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Introduction: Ten viral genotypes (A-J) distributed in all continents have been described for hepatitis B virus (HBV). One of the methodologies for determining the viral genotype is the restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique, a simple and relatively inexpensive method, albeit with some limitations.Objective: The initial objective of the project was to identify the HBV genotypes by RFLP in serum samples obtained from patients and blood donors. However, due to the discrepancies of RFLP patterns it was also necessary to perform phylogenetic genotyping and in silico analysis of HBV sequences.Materials and methods: We obtained 56 serum samples. DNA extraction was followed by PCR amplification of a fragment of HBV ORF S. We analyzed PCR products by RFLP with AlwI, BsrI, CfrI, HpaII and StyI, and we sequenced some. We compared the patterns obtained with those in previous reports. We also performed RFLP analysis in silico since we found differences between the patterns expected and those obtainedResults: We identified genotypes A and F, subgenotype F3, in the samples. This result is in agreement with those of previous studies carried out in Colombia; indeed, subgenotype F3 is the most frequent in the Andean region of the country, while genotype A is the most frequent HBV genotype in the western region (department of Chocó). Based on the in silico analysis of 229 HBV sequences from GenBank and 11 sequences of this study, we identified the RLFP pattern for genotype F, subgenotype F3, and we described some modifications of genotype A RFLP patterns.Conclusions: We identified the single nucleotide polymorphism pattern for genotype F, subgenotype F3, by in silico analysis and sequencing. Further robust in silico analyses are necessary to validate the RFLP patterns of HBV genotype and subgenotypes., Introducción. Se han descrito diez genotipos (A-J) del virus de la hepatitis B (HBV) que están distribuidos en todos los continentes. Una de las técnicas utilizadas para determinar el genotipo viral es el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, un método simple y económico, pero con algunas limitaciones.Objetivo. El objetivo inicial del estudio fue identificar el genotipo del HBV mediante RFLP en muestras de suero obtenidas de pacientes y donantes de sangre. Sin embargo, por las discrepancias observadas en los patrones de RFLP fue necesario realizar análisis filogenéticos y un análisis in silico de secuencias del HBV.Materiales y métodos. Se obtuvieron 56 muestras de suero. Tras la extracción de ADN, se amplificó un fragmento del ORF S del HBV mediante reacción en cadena de la polimerasa, cuyos productos se analizaron por RFLP con las enzimas AlwI, BsrI, CfrI, HpaII y StyI, y algunos se secuenciaron. Los patrones obtenidos se compararon con los reportados previamente. Se efectuó un análisis in silico de RFLP en consideración de las diferencias entre los patrones esperados y los observados.Resultados. Se identificaron los genotipos A y F, subgenotipo F3, en las muestras. Este resultado coincide con lo descrito en estudios previos en los que se ha demostrado que el genotipo F, subgenotipo F3, es prevalente en la población de la región andina del país, en tanto que el genotipo A predomina en el occidente (departamento del Chocó). Con base en el análisis in silico de 229 secuencias virales obtenidas del GenBank y las 11 secuencias de este estudio, se caracterizó un nuevo patrón de RFLP específico para el genotipo F, subgenotipo F3, y se describieron algunas modificaciones en el patrón de RFLP del genotipo A, subgenotipo A1.Conclusiones. Se caracterizó el patrón de genotipificación del genotipo F, subgenotipo F3, del HBV mediante RFLP, análisis in silico y secuenciación. Se requieren nuevos análisis in silico con un número mayor de secuenc