic approach with less side-effects and a better outcome. To identify possible new therapeutic targets, a systematic survey of expression changes of the entire tyrosine kinome was carried out. A variety of different tyrosine kinases showed great changes in the expression profile of ALL-cells. Part of these expression changes can be attributed to a changed methylation profile in adult ALL. EPHA7 and PTK2 are potential markers for B-line ALL and the NTRK3, ERBB4 and ZAP70 for T-lines ALL. The interindividual varying expression of the tyrosine kinases EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 and PDGFRB presumably allows a more precise risk classification. In particular, the tyrosine kinases ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC and TYK2 are promising therapeutic targets, which promotes proliferation and/or inhibits apoptosis in the hematopoietic system. A proliferation promoting effect of overexpressed FLT4 could be shown for the first time. The variety of changes in the tyrosine kinase expression seems to play an important role in the development of ALL and TK could be promising new therapeutic targets.

Die akute myeloische Leukämie ist trotz Fortschritten in der Therapie weiterhin eine Erkrankung mit geringer Heilungschance und hoher Rezidivrate nach Therapie. Bei der Suche nach zielgerichteten Therapien haben wir mittels RNA interference (RNAi) Screens die Rezeptortyrosinkinase (RTK) RET (Rearranged during Transfection) als potentielle Zielstruktur identifiziert. Gegenstand meiner Arbeit war es näher zu untersuchen, ob und inwiefern RET in der akuten myeloischen Leukämie (AML)- Pathogenese von Bedeutung ist, und aufgrund der geringen Heilungsrate auch nach eventuellen Therapiestrategien zu suchen. In meiner Arbeit befasste ich mich zunächst damit, ob Leukämiezellen RET exprimieren. Ich konnte zeigen, dass insbesondere myelomonozytär differenzierte AML-Zelllinien des FAB (French-American-British)- Subtyps M5 ein hohes RET9- und RET51-Expressionslevel besitzen. Dies stimmt auch mit der vorhandenen Literatur überein. Im Gegensatz hierzu fand ich in gesunden Mono- und Granulozyten nur RET9- und keine RET51-Expression. Dies legt eine mögliche spezifische Rolle von RET51 in der Pathogenese der AML nahe. Weitere Untersuchungen mit der Frage nach der funktionellen Bedeutung der beiden Isoformen sollten sich anschliessen. Um eine Signalkaskade zu starten, muss RET über einen Liganden aktiviert werden, und in der Folge kommt es zu einer Phosphorylierung verschiedener Tyrosinreste von RET. Diese Phosphorylierung und somit die Aktivität von RET wollte ich in AML-Zelllinien nachweisen. In MOLM-14, einer AML-Zelllinie, konnte ich eine allgemeine Phosphorylierung von RET zeigen und durch RPI-1, einen Inhibitor von RET, in der Folge eine Dephosphorylierung von RET erzielen. Übertragen konnte ich damit die Aktivität von RET in dieser Zelllinie beweisen. Bei dem Blick auf den spezifischen Tyrosinrest 905 waren wir mit der Detektion nicht erfolgreich. Hier würde sich der Tyrosinrest 1062 als nächster Punkt empfehlen. Nach der Aktivität von RET war es weiter wichtig zu untersuchen, ob AML-Zellen von der RET-Expression abhängig sind. Ich konnte mittels RNAi beweisen, dass alle Zellen mit positivem RET durch die Suppression von RET nicht mehr weiter wachsen, was eine Abhängigkeit der Zellen von RET erkennen lässt. Auch mit RPI-1 liess sich die Abhängigkeit bestätigen. Am empfindlichsten reagierten die Zelllinien mit weiteren RTK-Mutationen, weniger empfindlich diejenigen mit einer RAS (Rat sarcoma virus oncogen)- Mutation. Somit scheinen auch die weiteren Mutationen einer Zelllinie eine Rolle im Bezug auf das Wachstum von AML-Zelllinien zu spielen. Wichtig wäre nun zu wissen, ob die Zellen durch die Suppression von RET in Apoptose gehen oder ob eine verminderte Proliferation der Zellen resultiert. Wie sich die Signalwege von RET verhalten, war ebenfalls Gegenstand meiner Untersuchungen. Bei den Experimenten zum Signaling von RET konnten wir zwei Wege herausarbeiten, die eine übergeordnete Rolle zu spielen scheinen. In allen von uns untersuchten Zelllinien wurde durch die Blockierung von RET PKC (Protein kinase C) alpha hochreguliert. Die Hochregulierung von PKCalpha ist eventuell somit ein kompensatorischer Versuch der Zelle, sich aufrecht zu erhalten. Bei FLT3 (Fms-related tyrosine kinase 3)- mutierten Zelllinien, einer anderen Rezeptortyrosinkinase, führte die Blockierung von RET scheinbar zu einer Aktivitätsverminderung von STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5). Eine Ableitung hiervon kann sein, dass STAT5, wie bisher noch nicht bekannt, als direkter Effektor des Signalings von RET vorkommt, oder dass RET und FLT3 vielleicht auch direkt miteinander interagieren und STAT5 so beeinflussen. Für AKT (V-akt murine thymoma viral oncogene homolog), ERK (Elk-related tyrosine kinase) und STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) konnte aus unseren Daten keine zentrale Aussage abgeleitet werden. Den möglichen Cross-Talk von RET und FLT3 wollten wir noch weiter beleuchten. Unsere Experimente hierzu zeigten, dass durch die Kombination von RPI-1 und PKC412, einem FLT3-Inhibitor, eine additive bzw. synergistische Wirkung auf RET-positive, FLT3-mutierte Zelllinien erzielt werden konnte. Bei einem weiteren Versuch mit einer Kombination aus RET-knockdown (KD) und PKC412 konnten wir ebenfalls die beste Proliferationshemmung im Vergleich zu den einzelnen Behandlungen erzielen. Dies könnte spezifisch für Patienten mit einer FLT3-Mutation einen therapeutischen Vorteil bringen. Die Phosphorylierung von FLT3 konnte durch einen KD von RET nicht beeinflusst werden. Jedoch zeigte sich bei der spezifischen Phosphorylierungsstelle Tyr842, die im Aktivierungsloop von FLT3 liegt, eine verminderte Phosphorylierung. Dies erweckt ebenfalls den starken Verdacht, dass RET und FLT3 interagieren. Tyr591 war in meinen Untersuchungen nicht detektierbar. Weitere Phosphorylierungsstellen könnten Gegenstand weiterer Experimente sein.

Childhood radiation exposure has been associated with increased papillary thyroid carcinoma (PTC) risk. The role of anaplastic lymphoma kinase (ALK) gene rearrangements in radiation-related PTC remains unclear, but STRN-ALK fusions have recently been detected in PTCs from radiation exposed persons after Chernobyl using targeted next-generation sequencing and RNA-seq. We investigated ALK and RET gene rearrangements as well as known driver point mutations in PTC tumours from 77 radiation-exposed patients (mean age at surgery 22.4 years) and PTC tumours from 19 non-exposed individuals after the Chernobyl accident. ALK rearrangements were detected by fluorescence in situ hybridisation (FISH) and confirmed with immunohistochemistry (IHC); point mutations in the BRAF and RAS genes were detected by DNA pyrosequencing. Among the 77 tumours from exposed persons, we identified 7 ALK rearrangements and none in the unexposed group. When combining ALK and RET rearrangements, we found 24 in the exposed (31.2%) compared to two (10.5%) in the unexposed group. Odds ratios increased significantly in a dose-dependent manner up to 6.2 (95%CI: 1.1, 34.7; p = 0.039) at Iodine-131 thyroid doses >500 mGy. In total, 27 cases carried point mutations of BRAF or RAS genes, yet logistic regression analysis failed to identify significant dose association. To our knowledge we are the first to describe ALK rearrangements in post-Chernobyl PTC samples using routine methods such as FISH and IHC. Our findings further support the hypothesis that gene rearrangements, but not oncogenic driver mutations, are associated with ionising radiation-related tumour risk. IHC may represent an effective method for ALK-screening in PTCs with known radiation aetiology, which is of clinical value since oncogenic ALK activation might represent a valuable target for small molecule inhibitors., publishedVersion

eingereicht von: Peter Lanzerstorfer Zsfassung in dt. Sprache Linz, Univ., Diss., 2015 OeBB

Neurotrophine sind essentielle Regulatoren des Nervensystems, die ihre Funktionen mittels p75\(^{NTR}\) und Trk-Rezeptoren vermitteln. Da Neurotrophine wegen ihres schlechten pharmakologischen Profils für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen ungeeignet sind, wurden in der vorliegenden Arbeit alternative Aktivierungsmöglichkeiten des TrkB-Rezeptors analysiert. Zum einen der Einfluss von 7,8-DHF auf embryonale Motoneurone der Maus, wobei sich zeigte, dass 7,8-DHF deren Überleben und Wachstum fördert und selektiv den AKT-Signalweg aktiviert. Ebenso wurde der TrkB-Transaktivierungsprozess in Motoneuronen untersucht. Dabei zeigte sich, dass dieser zeitverzögert an internen Membranen erfolgt, das Motoneuronenwachstum fördert und den AKT- und MAPK-Signalweg aktiviert. Ebenso wurden Interaktionspartner innerhalb des überlebensfördernden, mitochondrialen Komplexes aus Craf/Hsp70/Bag-1/AKT identifiziert und eine Korrelation zwischen Komplexaufbau und Trk-Rezeptoraktivierung ermittelt.

(deutsch) Zellen reagieren auf Umweltreize mittels verschiedener Zelloberflächen- Rezeptoren. Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) sind eine große Familie von Membrane-Rezeptoren, die durch Wachstumsfaktoren und Hormonen aktiviert werden. RTKs haben eine wichtige Rolle sowohl in der normalen als auch der abweichenden Entwicklung und Physiologie (SR Hubbard, 2007). Wir entwickelten modifizierte RTKs, die durch Licht aktiviert werden können und (optically-activated RTKs, Opto-RTKs). Die optische Kontrolle von RTKs wurde durch die Anfügungen einer Licht-aktivierbaren Proteindomäne eines phototropen Organismus an Säugetier-RTKs erzielt. Die generierten Konstrukte wurden in vitro in HEK293 untersucht und eine der entwickelten Opto-RTKs wurde weiter in vivo in C. elegans untersucht. Die Ergebnisse der in vitro Studie zeigen, dass Opto-RTKs durch Licht aktiviert werden und verschiedene RTK-abhängige Signalwege aktivieren. Darüber hinaus zeigen die Resultate der in vivo Studie, dass Opto-RTK auch in C. elegans durch Licht aktiviert wird. Die Aktivierung der Opto-RTK im Nematode führte zur Ausprägung eines deutlichen Phänotyps. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass Opto-RTKs durch Licht in vitro als auch im in vivo Modell aktiviert werden. Nicht invasive optische Kontrolle von RTKs hat das Potenzial, Einschränkungen durch aktuelle Techniken zu überwinden und dadurch neue Wege für das Verständnis von RTKs im Bezug auf physiologische und pathophysiologische Prozesse zu eröffnen. Abstract Cells respond to environmental stimuli through multifarious cell surface receptors. Receptor tyrosine kinases (RTKs) are a large receptor family that senses growth factors and hormones and is critically involved in normal and aberrant development and physiology (Hubbard SR 2007). We developed engineered RTKs that are activated by light (optically-activated RTKs, Opto-RTKs). Light control of RTKs was achieved by genetically supplementing RTKs with light sensing protein domains from phototropic organisms. The genetic constructs were investigated in vitro in HEK293 cells and one construct was further investigated in vivo in Caenorhabditis elegans (C. elegans). The results of the in vitro studies demonstrate that Opto-RTKs can be activated by light and induce various RTK-related downstream pathways upon stimulation. Additionally, the results of the C. elegans study show that Opto-RTK can be activated by light also in vivo with a manifestation of a distinct phenotype. In summary, the results show that RTK signaling can be “remote controlled” by light in vitro as well as in an in vivo model and that activation triggers signaling pathways associated with survival and growth. Non-invasive optical control of RTK signaling has the potential to overcome limitations imposed by current techniques and to thereby open new avenues in the understanding of these receptors in physiology and pathophysiology. Vorgelegt von: Eva Reichhart Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Molecular Biotechnology Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2013

Neurotrophine sind essentielle Regulatoren des Nervensystems, die ihre Funktionen mittels p75NTR und Trk-Rezeptoren vermitteln. Da Neurotrophine wegen ihres schlechten pharmakologischen Profils für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen ungeeignet sind, wurden in der vorliegenden Arbeit alternative Aktivierungsmöglichkeiten des TrkB- Rezeptors analysiert. Zum einen der Einfluss von 7,8-DHF auf embryonale Motoneurone der Maus, wobei sich zeigte, dass 7,8-DHF deren Überleben und Wachstum fördert und selektiv den AKT-Signalweg aktiviert. Ebenso wurde der TrkB- Transaktivierungsprozess in Motoneuronen untersucht. Dabei zeigte sich, dass dieser zeitverzögert an internen Membranen erfolgt, das Motoneuronenwachstum fördert und den AKT- und MAPK-Signalweg aktiviert. Ebenso wurden Interaktionspartner innerhalb des überlebensfördernden, mitochondrialen Komplexes aus Craf/Hsp70/Bag-1/AKT identifiziert und eine Korrelation zwischen Komplexaufbau und Trk-Rezeptoraktivierung ermittelt.

Fibroblast growth factors (FGFs) are important regulators of cell proliferation and differentiation. In neoplastic growth, they act as powerful mitogens inducing cell migration and invasion. Since some cancer-relevant FGFs are tightly bound to the extracellular matrix (ECM), their release is one of the critical steps in FGF bioactivation. The FGF-binding protein (FGF-BP) is a secreted, heparin-binding protein that interacts with certain FGFs, releasing them from their extracellular storage. Hence, FGF-BP plays a significant role in FGF bioactivation. It has been shown to interact non-covalently with FGF1, FGF2, FGF7, FGF10 and FGF22. FGF-BP is upregulated in several tumors and it is associated in particular with early stages of tumor formation, where angiogenesis plays a critical role. In a nude-mouse model FGF-BP is a rate-limiting factor in tumor growth. In this thesis, various knockdown strategies were explored to examine the contribution of FGF-BP to proliferation and apoptosis. By means of vector-based RNAi, isogenic colon carcinoma cell lines with permanently reduced FGF-BP levels were generated. It was shown that depletion of endogenous FGF-BP exerts anti-proliferative as well as pro-apoptotic effects in tumor cells. By selection of several clones with a robust gene knockdown, a dose-dependence of cell proliferation and apoptosis on the FGF-BP expression was established. To address the underlying cellular and molecular mechanisms in more detail, a variety of methods including flow cytometry, protease assays and Western blotting were emplyed. Compared to the parental cells the knockdown-phenotype exhibited distinct changes in cellular survival-, MAPK- and apoptosis signalling. FGF-BP downregulation induced increased levels of BH3-only domain proteins Bad and Bax, leading to enhanced Caspase 3/7 activity. In parallel, suppression of Akt kinases, activation of SAPK/ JNK and increased levels of GSK3β were detected. Alterations in the cell cycle distribution upon knockdown of FGF-BP with a marked increase of cells in the G0/G1-Phase could be demonstrated by FACS analysis. Additionally, upregulation of p21WAF1/CIP1 protein and cell cycle prolongation were observed. Furthermore, these loss-of-function mutants showed alterations in O2 consumption and in the redox status. Antibody arrays revealed increased levels of HIF1α and downregulation of catalase, indicating an impaired protection of cancer cells against oxidative stress upon depletion of FGF-BP. In a cervical cancer model it could be demonstrated that ribozyme-mediated reduction of FGF-BP led to altered sensitivities towards certain anticancer drugs. Synergistic effects of FGF-BP knockdown and chemotherapy were observed in the case of the topoisomerase I inhibitor irinotecan but not for microtubule-interfering agents emphasizing the cell cyle phase dependency of FGF-BP action. Beyond these in vitro experiments, an RNAi-based treatment study for therapeutic inhibition of FGF-BP in vivo was performed. Through polyethylenimine-based polymeric nanoparticles, siRNA-delivery was achieved that resulted in a specific FGF-BP knockdown and tumor-inhibiting effects in an s.c. colon carcinoma model. In order to screen for novel binding partners of FGF-BP, full-length FGF-BP as well as various mutant FGF-BP deletion constructs were cloned and recombinantly expressed. Protein-protein interaction studies revealed new ligands for FGF-BP within the FGF family (FGF4, FGF8). Moreover, the DNA-associated high-mobility group A (HMGA) protein was identified as a new binding partner for FGF-BP. In vitro stabilization assays revealed the affinity of FGF-BP to nucleic acids. In the presence of genomic DNA enhanced protein stability was observed. Taken together, these data support the hypothesis of a recently discovered and so far unexplored intracellular mechanism of FGF-BP action. In conclusion, this thesis elucidates the role of FGF-BP in a complex network of cytoprotective and proliferative effects. It could be demonstrated that the selective depletion of FGF-BP increases the cellular rate of apoptosis and causes cell cycle prolongation, leading to reduced tumor growth. Moreover, the findings allow to better evaluate the efficacy of an antitumoral therapy based on the knockdown of FGF-BP expression. Thus, FGF-BP represents a promising therapeutic target in the treatment of cancer., Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGFs) spielen eine bedeutende Rolle bei der Zellproliferation und -differenzierung. Bei neoplastischem Wachstum fungieren FGFs als potente Mitogene. Einige der tumorrelevanten FGFs binden jedoch mit hoher Affinität an eine oder mehrere Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM) und die Freisetzung der FGFs aus der EZM stellt einen kritischen Schritt in der FGF-Bioaktivierung dar. Das FGF-bindende Protein FGF-BP ist ein sekretiertes Heparin-bindendes Protein, welches mit mehreren FGFs, wie FGF1, FGF2, FGF7, FGF10 sowie FGF22, spezifisch interagiert und diese aus ihrem extrazellulären Speicherort freisetzt. FGF-BP ist in verschiedenen Tumoren, insbesondere in der frühen Phase der Karzinogenese, hochreguliert. Die (Über-)expression von FGF-BP in Tumorzellen stellt einen limitierenden Faktor für die Etablierung solider Tumore dar. Im Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene Knockdown-Strategien exploriert um FGF-BP hinsichtlich seines Beitrags zu Proliferation und Apoptose sowie zum in vivo-Tumorwachstum zu untersuchen. Unter Verwendung von vektorbasierter RNAi wurden isogene Kolonkarzinom-Zelllinien mit permanent vermindertem FGF-BP-Level generiert. Es wurde gezeigt, dass die Reduktion der FGF-BP-Level sowohl antiproliferative Effekt als auch pro-apoptotische Effekte hervorruft. Die Herunterregulation von FGF-BP ging einher mit komplexen zellulären und molekularen Veränderungen, u.a. in der MAPK- und Apoptose-Signaltransduktion. Im Vergleich zu den parentalen Zellen wies der knockdown-Phänotyp erhöhte Spiegel an aktiviertem Bad und Bax auf, was zu einer gesteigerten Aktivität der Effektorcaspasen 3 und 7 führte. Gleichzeitig wurde in FGF-BP-herunterregulierten Zellen eine Suppression von Akt Kinasen, eine Aktivierung von SAPK/JNK und eine Induktion der GSK3β detektiert. Klone mit vermindertem FGF-BP-Gehalt akkumulierten vermehrt in der G0/G1-Phase des Zellzyklus und wiesen erhöhte Konzentrationen an aktiviertem p21WAF1/CIP auf. Darüber hinaus zeigten diese loss-of-function-Mutanten Alterationen im Redoxstatus auf, was sich in einer erniedrigten Katalasekonzentration sowie erhöhten Konzentrationen an HIF1α widerspiegelte. In einem Zervixkarzinom-Modell wurde mit Hilfe eines Ribozym-Targetings gezeigt, dass FGF-BP die Sensitivität gegenüber Chemotherapeutika beeinflusst. Synergistische Effekte eines Knockdowns und einer Antitumorbehandlung waren nachweisbar bei dem Topoisomerase I Inhibitor Irinotecan, nicht aber bei den Spindelgiften Docetaxel und Vinorelbin. In einem in vivo-Experiment gelang es, mit Hilfe einer auf Polyethylenimin (PEI) basierenden Applikation von therapeutischen Nukleinsäuren (FGF-BP-siRNAs) einen spezifischen FGF-BP-Knockdown sowie einen antitumoralen Effekt im Kolonkarzinom-Nacktmausmodell zu erzielen. Um neue Interaktionspartner für FGF-BP aufzufinden, wurden unterschiedliche full length- sowie Deletionsmutanten des Proteins kloniert und rekombinant exprimiert. Durch Protein-Protein-Interaktions-Analysen konnten weitere Liganden für FGF-BP innerhalb der FGF-Familie ermittelt werden (FGF4, FGF8). Darüber hinaus wurde das DNA-assoziierte High-Mobility Group A-Protein (HMGA) als neuer Bindepartner für FGF-BP identifiziert. Ferner zeigten in vitro-Untersuchungen eine Affinität von FGF-BP zu Nukleinsäuren. In Anwesenheit von genomischer DNA wies FGF-BP eine erhöhte Proteinstabilität auf. Diese Daten unterstützen die Hypothese eines erst kürzlich ermittelten und bislang noch nicht näher untersuchten intrazellulären Mechanismus von FGF-BP. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass FGF-BP BP bei proliferativen sowie zytoprotektiven Vorgängen in ein komplexes molekulares Netzwerk eingebunden ist. Die in dieser Arbeit ermittelten Daten demonstrieren, dass eine gezielte Verminderung der FGF-BP-Expression das Ausmaß der zellulären Apoptose erhöht, eine anti-proliferative Wirkung hervorruft und das Tumorwachstum in vivo vermindert. Die beschriebenen Untersuchungen zur Chemoresistenz erlauben eine Abschätzung der selektiven Sensitivität von Tumorzellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika in Abhängigkeit von der FGF-BP-Expression. Es kann somit gefolgert werden, dass FGF-BP ein vielversprechendes Zielmolekül (target) in der Antitumortherapie darstellt.

Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) des Erwachsenen lassen sich in ca. 30 % der Patienten sogenannte Interne Tandemduplikationen (ITD) im FLT3 Gen nachweisen, die klinisch mit einer schlechten Prognose assoziiert sind. Diese Mutationen führen zu einer Liganden-unabhängigen Aktivierung des Rezeptors und Aktivierung der nachgeschalteten Signalwege. Bislang ist man davon ausgegangen, dass diese ITD’s in der JM-Domäne von FLT3 lokalisieren. In dieser Arbeit sollten die FLT3-ITD’s hinsichtlich ihrer Insertionsstellen, ihrer Länge, ihrer Anzahl an unterschiedlichen ITD’s pro Patient sowie der klinischen Bedeutung in 241 erwachsenen FLT3-ITD mutierten AML-Patienten untersucht werden. Bei 34 Patienten wurde mehr als eine FLT3-ITD detektiert, sodass insgesamt 282 ITD’s identifiziert wurden. Die Insertionsstellen wurden den funktionellen Rezeptordomänen zugeordnet: juxtamembranären Domäne (JMD), n = 148; JMD "hinge region", n = 48; ß1-Faltblatt der Tyrosinkinasedomäne1 (TKD1), n = 73; übrige TKD1, n = 13. Die mediane ITD-Länge betrug 48 Basenpaare. Es zeigte sich eine signifikante Korrelation der Länge der Duplikation zu den funktionellen FLT3-Domänen, indem die kürzesten ITD’s in der JMD und die längsten in der TKD1 detektiert wurden (p < 0,001). Sowohl in der univariaten, als auch in der multivariaten Analyse erwies sich die ITD-Insertion innerhalb des ß1-Faltblatt der TKD1 im Hinblick auf das Erreichen einer kompletten Remission, das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberleben sowohl bei Patienten mit normalem Karyotyp als auch bei Patienten mit chromosomalen Aberrationen als prognostisch ungünstig. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit können FLT3-ITD mutierte AML-Patienten anhand ihrer Insertionsstelle innerhalb des ß1-Faltblatt der TKD1 in der klinisch heterogenen Gruppe der FLT3-ITD mutierten AML-Patienten als prognostisch besonders ungünstig identifiziert werden.

Das Schilddrüsenkarzinom ist die häufigste maligne Erkrankung der endokrinen Organsysteme. Für gut differenzierte Schilddrüsenkarzinome wie das papilläre oder follikuläre Karzinom existieren sehr gute Therapieoptionen, die ein 10-Jahresüberleben von bis zu 98% ermöglichen. Mit zunehmender Dedifferenzierung verschlechtern sich jedoch die Therapiemöglichkeiten, da die entsprechenden Tumorzellen ihre Fähigkeit zur Teilnahme am Jodstoffwechsel verlieren und somit einer Radiojodtherapie nicht mehr zugänglich sind. Als komplett entdifferenzierter Histiotyp steht am Ende das anaplastische Schilddrüsenkarzinom, welches zu den hoch aggressiven Tumoren zählt und mit nur schlechten Therapieoptionen und einer Überlebenszeit von wenigen Monaten nach Diagnosestellung einhergeht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirksamkeit zweier Tyrosinkinaseinhibitoren (ZD1839 und ZD6474) anhand verschiedener Histiotypen des Schilddrüsenkarzinoms in vitro evaluiert. Dabei wurde der Effekt auf die Zellproliferation, die VEGF-Sekretion sowie die Wirkung an membrangebundenen- und zytoplasmatischen Rezeptoren mit Tyrosinkinaseaktivität untersucht. Beide Substanzen wurden jeweils einzeln und in Kombination getestet. Gemessen an der Zellproliferation zeigten beide Substanzen einen starken antiproliferativen Effekt. Die Kombination beider Substanzen führte je nach Histiotyp sogar zu einer Verdoppelung der antiproliferativen Wirkung. In den Analysen zur VEGF-Sekretion konnten beide Substanzen die ligandeninduzierte VEGF-Sekretion um bis zu 100% reduzieren. Die Kombinationsversuche zeigten in diesen Versuchsreihen keine synergistischen Effekte. In den Western Blot-Analysen wurde nach Inkubation der Zellen mit ZD1839 bzw. ZD6474 eine Verminderung bzw. Hemmung der Aktivität der phosphorylierten membrangebundenen Rezeptoren (EGF-R und VEGF-R) beobachtet, wobei die nachgeschalteten zytoplasmatischen Rezeptoren je nach Histiotyp und Substanz aber ein geringeres Ansprechen aufwiesen. Des Weiteren ließ sich durch beide Substanzen eine dosisabhängige Downregulation des nicht-phosphorylierten EGF-Rezeptors erzielen. ZD6474 wird in der Literatur als dualer Tyrosinkinaseinhibitor beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie weisen jedoch auch für ZD1839 auf eine Wirksamkeit am EGF- und VEGF-Rezeptor sowie auf nachgeschaltete zytoplasmatische Rezeptortyrosinkinasen hin. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass die Kombination zweier Tyrosinkinaseinhibitoren einen stärkeren antitumoralen Effekt aufweist. Die hier gefundenen in vitro-Ergebnisse werden durch die in der eigenen Arbeitsgruppe durchgeführten in vivo-Untersuchungen gestützt. Diese bestätigen, dass die Kombination von ZD1839 und ZD6474 im Gegensatz zur Monotherapie die effektivere Therapieform darstellt. Die Wirksamkeit von Tyrosinkinaseinhibitoren wurde bereits an mehreren Tumorentitäten in klinischen Studien nachgewiesen. Die hier gefundenen Ergebnisse in Zusammenschau mit den bereits durchgeführten in vivo-Studien eröffnen eine mögliche Therapieoption beim fortgeschrittenen Schilddrüsenkarzinom., In vitro evaluation of tyrosine kinase inhibitors in thyroid cancer: The thyroid carcinoma is the most frequent malignant disease of the endocrinal organic system. The effectivness of tyrosine kinase inhibitors has already been proved in clinical studies in various tumour entities. The results shown in this study together with the results of already realized in vivo-studies establish a possible option for therapy of the advanced thyroid cancer.

Pleiotrophin (PTN) is a member of the protein family of secreted, heparin-binding, matrix-associated growth factors, and functionally resembles fibroblast growth factors. It plays a physiological role during ontogenesis and is relevant in different tumor types. The protooncogenic impact of PTN results mainly from the stimulation of proliferation and angiogenesis. The receptor anaplastic lymphoma kinase (ALK) was initially discovered in connection with the large cell anaplastic T-Cell lymphoma as constitutively active fusion protein resulting from chromosomal aberrations. In later studies, ALK was identified as a PTN-receptor. ALK is a typical tyrosine kinase from the insulin receptor family, and triggers the ligand-specific induction of several mitogene-activated cascades responsible for its oncogenic potential via further protein adapters. In this study, the influence of PTN and ALK on proliferation, colony-forming in soft agar, tumor growth, apoptosis and angiogenesis in glioblastoma, teratocarcinoma and coloncarcinoma cell lines was investigated. For this purpose, cell lines that were PTN- and ALK-positive in screening experiments were stably transfected with ribozyme-bearing vectors. The cells with reduced PTN or ALK expression displayed a decrease in contact-dependent and contact-independent proliferation, and formed smaller tumor nodes after subcutaneous injection in mice. The effects of the PTN knockdown could be reverted in vitro by applying recombinant PTN. For further investigation, truncated mutants of ALK were generated and overexpressed in tumor cell lines. These tyrosine kinase deficient ALK mutants had a negative impact on the proliferation of the tumor cells. The ribozyme mediated double targeting of PTN and ALK showed additive antitumoral effects both in cell culture studies and in in vivo models with glioblastoma and colon carcinoma cell lines. To develop novel therapeutic strategies based on these results, we used RNA interference (RNAi) instead of ribozyme targeting. Using the transfection reagent polyethyleneimine (PEI), which is suitable for the delivery of RNA, we succeeded in knocking down PTN by means of PEI/siRNA complexes in established U87MG glioblastoma tumor xenotransplants, with a subsequent considerable reduction of tumor growth. This treatment worked both very efficiently and specifically with intraperitoneal, as well as with subcutaneous injections. The systemic administration of PEI/siRNA complexes in order to knock down PTN and / or ALK thus represents a promising treatment method for different solid tumors., Pleiotrophin (PTN) gehört zur Proteinfamilie der sekretierten, heparin-bindenden, Matrix-assoziierten Wachstumsfaktoren und ähnelt funktionell den Fibroblasten-Wachstumsfaktoren. Es spielt eine physiologische Rolle während der Ontogenese und ist bei verschiedenen Tumortypen relevant. Die protoonkogene Wirkung von PTN beruht hauptsächlich auf der Stimulation der Proliferation und Angiogenese. Der Rezeptor Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) wurde zunächst im Zusammenhang mit dem großzelligen anaplastischen T-Zell-Lymphom als konstitutiv-aktives, durch chromosomale Aberrationen entstehendes Fusionsprotein entdeckt. In späteren Arbeiten wurde ALK als ein PTN-Rezeptor identifiziert. ALK stellt eine klassische Tyrosinkinase aus der Familie der Insulinrezeptoren dar und seine Liganden-vermittelte Transphosphorylierung führt über weitere Effektoren zur Induktion mehrerer mitogen-aktivierter Signaltransduktionskaskaden, die verantwortlich für sein onkogenes Potential sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von PTN und ALK auf Proliferation, Kolonienbildung im Weichagar, Tumorwachstum, Apoptose und Angiogenese in Glioblastom-, Hoden-CA- und Kolon-CA-Zelllinien untersucht. Zu diesem Zweck wurden im Screening ermittelte PTN- und ALK-positive Zelllinien mit Ribozym-kodierenden Vektoren stabil transfiziert. Die Zellen mit verminderter PTN- bzw. ALK-Expression zeigten eine Verlangsamung der kontaktabhängigen und kontaktunabhängigen Proliferation und bildeten nach s.c. Injektion im Mausmodell kleinere Tumoren. Durch Zugabe von rekombinantem PTN konnten in vitro die PTN-Knockdown-Effekte revertiert werden. Es wurden ferner ALK-Verkürzungsmutanten hergestellt und in den Tumorzelllinien überexprimiert. Diese Tyrosinkinase-Domäne-defizienten ALK-Mutanten wirkten sich negativ auf die Proliferationsgeschwindigkeit der Tumorzellen aus. Das Ribozym-vermittelte Doppeltargeting von PTN und ALK in Glioblastom- und Kolon-CA-Zelllinien zeigte sowohl in Zellkulturstudien als auch im in vivo-Modell additive antitumorigene Effekte. Zur Entwicklung von auf diesen Ergebnissen basierenden neuen Therapiestrategien wurde statt des Ribozym-Targetings die RNA-Interferenz (RNAi) eingesetzt. Durch die Verwendung des für in vivo-Einschleusung von RNA geeigneten Transfektionsreagenz Polyethylenimin (PEI) gelang es, in bereits ausgebildeten U87MG-Glioblastom-Tumorxenotransplantaten mittels PEI/siRNA-Komplexen einen PTN-Knockdown zu erzielen, was in einer deutlichen Abnahme des Tumorwachstums resultierte. Diese Behandlung erwies sich sowohl bei intraperitonealer wie auch bei subkutaner Injektion als effizient und spezifisch. Die systemische Gabe von PEI/siRNA-Komplexen zum Knockdown von PTN und / oder ALK stellt somit eine vielversprechende Methode der Behandlung verschiedener solider Tumoren dar.

Misregulated receptor tyrosine kinases (RTKs), i.e. the epidermal growth factor receptor EGFR or the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R), can be involved in the development of cancer. Monoclonal antibodies specifically inhibit the RTKs in cancer therapy. The scope of this thesis is to investigate the molecular basis of the inhibition through the therapeutic antibodies matuzumab (EMD72000) against EGFR and EMD1159476 against IGF-1R. The 3D crystal structure of matuzumab in complex with the EGFR domain III shows an eptiope connected with a novel inhibition mechanism: a non-competitive, sterical inhibition of receptor acitivation. The anti-IGF-1R targeted monoclonal antibody EMD1159476 shows a reduced binding capacity to the receptor in the presence of ligand indicating a competitive inhibition mechanism. The epitope of EMD1159476 is within domain II of the receptor. The results of these molecular interaction studies are important for the clinical therapies with these monoclonal antibodies. The matuzumab-EGFR complex crystal structure shows that a simultaneous binding of matuzumab and cetuximab (Erbitux) is possible. The latter antibody is already in clinical use. A combination of several therapeutic antibodies in cancer treatment might show synergistic effects and benefits for the patients. Verschiedene Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs), wie z.B. der Epidermale Wachstumsfaktor-rezeptor EGFR oder der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktorrezeptor 1 IGF-1R, können durch Misregulation die Entstehung von neoplastischen Zellen hervorrufen. Ein Ansatz in der Krebstherapie ist die gezielte Inhibition von RTKs durch monoklonale Antikörper. Hier wird die molekulare Basis der Inhibition durch die beiden therapeutischen Antikörper Matuzumab (EMD72000) gegen EGFR und EMD1159476 gegen IGF-1R untersucht. Die 3D-Komplexstruktur von Matuzumab mit der EGFR Domäne III zeigt ein Epitop, das auf einen neuen Inhibitionsmechanismus für EGFR hinweist: eine nicht-kompetitive, rein sterische Blockierung der Rezeptoraktivierung. Der gegen IGF-1R gerichtete monoklonale Antikörper EMD1159476 dagegen zeigt eine eingeschränkte Bindung an den Rezeptor in Gegenwart des Liganden. Das Epitop von EMD1159476 liegt innerhalb der Domäne II des Rezeptors. Die Ergebnisse dieser molekularen Interaktionsstudien könnten Einfluss auf die klinischen Therapieansätze mit monoklonalen Antikörpern haben. Die Matuzumab - EGFR Ko-Kristallstruktur zeigt, dass eine simultane Bindung Matuzumabs und des bereits zugelassenen Antikörpers Cetuximab (Erbitux) an EGFR möglich ist. Eine Kombination von mehreren therapeutischen Antikörpern könnte in der Krebstherapie einen synergistischen Effekt zeigen.

Kerstin Lehner Zsfassung in dt. Sprache Graz, Univ., Diss., 2010

Posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung oder Palmitoylierung, aber auch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen können die Lokalisation von Rezeptoren innerhalb von Detergenz-unlöslichen Membrandomänen/ lipid rafts und somit die Signaltransduktion beeinflussen. In dieser Arbeit wurden die posttranslationalen Modifikationen von LIFR und gp130 und ihr Einfluss auf die Assoziation mit Detergenz-resistenten Membranmikrodomänen untersucht. Palmitoylierung von Cysteinresten innerhalb der Transmembrandomäne eines Proteins kann die DRM-Assoziation beeinflussen. Da gp130 zwei Cysteinreste in der Transmembrandomäne enthält, wurde die Rolle dieser Cysteine für die DRM-Assoziation untersucht. Aus den Befunden kann zusammengefasst werden, dass die Cysteine C711 und C725 in der Transmembrandomäne von gp130 keinen signifikanten Einfluss auf die DRM-Assoziation haben. Nach der Isolierung der DRM mit Brij 58 und Triton X-100 wurde entgegen der Erwartungen sogar eine leichte Steigerung der DRM-Assoziation der C->A-Mutanten beobachtet. Für LIFR konnte nach DRM-Isolierung mit Brij 58 und Triton X-100 eine partielle Assoziation mit den Detergenz-unlöslichen Membrandomänen bestätigt werden. Weiterhin wurden zwei unterschiedliche N-Glykosylierungsformen des Rezeptors nachgewiesen. Die Mannose-reiche (Vorläufer) Form tritt bevorzugt in der Detergenz-löslichen Fraktion auf und wird von dem Enzym Endo-Glykosidase Hf degradiert. Die hybride (reife) Form neigt zur stärkeren Assoziation mit den Detergenz-unlöslichen Mikrodomänen. Nur die reife LIFR-Form wird nach der Bindung von LIF an den Rezeptorkomplex in 3T3-L1- und HepG2-Zellen phosphoryliert, was in Verbindung mit anderen Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe darauf hindeutet, dass nur die reife Form an der Zelloberfläche exprimiert wird und an der Signaltransduktion beteiligt ist. In HepG2-Zellen wurde nach Stimulation mit LIF eine Erhöhung der LIFR-Phosphorylierung in Detergenz-unlöslichen Membranmikrodomänen (DRM) nachgewiesen. Phosphoryliertes gp130 wurde nach LIF-Gabe hingegen hauptsächlich in der nicht-DRM-Fraktion detektiert. Die Widersprüchlichkeit dieses Ergebnisses kann auf methodische Probleme zurückgeführt werden. Außerdem wurde in 3T3-L1-Zellen eine stärkere Phosphorylierung des LIFR in der DRM-Fraktion nicht bestätigt. In 3T3-L1 findet die Aktivierung von gp130 und LIFR in der gleichen Plasmamembrandomäne (nicht-DRM) statt. Das deutet einerseits auf zelluläre Unterschiede bezüglich Rezeptoraktivierung und Verteilung innerhalb der Plasmamembran, und andererseits auf unterschiedliche Sensitivität der lipid rafts gegenüber den verwendeten Detergenzien hin. Post-translational modification of proteins is an important event in the regulation of cellular functions. Glycosylation or palmitoylation, but also ligand binding can affect the localization of proteins in membrane microdomains and thus affect signal transduction. The aim of this study was to analyze how posttranslational modifications of LIFR and the common signal transducer gp130 impact the translocation to detergent resistant membranes (DRMs, lipid rafts). Palmitoylation of cysteine residues within the transmembrane domain of a protein is considered to be one process that assists in the localization of proteins to DRMs. Gp130 has two cysteine residues C711 and C725 in its transmembrane domain. My studies indicate that these cysteine residues have no significant influence on lipid raft association of gp130. Contrary to our expectations, after isolation of DRMs with Brij 58 and Triton X-100 an increase of raft association of the C->A-mutants was detected. Partial DRM association of LIFR was confirmed by using Brij 58 and Triton X-100 protocols. Furthermore, two different N-glycosylation types of that receptor could be detected. The mannose-rich (precursor) species is preferentially found in non-DRMs and is degraded by Endo-Glycosidase Hf. The hybrid-type (mature) tends towards an association with DRMs. My results indicate that only the mature-type of LIFR was phosphorylated after LIF binding to the receptor complex in 3T3-L1 and HepG2 cells. Combined with other data from our workgroup these findings suggest that only the mature-type of LIFR is expressed at the plasma membrane surface and involved in signal transduction. After stimulation with LIF an increase of LIFR tyrosine phosphorylation was observed in DRMs in HepG2 cells. However, phosphorylation of gp130 was detected only in non-DRMs fractions after stimulation with LIF. The inconsistency of these results can be explained with methodical problems. Furthermore, the translocation of phosphorylated receptors described above could not confirmed in 3T3-L1 cells. In this cell line, the activation of gp130 and LIFR occurs in detergent-resistant membranes. These findings indicate differences between cell lines with respect to receptor activation and translocation within the plasma membrane on the one hand and demonstrate a differential sensitivity of raft subdomains to extraction by different detergents on the other hand.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von Faktoren, die zur Determination der Founder- und fusionskompetenten Zellen (FCMŽs) in der viszeralen Muskulatur von Drosophila melanogaster führen, sowie die Etablierung einer GAL4-Treiberlinie für die Expression in den FCMŽs. Als Vorraussetzung für die Generierung der FCM spezifischen GAL4-Treiberlinie wurde die Genkontrollregion von sticks and stones bestimmt. Um das volle Expressionsmuster zu bewirken sind 4,5 kb stromaufwärts des Transkriptionsstartes ausreichend, welche in einen neu generierten GAL4-Vektor ligiert wurden. Für die Untersuchung der Mechanismen, die an der Zell-Determination im viszeralen Mesoderm beteiligt sind, wurden zwei unterschiedlichen Ansätze gewählt. Zunächst sollten Analogien zum Determinationsprozeß in der somatischen Muskulatur analysiert werden. Hier ist vor allem Notch, mit dem Prozeß der lateralen Inhibition, wichtig für die Selektion der Vorläuferzellen, aus einer Gruppe von Lethal of scute exprimierenden Zellen. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen zeigen, daß Notch auch im viszeralen Mesoderm in der Determination der Founderzellen involviert ist. Ebenso scheint Lethal of scute für diesen Prozeß wichtig zu sein, wie durch RNAi-Experimente und Mutanten Analyse gezeigt werden konnte. Andere Komponenten, die am Prozeß der lateralen Inhibition beteiligt sind, haben keinen Einfluß auf den Determinationsprozeß in der viszeralen Muskulatur. Notch scheint daher im viszeralen Mesoderm über einen alternativen Signalweg zu wirken. Des weiteren wurde eine Kollektion EMS-mutagenisierter Fliegen durchgemustert, um Faktoren zu identifizieren, die einen Defekt in der viszeralen Muskulatur aufweisen. Hierdurch wurden acht Mutanten identifiziert, die sich in drei Gruppen einteilen lassen. Bei der ersten Gruppe besteht das viszerale Mesoderm nur aus FCMŽs und ist nach dem Stadium 11 nicht mehr zu detektieren. Bei der zweiten Gruppe wird das viszerale Mesoderm zunächst normal ausgebildet, es umschließt dann aber nicht den Mitteldarm. Die dritte Gruppe bildet kein viszerales Mesoderm aus. Genetische Analysen der zwei Mutanten der ersten Gruppe zeigten, daß sie neue Allele des vom somatischen Mesoderm sekretierten Faktors Jelly belly und der im viszeralen Mesoderm exprimierten Rezeptor Tyrosin Kinase Alk sind, deren Zusammenwirken im gleichen Signalweg gezeigt werden konnte. Die beiden Mutanten weisen, neben den fehlenden Founderzellen in der viszeralen Muskulatur, einen spezifischen Verlust der FCMŽs in der somatischen Muskulatur auf. Dieser Verlust wird allerdings durch die normal differenzierten FCMŽs des viszeralen Mesoderms wieder ausgeglichen. Der neu identifizierte Alk vermittelte Jeb-Signalweg ist also für die Determination der Founderzellen in der viszeralen, sowie der FCMŽs in der somatischen Muskulatur essentiell., The aim of this dissertation was to analyse factors that are involved in the determination of the founder and fusion competent myoblasts (FCM) in the visceral mesoderm of Drosophila melanogaster as well as to establish a GAL4-driver line for the expression in the FCM. As a prerequisite for the establishment of the GAL4-driver line the promoter region of sticks and stones was analysed. A fragment of 4.5 kb upstream of the transcription start site of sns was found to be sufficient to get the full expression pattern. This fragment was ligated in a newly generated GAL4-vector. To analyse the mechanisms that are involved in the cell determination in the visceral mesoderm two different approaches were undertaken. First, it was investigated if the processes that are involved in the determination in the somatic mesoderm also play a role in the visceral mesoderm. In the former Notch is mainly involved in the selection of the muscle precursor cells from a group of lethal of scute expressing cells in a process called lateral inhibition. The obtained results show that also in the visceral mesoderm Notch is involved in the determination of the founder cells. Furthermore, lethal of scute seems to be important for this process, as shown by RNAi experiments and analysis of mutants. Other factors that are known to be involved in the precursor selection in the somatic mesoderm did not seem to have an effect in the visceral mesoderm. Therefore, Notch seems to act through an alternative pathway in this tissue. Secondly, a collection of EMS-mutagenised flies was screened to obtain new factors that are involved in the development of the visceral mesoderm. Hereby eight mutants were identified which can be subdivided into three groups. In mutants of the first group the visceral mesoderm consists only of FCM and is no longer detectable after stage 11. The mutants of the second group establish a normal band of the visceral mesoderm in stage 11, but later on it does not surround the midgut. In the mutants of the third group no visceral mesoderm is detectable at any stage. Genetic analysis of the mutants of the first group showed that they are new allels of Jelly belly, which is secreted from the somatic mesoderm and the Receptor Tyrosin Kinase Alk, which is expressed in the visceral mesoderm. It could be shown that Jelly belly and Alk act together in the same pathway. In addition to the loss of founder cells in the visceral mesoderm both mutants showed a specific loss of FCM in the somatic mesoderm. The lacking FCM were replaced by the FCM of the visceral mesoderm, which differentiated normally. The newly identified Alk-mediated Jeb-signalling pathway therefore seems responsible for the determination of the visceral founder and the somatic FCM.

VEGF u. Flt-1 wurden hinsichtlich ihrer therapeutischen und prognostischen Relevanz an Lungentumoren im Stadium III untersucht. Vor u. nach Therapie gewonnenes Gewebe von neoadjuvant behandelten Patienten mit einem nicht-kleinzelligen bösartigen Lungentumor wurde mittels poly- und monoklonaler Antikörper nach der APAAP-Methode auf ihre VEGF- u. Flt-1-Expression untersucht. Der Vergleich der VEGF-Expression unter dem monoklonalen Antikörper ergab bei den klinischen Parametern keinen signifikanten Unterschied. VEGF-negative Tumoren waren signifikant häufiger in der für das Überleben günstigeren Gruppe mit den Regressionsgraden IIb/III einzuordnen u. hatten signifikant längere Überlebenszeiten. Die geringe Spezifität des polyklonalen VEGF-Antikörpers erlaubte keine Auswertung. Die Auswertung der Flt-1-Expression ergab kein signifikantes Ergebnis. Die immunhistochemisch ermittelte VEGF-Expression konnte als möglicher Prognosefaktor für bessere Überlebenszeiten der Patienten ermittelt werden.

Durch die Bindung an seinen spezifischen Rezeptor und die anschließende Aktivierung von ERK (exracellular signal-regulated kinase) trägt GnRH (gonadropin releasing hormone) zur Aufrechterhaltung der gonadotropen Funktion bei. Da der GnRH-Rezeptor ausschließlich mit Gq/11-Proteinen interagiert und die Rezeptorexpression ?-Arrestin-unabhängig erfolgt, bietet er sich für die systematische Aufschlüsselung zugrundeliegender Signalwege an. In gonadotropen ?T3-1-Zellen, welche den GnRH-Rezeptor endogen exprimieren, führte eine GnRH-Behandlung zu einer schnellen ERK-Aktivierung; diese wurde durch das Tyrphostin AG1478, einem spezifischen Inhibitor der EGFR(epidermal growth factor receptor)-Tyrosinkinase, inhibiert. In COS-7-Zellen, die den menschlichen GnRH-Rezeptor transient exprimieren, erfolgte die Agonisten-induzierte ERK-Aktivierung unabhängig von freien G??-Untereinheiten und konnte durch eine kurzzeitige Phorbolester-Behandlung nachgeahmt werden. Besonders bemerkenswert war, daß die Gq/11-induzierte ERK-Aktivierung durch N17-Ras und durch die Expression der C-terminalen Src-Kinase inhibiert werden konnte, aber auch durch weitere dominant negative Mutanten von Signalkomponenten wie Shc und dem EGF-Rezeptor, welche proximal von Ras lokalisiert sind. Sowohl GnRH als auch Phorbolester bewirkten in COS-7- und ?T3-1-Zellen eine Ras-Aktivierung, die von Src und der Tyrosinkinase des EGFR abhängig war; dies indiziert, daß beide Tyrosinkinasen distal der Proteinkinase C (PKC) und proximal von Ras agieren. Dessen ungeachtet war Src nicht an der Shc-Tyrosinphosphorylierung beteiligt. Die Behandlung mit GnRH oder Phorbolester führte zu einer PKC-abhängigen EGFR-Autophosphorylierung., Gonadotropin releasing hormone (GnRH) contributes to the maintenance of gonadotrope function by increasing extracellular signal-regulated kinase (ERK) activity subsequent to binding to its cognate G-protein-coupled receptor. As the GnRH receptor exclusively interacts with Gq/11 proteins and as receptor expression is regulated in a ?-arrestin-independent fashion, it represents a good model to systematically dissect underlying signaling pathways. In ?T3-1 gonadotropes endogenously expressing the GnRH receptor, GnRH challenge resulted in a rapid increase in ERK activity which was attenuated by the epidermal growth factor receptor (EGFR)-specific tyrosine kinase inhibitor AG1478. In COS-7 cells transiently expressing the human GnRH receptor, agonist-induced ERK activation was independent of free G?? subunits but could be mimicked by short-term phorbol ester treatment. Most notably, Gq/11-induced ERK activation was sensitive to N17-Ras and to expression of the C-terminal Src kinase but also to other dominant negative mutants of signaling components localized upstream of Ras, like Shc and the EGFR. GnRH as well as phorbol esters led to Ras activation in COS-7 and ?T3-1 cells, which was dependent on Src and EGFR tyrosine kinases, indicating that both tyrosine kinases act downstream of protein kinase C (PKC) and upstream of Ras. However, Src did not contribute to Shc tyrosine phosphorylation. GnRH or phorbol ester challenge resulted in PKC-dependent EGFR autophosphorylation.

Das Two-Hybrid-System ist eine relativ neue molekularbiologische Methode, die es erlaubt, Wechselwirkungen von Proteinen in vivo zu studieren und auf diese Weise bekannte und womöglich neue Substrate eines Zielproteins zu identifizieren. Hauptziel der hier vorliegenden Arbeit war es, zu prüfen, ob sich dasTwo-Hybrid-System dazu eignen würde, intrazelluläre Interaktionspartner der beiden Rezeptortyrosinkinasen UFO (= unknown function of an oncogene) bzw. MET (= HGF = hepatocyte growth factor) näher zu charakterisieren und beim Durchmustern von Fusionsbibliotheken neue Substrate für diese beiden Onkogene identifizieren. Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Klonierung der intrazellulären Anteile der beiden Rezeptoren in Hefeexpressionsvektoren der DNA bindenden Domäne pGBT9 (= GAL4 DNA binding domain with target protein) bzw. pAS2 (= GAL4 DNA binding domain with advanced selection) sowie den Nachweis erfolgreicher Proteinexpression und (Auto-) Phosphorylierung aller Konstrukte in vivo. Um die relativ schwache Tyrosinkinaseaktivität von UFO und die damit eingeschränkte Fähigkeit zur Bindung von Substraten zu erhöhen, verwendeten wir das Fusionskonstrukt TPR-UFO (= translocated promoter region). Es zeigte sich, dass das Rezeptorkonstrukt TPR-UFO stärker autophosphoryliert wurde als UFO. Außerdem wurden unsere Konstrukte im Vektor pGBT9 quantitativ ähnlich stark, aber deutlich stabiler exprimiert als im Vektor pAS2. Entsprechende Publikationen während dieses Zeitraumes bestätigten dieses Ergebnis. Wir verwendeten daher im weiteren Verlauf ausschließlich pGBT9-Konstrukte. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass sich die zu erwartende Transformationseffizienz durch Kultur der Hefezellen in sogenannten Schikanekolben unter maximalem Selektionsdruck, durch erhöhten Adenin-Gehalt der Kulturmedien, durch Verwendung hochmolekularer Carrier-DNA und von DMSO ( = Dimethylsulfoxid ) bei der Transformation von Hefen, sowie durch die Titration von cDNA-Bibliotheken deutlich steigern lässt. Die Transformationseffizienz kann als entscheidendes Kriterium für die erfolgreiche Durchführung des Two-Hybrid-Systems angesehen werden. Durch Kotransformationen konnten wir drei bereits bekannte Interaktionspartner der Rezeptortyrosinkinase UFO, nämlich Phospholipase Cg, P85a (= eine Untereinheit der Phosphatidylinositol 3-Kinase) und GRB2 (= growth factor receptor binding protein 2) im Two-Hybrid-System bestätigen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Durchmustern von Fusionsbibliotheken nach neuen Interaktionspartnern für die beiden Rezeptortyrosinkinasen UFO und MET. Für den in unserer Arbeitsgruppe entdeckten und klonierten Tyrosinkinaserezeptor UFO konnten in verschiedenen cDNA-Bibliotheken (rat embryo, human fetal liver und thymus) zwar mehrfach Interaktionen mit GRB2 bestätigt, aber keine neuen Substrate isoliert werden. Beim Screening der Fusionsbibliothek rat embryo mit unserem zweiten Zielprotein TPR-MET konnten wir neben dem bereits erwarteten GRB2 auch die Proteine SNX2 (= sorting nexin 2 ), ZIP Kinase (= zeta interacting protein ), Tid56 (= tumorous imaginal disc protein 56 ), BICD (= bicaudal D ) und LB1 (= human lamin B1 ), sowie darüber hinaus die kodierenden Teilsequenzen von zwei bisher unbekannten, noch nicht näher charakterisierten Genen, als neue Interaktionspartner ermitteln. In nachfolgenden Untersuchungen wird derzeit der Versuch unternommen, mögliche Wechselwirkungen zwischen SNX2, Tid56 bzw. BICD und den beiden unbekannten Proteinen mit der zytoplasmatischen Domäne des Tyrosinkinaserezeptors MET zu verifizieren, um darüber neue Einsichten in die MET - vermittelte Signalkaskade zu gewinnen.