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Immune hemolysis is a well-recognized complication in allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The generation of autoantibodies or alloantibodies triggered by the stem cell infusion, transfusion of blood components and exposure to medications, contribute to clinically significant complications in patients undergoing HSTC. The aim of this study was to evaluate the development of immune hemolysis in HSTC. Between July and December 2018, 21 patients were submitted to HSTC. Pretransplant samples were evaluated twice a week going through the hospitalization period and weekly up to 100 days after transplantation were evaluated with hemogram, reticulocytes, lactate dehydrogenase (LDH), indirect bilirubin (BI) and immunohematologic tests. The descriptive statistics (with median, mean and frequency distribution) and analysis using the Mann-Whitney test (non-parametric data), SPSS 2.0, with p 0.05). The development of autoantibodies and alloantibodies against erythrocyte antigens is not common in patients which undergo allogeneic haematopoietic stem cell transplantation; however, complications related to ABO incompatibility between recipient and donor of HSTCs occurred in 9.52% of transplants. A hemólise imune é uma complicação reconhecida no transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (TCTHalo). A formação de autoanticorpos ou aloanticorpos, desencadeados pela infusão das células-tronco, transfusões de hemocomponentes e exposição a medicamentos, contribuem para complicações clinicamente significativas em pacientes submetidos ao TCTHalo. O objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento da hemólise imune no TCTHalo. Foram incluídos, entre julho e dezembro de 2018, 21 pacientes submetidos ao TCTHalo. Amostras pré-transplante, duas vezes na semana, no período de internação e, semanalmente, até 100 dias após o transplante, foram avaliadas com hemograma, reticulócitos, lactato desidrogenase (LDH), bilirrubina indireta (BI) e testes imuno-hematológicos. Adotaram-se para análise dos dados a estatística descritiva (com mediana, média e distribuição de frequência) e a analítica pelo teste de Mann-Whitney (dados não paramétricos), programa SPSS 2.0, com p0,05). O desenvolvimento de auto e aloanticorpos contra antígenos eritrocitários não é comum em pacientes submetidos ao transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas, no entanto, complicações relacionadas à incompatibilidade ABO entre receptor e doador das CTH ocorreram em 9,52% dos transplantes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O CD3 como alvo terapêutico de anticorpos, pode induzir a depleção parcial dos linfócitos T circulantes, provocando uma imunossupressão, que pode ser explorada clinicamente. Com isso, a busca por anticorpos anti-CD3 humanizados tem relevância biotecnológica. Entretanto, o CD3 é um antígeno de membrana de difícil preparação. Desse modo, procuramos obter um antígeno mimético ao CD3 que se ligue com alta afinidade a um anticorpo conhecidamente imunomodulador, o anticorpo monoclonal OKT3, de forma a facilitar a busca de novos anticorpos terapeuticos. Para isso utilizou-se o biopanning, por phage display, para selecionar peptídeos ligantes, a partir de uma biblioteca de peptídeos randômicos constrita de sete resíduos, PhDC7C (Biolabs). Um protocolo de seleção baseado em seleção negativa com IgG2a de camundongo, seguido de três ciclos sucessivos de seleção positiva. Para validação desses biopanning foi feita a titulação dos ciclos comparando-os a uma curva padrão, usando a biblioteca original amplificada por PCR, que foi utilizada para normalizar a quantidade de DNA. Foram obtidas sub-bibliotecas com um título em torno de 106 pfu/mL. Essas sub-bibliotecas foram analisadas por sequenciamento de DNA de alto desempenho e por bioinformática em busca de peptídeos selecionados especificamente pelo paratopo do anticorpo OKT3, um anti-CD3. Com a análise de bioinformática foi permitido à comparação das sequencias obtidas aos bancos de dados, existentes. Assim, foram excluídos, os peptídeos conhecidamente resultante de seleção inespecífica. Em conclusão, não foi possível encontrar um peptídeo ligante ao alvo de interesse. Provavelmente o viés encontrado na biblioteca, interferiu no sucesso da técnica, mas modificações no protocolo de seleção deverão ser considerados na seleção de peptídeos ligantes, que sirvam de mimotopos. Anti-CD3 antibodies, a target for antibody therapy, may induce partial depletion of circulating T lymphocytes, causing immunosuppression, which can be explored clinically. Thus, a search for humanized anti-CD3 antibodies has a biotechnological relevance. However, CD3 is a difficult-to-prepare membrane antigen. Thus, we aim to obtain a CD3 antigen mimetic that binds with high affinity to a known immunomodulatory anti-CD3, the mouse monoclonal antibody OKT3. We use a seven-residue, phage display peptide library PhDC7C (Biolabs) to select for OKT3 mAb ligands peptides. The screening involves a negative selection with mouse IgG2a and three successive positive selection cycles. The validation of biopanning was done with PCR, which was used to quantify the amount of DNA. Sub-libraries with a titer of about 106 pfu / ml were obtained. These sub-libraries were analyzed by high-throughput DNA sequencing and by bioinformatics in search peptides selected specifically for the paratope of the OKT3 molecule. With a bioinformatics analysis it was possible to compare the sequences with the existing databases. Thus, peptides known as non-specific binding were excluded. However, a peptide binding to the target of interest could not be found. Further improvement in selection techinique may yield to specific OKT3 binding mimotopes.

Liver transplant (LT) anemia is multifactorial. Immune hemolysis occurs due to auto-antibodies, drug induced or not, or due to allo-antibodies, formed by transfusion or passenger lymphocyte syndrome (PLS). The aim of this study was to evaluate the prevalence and risk factors for immune hemolysis in LT. Between September 2014 and April 2016, 175 patients submitted to 178 LT were included. Multi-organ recipients were excluded. Samples from before, seven consecutive days and weekly for four weeks were analyzed for complete blood cound, reticulocyte count, lactate dehydrogenase (LDH), indirect bilirrubin (IB) and imummohematological tests. SPSS 24 was used for statistical analysis, p

Álvarez, G. I. (2022). Regulación genética y epigenética de la producción de IFN-γ y su asociación con la susceptibilidad a la Tuberculosis. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina : Universidad Nacional de Quilmes. La tuberculosis, causada por el patógeno Mycobacterium tuberculosis, a pesar de ser una enfermedad curable, continúa siendo un grave problema para la salud mundial causando altos niveles de morbilidad y mortalidad. Comprender el rol de los factores genéticos en el control de la resistencia/susceptibilidad a la tuberculosis abriría posibilidades de desarrollar medidas preventivas y terapias genotípicas-específicas, optimizando la respuesta inmune frente a M. tuberculosis. Los polimorfismos de nucleótido simple (SNP) son la “marca genética de susceptibilidad” elegida en estudios de caso-control. Teniendo en cuenta la importancia del IFN-y en la respuesta inmune frente a M. tuberculosis, en el presente trabajo de tesis evaluamos el SNP +874 A/T del IFNG. Previamente reportamos que la Molécula linfocitaria activadora de señales (SLAM), induce la producción de IFN- y en respuesta a la infección por M. tuberculosis, regulando la respuesta Th1 protectiva. Teniendo en cuenta estos antecedentes analizamos los SNPs -262 A/T, -188 A/G y +1343 G/T de SLAM. Por otro lado, dado que la proteína de unión a SLAM (SAP) es un regulador negativo de la producción de IFN- y inducida por SLAM, se evaluaron tres SNPs presentes en este gen (-631 A/G, -494 A/G y -346 C/T). De los siete SNPs estudiados, el SNP +874 A/T es el único previamente reportado en estudios de susceptibilidad a la tuberculosis en varias poblaciones alrededor del mundo. Nuestros resultados demostraron elevada frecuencia del genotipo AA del SNP de IFN- y +874 A/T en el grupo de pacientes con tuberculosis activa, sin embargo no se observó asociación con los niveles de producción de esta citoquina. Así el alelo A y el genotipo AA del SNP +874A/T del IFN- y podría ser considerado un marcador de susceptibilidad a la tuberculosis en nuestra población de estudio. Sin embargo este marcador no estaría asociado con la severidad de la enfermedad. En cuanto a los tres SNPs de SLAM analizados, hallamos elevada frecuencia del haplotipo AA/GG de los SNPs de SLAM -262 A/T y -188 A/G y del genotipo GG del SNP de SLAM +1343 G/T en los tres grupos en estudio (pacientes con tuberculosis activa, individuos con tuberculosis latentes y dadores sanos). Debido a esto, los SNPs de SLAM evaluados no pueden ser considerados una marca genética de riesgo para el desarrollo de tuberculosis activa. Finalmente, al estudiar los SNPs de SAP observamos que los genotipos AA (SNP -631 A/G), GG (SNP -494 A/G) y TT (SNP -346 C/T) de manera individual y de acuerdo a lo esperado, como haplotipo AA/GG/TT, podrían ser marcadores de susceptibilidad para el desarrollo de la tuberculosis, dada su alta frecuencia en el grupo de pacientes con tuberculosis activa. Más aún, estos SNPs se asocian con a una menor producción de IFN- y. En pacientes con tuberculosis activa el alelo T del SNP de SAP -346 C/T se asocia con mayores niveles de ARNm de SAP y menor producción de IFN- y, lo cual podría deberse a que la citosina presente en esta posición es un sitio de metilación (por lo que la presencia del alelo T impide la misma). Interesantemente, hallamos que la combinación haplotípica IFN- y-SAP AA-AA/GG/TT además podría ser considerado un marcador genético de riesgo a la progresión a la tuberculosis activa. Por otro lado, ha sido sugerido que la variación pre-existente en el epigenoma de poblaciones celulares específicas puede afectar la susceptibilidad del hospedador a la tuberculosis. La metilación del ADN y la acetilación de histonas son los mecanismos de regulación epigenética más ampliamente estudiados. En el presente trabajo decidimos evaluar el estado de metilación del sitio CpG -53 presente en la región promotora del gen de IFN- y. Este sitio ha sido demostrado por tener un fuerte impacto en el control de la expresión de IFNG cuando fue analizado en líneas celulares Th1. Observamos elevada metilación del sitio CpG -53 en muestras de sangre de pacientes con tuberculosis activa, lo que sugiere una falla en la regulación epigenética de este sitio el cual debería demetilarse durante la enfermedad activa, permitiendo la diferenciación eficiente hacia un perfil Th1. Blimp1 y TLE4 forman un complejo represor capaz de inhibir la expresión del gen de IFN- y en células Th2 y en condiciones de anergia. Interesantemente, observamos que tanto en pacientes con tuberculosis activa como en dadores sanos, la cinética de expresión de los represores se asocia de manera inversa con respecto al IFN- y. Es decir, los mayores niveles de expresión de IFN- y se observaron en aquellos tiempos donde se detectaron los niveles más bajos de ambos represores Blimp1 y TLE4. Así, estos resultados sugerirían un rol represor de Blimp1 y TLE4 en el control de la expresión de IFN- y en respuesta a la estimulación con M. tuberculosis. El mecanismo de represión del complejo Blimp1/TLE4 es el reclutamiento de deacetilasas de histonas (HDACs) del tipo I/II, metiltransaferasas de ADN e histonas metiltransferasas al locus IFNG. Al utilizar el inhibidor de deacetilasas benzamida (MS-275) específico de HDACs del tipo I, la producción de IFN- y se incrementó significativamente. Así, estos resultados demuestran que la deacetilación de las histonas es uno de los mecanismos de regulación negativa de la producción de IFN- y en respuesta a M. tuberculosis, sugiriendo además que el complejo Blimp1/TLE4 podría estar involucrado en el control epigenético del IFN- y en respuesta a la infección por M. tuberculosis, a través del reclutamiento de HDACs a la cromatina. En conjunto los resultados obtenidos permiten establecer una marca genética de susceptibilidad a la tuberculosis y aportan nuevos mecanismos de regulación genética y epigenética de la producción de IFN- y en la respuesta inmune frente a M. tuberculosis. Tuberculosis, an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, despite being a curable disease, is still a global health problem that causes high mortality and morbidity rates. Understanding the genetic factors that determine resistance/susceptibility to tuberculosis would open new opportunities for the development of preventive measures and specific genotypic therapies, improving the immune response against M. tuberculosis. Single Nucleotides Polymorphisms (SNP) are the susceptibility genetic mark of choice in case control studies. IFN-y is a key cytokine in the immune response against M. tuberculosis. Therefore, in this work we evaluated the +874 A/T SNP of IFNG. Moreover, we have previously shown that the Signaling Lymphocytic Activation Molecule (SLAM) induce IFN-y production in response to M. tuberculosis, regulating the generation of Th1 protective responses. Taking this in consideration, we analyzed the -262 A/T, -188 A/G and +1343 G/T SLAM SNPs. Moreover, since SLAM associated protein (SAP) is a negative regulator of SLAM induced- IFN-y, three SNPs on this gene were also evaluated (-631 A/G, -494 A/G y -346 C/T). The +874 A/T SNP of IFN-y is the only one of the seven SNPs studied, that has been previously evaluated for tuberculosis susceptibility in other populations around the world. Our results demonstrate an elevated frequency of the AA genotype of the IFN-y +874 A/T SNP in the group of patients with active tuberculosis, however no association was observed with the levels of cytokine produced in response to M. tuberculosis. Thus, the Abstract -6- AA genotype of IFN-y +874A/T SNP could be a susceptibility marker of tuberculosis in Argentina. However, this marker was not associated with disease severity. Regarding SLAM SNPs, we found an elevated frequency of the AA/GG haplotype for the SLAM -262 A/T and -188 A/G SNP; and the GG genotype of SLAM +1343 G/T SNP in the three groups of individual evaluated (patients with active tuberculosis, individuals with latent tuberculosis infection and healthy donors). Therefore, the SLAM SNPs studied could not be considered as genetic markers for tuberculosis susceptibility. Finally, for the SAP SNPs we observed that the AA (SNP -631 A/G), GG (SNP -494 A/G) and TT (SNP -346 C/T) genotypes individually and as an haplotype (AA/GG/TT), could be a strong marker of tuberculosis susceptibility, since the high frequency found in patients with active tuberculosis. Moreover, those SNPs were associated with lower IFN-y production. Patients with the T allele for the SAP -346 C/T SNP showed the highest levels of SAP mRNA and the lowest production of IFN-y, which could be a consequence of a differential epigenetic regulation of the gene (since the cytosine in this position is plausible of being methylated). Interestingly, we found that the SAP haplotype in combination with the AA susceptible genotype of IFN-y (IFN-y-SAP AA AA/GG/TT) could also be a genetic marker of risk for disease progression. On the other hand, it has been suggested that pre-existing variations in the epigenome of specific cell populations could mediate host susceptibility to tuberculosis. DNA methylation and acetylation of histones are the epigenetic mechanisms more widely studied. In this work we evaluated methylation at the -53 CpG site of the promoter region of IFN-y. This site has a strong impact in the control of IFNG expression in Th1 cell lines. We observed and increased methylation of the -53 CpG site in blood samples of tuberculosis patients, which suggest a failure on the epigenetic regulation during Abstract -7- active disease, since demethylation of this site would occur to allow and efficient Th1 differentiation. Blimp1 and TLE4 binds to form a repressor complex that is capable of inhibits IFN-y gene expression in Th2 cells and during anergic conditions. Interestingly, we observed that M. tuberculosis stimulated cells from patients with active tuberculosis and healthy donors positively regulated these two repressors and that it’s kinetic of expression was negatively associated with IFN-y mRNA expression. Meaning, the highest levels for IFN- y were observed at those times were low levels of Blimp1 and TLE4 were detected. Thus, these results suggest that Blimp1 and TLE4 could have a role in the control of IFN-y expression in response to M. tuberculosis stimulation. The mechanism of repression mediated for the Blimp1/TLE4 complex involves the recruitment of type I/II histone deacetylases (HDACs), DNA methyltransferases and histone methyltransferases at the IFNG locus. By using an HDAC inhibitor (MS-275), which specifically inhibits type I HDACs, we observed a significantly increase of IFN-y in M. tuberculosis stimulated cells. Therefore, this results demonstrate that histone deacetylation is one of the mechanisms that negatively regulate IFN-y production in response to M. tuberculosis, suggesting that the Blimp1/TLE4 repressor complex could be involved in the epigenetic control of IFN-y during M. tuberculosis infection, through the recruitment of HDACs to the chromatin. Taken together our results allow the identification of a genetic mark of tuberculosis susceptibility and contribute with new mechanisms of genetic and epigenetic regulation of IFN-y in the immune response against M. tuberculosis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. Pepper mild mottle virus (PMMoV) é um tobamovírus que possui genoma de RNA de fita simples com polaridade positiva. O vírion é composto pelo genoma envolvido por múltiplas cópias da proteína do capsídeo (CP). A fim de construir clones infectivos de PMMoV para desenvolver vetor de expressão de proteína heteróloga, duas estratégias simplificadas foram avaliadas, a primeira baseada na produção in vitro de transcritos infectivos e a segunda com o uso de vetor binário para agroinoculação. Primeiramente, o cDNA de PMMoV foi clonado no vetor pCR4-TOPO e, posteriormente, subclonado em pUC19, sob o comando do promotor T7 para a realização da transcrição in vitro. Os transcritos foram inoculados em folhas de Nicotiana benthamiana e após três semanas mostraram sintomas de mosaico e distorção foliar, indicações diretas da recuperação do vírus com este procedimento. A recuperação de vírus e infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV e microscopia eletrônica de transmissão. A segunda estratégia consistiu na clonagem do genoma no vetor binário derivado de pTRV2-MCS contendo o plasmídeo pCAMBIA 0390 modificado, pela técnica de overlap-extension PCR. A clonagem foi confirmada a partir da análise do padrão de digestão por enzima de restrição e sequenciamento. Agrobacterium tumefaciens foi transformada com a construção pCAMBIAPMMoV e folhas de N. benthamiana foram inoculadas para avaliar a recuperação do vírus. As plantas agroinoculadas apresentaram sintomas típicos de PMMoV em folhas inoculadas e folhas acima. A infecção foi confirmada por DIBA usando anticorpo policlonal anti-PMMoV. A possibilidade da adição de epítopos na capa proteica do vírus como ferramenta biotecnológica foi avaliada, inserindo genes de epítopo do vírus da dengue no clone agroinfectivo. Essa estratégia poderá fornecer uma ferramenta de apresentação de epítopos na superfície da CP em partículas montadas de PMMoV em grande escala. Um peptídeo de 24 aminoácidos contendo dois epítopos em tandem localizado nos domínios I/II da proteína E de DENV-1 foi inserido em duas posições distintas no gene cp: um entre os aminoácidos 59/60 e outro entre os aminoácidos 154/155. Após a inoculação, não apareceram sintomas de PMMoV e não foi possível detectar CP modificada em ambas as construções, apesar da confirmação dos clones por sequenciamento. Provavelmente a adição de 24 aminoácidos em cp interferiu no padrão de dobramento e na sua propriedade de automontagem. O tamanho do epítopo para display deverá ser avaliado no futuro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Pepper mild mottle virus (PMMoV) is a tobamovirus and consists of a monopartite single-stranded RNA genome in a positive polarity. The virion forms nucleoproteins in rodshaped rigid particles. Aiming to construct infectious PMMoV clones for expressing heterologous proteins, two distinct, strategies were attempted. The first strategy was based on in vitro infectious transcripts and the second on binary vector for agro-infiltration. The cDNA of PMMoV was cloned into pCR4-TOPO and subcloned into pUC19 under the T7 promoter for in vitro transcription. Transcripts were inoculated in Nicotiana benthamiana leaves. After three weeks plants showed typical PMMoV symptoms, such as mosaic and distortion. The virus recovery, hence infection, was confirmed by DIBA using polyclonal antibody raised against PMMoV and electron microscopy. The PMMoV complete genome and the binary plasmid, derived from pTRV2-MCS (modified pCAMBIA 0390) were fused by overlapextension PCR. Selected clones were confirmed by restriction digestion profile and DNA sequencing. N. benthamiana plants were agroinoculated with A. tumefaciens harvesting pCAMBIA-PMMoV clones. Plants showed symptoms similar to those from wild type virus both in inoculated and upper leaves. Infection was confirmed by DIBA. The use of coat protein as epitope display platform tool was evaluated by inserting an epitope from Dengue virus 1 in the agroinfectious clone pCAMBIA-PMMoV. This strategy can be applied for epitope display on the CP surface in PMMoV particles in large scale. A peptide of 25 amino acids containing two epitopes in tandem (domains I/II E protein from DENV-1) was inserted in two different positions in the cp gene; between amino acids 59/60 and 154/155. After agroinoculation it was not possible to detect CP carrying the epitope in both constructions, however DNA sequencing confirmed the epitope presence. Probably the 25-amino acid insertion in the cp gene led to incorrect CP folding and to unfavorable self-assembly. The epitope length will be evaluated for future display studies.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013. A Dengue hoje está presente em mais de 100 países, causando aproximadamente 100 milhões de casos da doença. O diagnóstico laboratorial é de fundamental importância, devido a semelhança de sintomas confundidos com outras doenças como a Febre amarela, Sarampo, Rubéola e Influenza. Técnicas sorológicas como o ELISA são amplamente empregadas para o diagnóstico, entretanto, devido ao uso de extrato bruto viral como fonte de antígeno, ocorrem problemas de reações cruzadas, variação de qualidade e alto custo de produção. Objetivando a diminuição destes problemas com ensaios convencionais de ELISA, antígenos virais recombinantes têm sido produzidos e utilizados em ensaios diagnósticos. Neste trabalho utilizou-se o sistema de transplastomia em alface para a produção de um antígeno recombinante tetra-epitopo, o que permitiu o emprego do extrato bruto proteico de cloroplastos, sem purificação, na detecção sorológica de anticorpos IgG contra os 4 sorotipos da Dengue. O antígeno tetra-epítopo desenvolvido, compreende a região de epítopos que vai do aminoácido 34 ao 57, entre os domínios I/II da proteína do envelope do vírus. O antígeno é composto pelos sorotipos na ordem 4-3-2-1 unidos por linker de 5 glicinas. Na região C terminal adicionou-se cauda de hexa-histidina com o intuito de facilitar a purificação. O ELISA para detecção de IgG, apresentou uma sensibilidade geral de 71%, e especificidade de 100% para soros onde não havia sido determinado a fase e tipo de infecção. Houve diferença de sensibilidade dentre os sorotipos, que foi estimada em 91.6%, 86.6%, 75.0%, e 18,2% para os sorotipos de DENV-1-4, respectivamente. Não observou-se reação cruzada com soros positivos para Febre amarela, Rubéola e Sarampo. Na avaliação com soros pareados, o ELISA revelou uma sensibilidade maior na fase convalescente do que na aguda da doença, tanto para infecções primárias quanto secundárias. A sensibilidade geral para os dois perfis de infecções desconsiderando a fase da doença (aguda ou convalescente), revelou uma sensibilidade geral de 89% para as infecções primárias, e 96% para as infecções secundárias. Quanto à planta transplastômica, esta ainda apresenta um perfil de transformação heteroplásmico. Almeja-se a obtenção de uma planta homoplásmica que provavelmente será obtida através da seleção em meio seletivo. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT Currently Dengue occurs in more than 100 countries causing about 100 million cases of Dengue disease per year. Laboratory diagnosis is crucial, because of the similarity of symptoms confused with other diseases such as Yellow Fever, Measles, Rubella and Influenza. Serological techniques as ELISA are widely used for the diagnosis; however, due to the use of crude extract as the viral antigen source, problems may occur as cross-reactions, variation in quality and high production costs. Aiming to decrease these problems with conventional ELISA kits, recombinant viral antigens have been produced and used in diagnostic kits. In this study lettuce transplastomic system was used to produce a recombinant tetra-epitope antigen, which allowed the use of crude protein extract from chloroplasts, without purification, for serological detection of IgG antibodies against the four Dengue serotypes. The tetra-epitope antigen developed, comprising the epitope region of position 34-57 amino acid, which is located between domains I / II of the virus envelope protein. The antigen is composed of serotypes in the following order 4-3-2-1 joined by 5 glycines linkers. In the C terminal region, a hexa-histidine tail was added for purification. The ELISA for detection of IgG in patients’ sera, showed an overall sensitivity of 71% and specificity of 100% using sera which had not been determined the phase and type of infection. There was a difference in sensitivity between the serotypes that was estimated around 91.6%, 86.6%, 75.0%, and 18,2%, for DENV 1-4 serotypes, respectively. No cross-reaction was observed with positive sera for Yellow Fever, Rubella and Measles. In evaluation with paired sera, the ELISA showed greater sensitivity in convalescent than in acute phase of disease development for both, primary and secondary infections. The overall sensitivity for the two profiles infections not considering the disease phase (acute or convalescent), revealed 89% for primary infections, and 96% for secondary infections. As for the transplastomic plant, it still has a heteroplasmic transformation profile. Probably the homoplasmic plant may be obtained by selection on selective medium.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2013 O intestino possui uma grande diversidade microbiana e parte desta é responsável por estimular os anticorpos os do Sistema ABO. Pacientes que possuem anticorpos anti-ABO no plasma podem apresentar uma diminuição da concentração plaquetária após a transfusão de plaquetas ABO não compatível, assim como hemólise de eritrócitos (incompatibilidade menor). Essa atividade hemolítica pode ser detectada através da titulação de anticorpos ABO ou através de testes de hemólise (Pesquisa de Hemolisina). Há inúmeros relatos de reações transfusionais ocasionadas por transfusões de hemocomponentes não isogrupo, destacando-se um que apontou como provável causa do aumento de títulos de anticorpos anti-ABO o uso de cápsulas de probióticos pelo doador. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi realizar um estudo clínico para avaliar o efeito do consumo de iogurte probiótico sobre os títulos de anticorpos contra antígenos ABO de voluntários correlacionando-os com a concentração fecal de bifidobactérias. Participaram do estudo 126 voluntários que consumiram diariamente uma unidade de iogurte contendo Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis pelo período de 30 dias.Antes e após o consumo do probiótico foram analisados os títulos de anticorpos anti-ABO, os resultados da Pesquisa de Hemolisina ABO, o pH e a concentração de bifidobactérias fecais.Entre os voluntários foi observada a frequência dos fenótipos ABO na proporção de 45% (57) do Grupo A, 9% (11) do Grupo B e 46% (58) do Grupo O. O percentual de amostras consideradas com altos títulos de anticorpos ABO em temperatura ambiente (TA) e em presença de antiglobulina humana (AGH) foi de 32,5% e 40,5% respectivamente, antes do consumo do iogurte. Após o consumo do probiótico os títulos aumentaram para 34,9% e 50,8%, respectivamente. Após o consumo do iogurte foi observada relação significativa entre a idade dos voluntários e o título de anticorpos Anti-B somente em TA, sendo que não houve relação significativa com anticorpos Anti-A. Os resultados sugerem que o uso de probióticos por indivíduos com mais de 40 anos pode manter elevado o título de anticorpos ABO.Após o consumo do iogurte contendo Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis evidenciou-se que os títulos Anti-B em TA reduziram e os títulos de Anti-A em AGH aumentaram significativamente.Também foi observada relação significativa entre a quantidade de bifidobactérias e o título de anticorpos Anti-B em AGH após o consumo de probióticos.No entanto,não foi evidenciada relação significativa entre a quantidade de bifidobactérias e o pH fecal antes ou após o consumo do probiótico. Evidenciamos que 65,1% das amostras não apresentaram alteração nos resultados de hemolisina, 29,4% passaram a ser consideradas Hemolisina Positiva e 5,6% passaram ser consideradas Hemolisina Negativa após o consumo de probióticos. Nossos resultados sugerem que a mudança alimentar da sociedade (como o aumento no consumo de produtos probióticos) possa influenciar na frequência de altos títulos de anticorpos contra antígenos do Sistema ABO. Assim, consequentemente, pode ocorrer uma diminuição dos hemocomponentes disponíveis para transfusão não isogrupo nas instituições hemoterápicas. Abstract: Intestine has a large microbial diversity that is responsible for stimulates antibodies against ABO system. Patients with plasmatic ABO antibodies may exhibit a decreased platelet concentration after platelet transfusion ABO-mismatched, as well as hemolysis of erythrocytes (ABO-minormismatch). This hemolytic activity can be detected by titration of ABO antibodies or by hemolysis test (Hemolysin Test). There are numerous reports of transfusion reactions caused by transfusions of blood products ABO-mismatched. One study pointed out the probable cause of increased titer of ABO antibodies after use of probiotics capsules of by the donor. In this context, the aim of this study was to perform a clinical study to evaluate the effect of probiotic yoghurt consumption on antibody titers against ABO antigens correlating them with fecal bifidobacteria. The study included 126 volunteers who consumed a daily unit of yoghurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis for 30 days. Before and after probiotic consumption it were analyzed the titers of anti-ABO, the results of ABO hemolysin, fecal pH and concentration of bifidobacteria. Among volunteers, it was observed the frequency of ABO phenotype of 45% (57) from A Group, 9% (11) of B Group and 46% (58) of O Group. The percentage of samples considered with high titers of antibodies ABO at ambient temperature (AT) and in presence of human antiglobulin (AGH) was 32.5% and 40.5%, respectively, before the consumption of yoghurt. After consumption of probiotic the titers increased to 34.9% and 50.8%, respectively. After consumption of yoghurt it was observed a significant association between the age of volunteers and the titer of Anti-B antibodies only in TA, and there was no significant relationship with Anti-A antibodies. The results suggest that the use of probiotics for individuals over than 40 years old can maintain a high antibody titer ABO. After consumption of yoghurt containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis it was observed that the titers of Anti-B in TA reduced and Anti-A titers in AGH increased significantly. Was also a significant association between the amount of bifidobacteria and the titer of Anti-B antibodies at AGH after consumption of probiotics. However, no correlation was observed between the amount of fecal bifidobacteria and pH before or after consumption of probiotic. It was demonstrated that 65.1% of the samples had no change in the results of hemolysin, 29.4% became considered Hemolysin Positive and 5.6% became Hemolysin Negative after consumption of probiotics. Our findings suggest that the dietary change of society (such as the increase in the consumption of probiotics) may influence the frequency of high titers of antibodies against antigens of ABO system. So, consequently, there may be a decrease in blood components available for isogroup transfusion at institutions of hemotherapy.

B-cell maturation occurs in several steps and requires constant stimulus for its continuing development. From the emergence of the pre-B-cell receptor, signal transduction stimulates and supports B-cell development. Current viewpoints indicate that both positive selection pressure for autoantigens and tonic signaling constitutively stimulate B-cell maturation. In this work, we tested for the presence of a putative DNA binding site in a variable gene segment in a germline configuration, independently of VDJ recombination. After a survey of the public antibody databases, we chose a single mouse heavy variable gene segment that is highly represented in anti-nucleic acid antibodies and tested it for ssDNA binding. A phage display approach was used to search for intrinsic binding to oligo deoxythymidine. The results revealed that binding to an antigen can be influenced by the use of a specific DNA binding V[Formula: see text] gene segment. Our data support the idea that some variable genes have intrinsic reactivity towards specific types of endogenous autoantigens, and this property may contribute to the establishment of the immature B-cell repertoire.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. A primeira microepidemia pelo Trypanosoma cruzi na Amazônia brasileira foi publicada em 1969 e, desde então, outras têm sido observadas em famílias residentes em vários municípios dos Estados daquela região. Em 2007 e 2009 foram identificados casos clínicos de doença de Chagas aguda (DCA) em famílias dos municípios de Barcarena e Breves, Estado do Pará. Este estudo mostrou anticorpos da classe IgG contra antígenos do T. cruzi em 35,7% (39/109) das pessoas, sendo 29,5% (13/44), 26,6% (4/15), 20,6% (6/29), respectivamente, das famílias A, B, e C residentes no município de Barcarena, e em 76,1% (16/21) da família D do município de Breves; em 66,6% (14/21) dos casos dessa família foram identificados anticorpos IgM anti-T. cruzi. Os resultados de PCR com iniciadores de nDNA do parasito foram positivos em 76,1% (83/109) dos casos: Família A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8% e D, 57,1%. De grande interesse, em 21 casos de DCA o exame parasitológico positivo foi convalidado pela PCR com iniciadores de nDNA de T. cruzi. Ademais, nas células germinativas do sêmen foi confirmada infecção ativa pelo T. cruzi, também presente nas células somáticas do sangue, pela PCR com iniciadores específicos de nDNA e kDNA. Adicionalmente, 16,5% (18/109) casos positivos apenas para kDNA, sem a infecção ativa, retiveram seqüências de minicírculos integradas no genoma. Nesses 18 casos as mutações de kDNA foram transferidas para as progênies pela reprodução sexuada. Com esse respeito, a diferença de 53% (44/83) entre os resultados obtidos pela PCR para nDNA e aqueles dos testes imunológicos contra antígenos de T. cruzi tem importância epidemiólogica ainda não apreciada em outra investigação. Pois, a presença de nDNA e kDNA foi encontrada na ausência de anticorpos contra antígenos de T. cruzi nos hospedeiros tolerantes aos antígenos do parasito. Ademais, em todos esses casos de infecção ativa também ocorreu transferência vertical de seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada e as mutações foram prontamente identificadas no genoma humano. Então, a larga diferença entre os resultados de testes imunológicos e de PCR pode ser explicada pela aquisição da infecção via sexual ou transplacentária, durante a fecundação ou na fase inicial da gestação, antes do desenvolvimento do sistema imune do embrião, e o indivíduo nasce tolerante aos antígenos de T. cruzi. As mutações de kDNA foram identificadas nos cromossomos, e o principal sítio de integração foi retrotransposon LINE-1 em 70% (301/430) das quimeras identificadas. Em 83,3% (50/60) dos casos as mutações ocorreram no gene do receptor olfatório OR1-17, e em apenas 16,6% (10/60) foram encontradas em genes com outras funções reconhecidas. O achado mais relevante neste estudo foi a documentação de transmissão do kDNA e do nDNA do T. cruzi pela reprodução sexuada. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT By 1969, a microepidemic of Trypanosoma cruzi was recognized in the Brazilian Amazonia, and lately they have been constantly reported in families from several counties in the region. By 2007 and 2009, clinical cases of acute Chagas disease were identified in families living in counties of Barcarena and Breves, Estado do Pará. The exams revealed IgG antibodyes against T. cruzi antígens in 35,7% (39/109) cases of the study population: Family A, 29,5% (13/44); B, 26,6% (4/15); C, 20,6% (6/29) of Barcarena county, and Family D, 76,1% (16/21) of Breves; Anti-T. cruzi IgM antibody was identified in 66,6% (14/21) of family D cases. The PCR assays with specific nDNA primer sets yielded positive results in 76,1% (83/109) cases: Family A, 77,2%; B, 100%; C, 75,8%; and D, 57,1%. Of interest, 21 cases showing symptoms of acute Chagas disease had parasitologic demonstration of T. cruzi and these were convalidated by the PCR assays with nDNA primer sets. Moreover, germline cells from male gametes showed T. cruzi nDNA and kDNA as well as somatic mononuclear cells from blood. Additionally, 16,5% (18/109) of kDNA positive cases in absence of active infection retained the minicircle sequences in the genome. In these cases the kDNA mutations were vertically transfered to progenie by sexual reproduction. With this respect, the reported differences 53% (44/83) between results of antibody assays and those obtained by PCR with primer sets to T. cruzi nDNA have broad epidemiologic importance not yet reported by previous investigation. The presence of nDNA and kDNA was documented in the absence of antibody against T. cruzi antigens in hosts’ immue tolerant to the parasite antigens. Furthermore, vertical transfer of T. cruzi minicircle occurs by sexual reproduction in every case nDNA and kDNA are present in the course of an active infection. Insofar, the reported differences herein can be explained by the acquisition of the infection during fecundation or in the early gestational period, via sexual transmissão or transplacenta from mother to offspring before embryo immune system development; and the newborn becomes tolerant to T. cruzi antigens. The kDNA mutations were identified in several chromosomes, and the main integration hotspot was LINE-1 in 70% (301/430) cases. The mutations entered at the olfactory ORI-17 gene in (50/60) cases (83,3%) and in (10/60) cases (16,6%) they were found in genes with annotated functions. A highly relevant finding in this study was the documentation of transmission of kDNA, and of nDNA from T. cruzi active infection by sexual reproduction.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. O conhecimento sobre as intera cções moleculares entre anticorpos com a nidade a acidos nucl eicos e seus alvos ainda e muito limitado. Trabalhos anteriores do grupo de Imunologia Molecular da Universidade de Bras lia de busca em bancos de dados apon- tavam para uma prov avel tendência de reconhecimento de acidos nucl eicos dos anticorpos pertencentes a fam lia murina de imunoglobulina de cadeia vari avel pesada dez, ou VH10. Portanto, para melhor entender esse comportamento, decidiu-se analisar bibliotecas de regiões determinantes de complementaridade tr^es de cadeia pesada, CDR H3, em contextos das fam lias murinas VH10 e VH4, antes e ap os essas bibliotecas terem sido selecionadas contra DNA ta simples. Desta forma, procurou-se compreender o comportamento dessas duas fam lias e de certos determinantes da CDR H3 no reconhecimento de anticorpos a DNA. As bibliotecas de estudo foram submetidas a seq uenciamento de alto-desempenho, utilizando-se a metodologia Illumina, e foram ent~ao analisadas por meio de um pipeline de Bioinform atica. Esse pipeline consistiu na prepara c~ao das seq uências FASTQ recebidas e na an alise posterior, sendo esta ultima composta por estudos de variabilidade das bibliotecas, enriquecimento de seq uências ap os a sele ção contra DNA, divergência de Kullback-Leibler, compara ção de padrões e composi ção da CDR H3. A an alise revelou que a os padrões de seq uências selecionadas positivamente e negativamente são muito semelhantes em VH10, e que este arcabou co e menos estringente que VH4 em relação a exigir seq uências de CDR H3 mais espec cas a DNA. Portanto, concluiu-se que a fam lia VH10 apresenta tendência intr nseca a forma c~ao de anticorpos anti-DNA, o que não ocorre com a fam lia VH4. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT We still possess very little knowledge of the molecular interaction between anti-nucleic acids and their targets. Previous research in databases made by the Molecular Immunology group of the University of Brasilia has indicated a probable tendency of nucleic acids' recognition of the antibodies of the murine heavy chain immunoglobulin family ten, VH10. Therefore, to better understand this behaviour, we analysed libraries of heavy chain complementarity determinig region three, CDR H3, in the context of the murine families VH10 and VH4, before and after these libraries have been selected against DNA single strand. In this manner, we sought to understand the behaviour of these families and of certain CDR H3 features in the antibody's recognition of DNA. The libraries were submitted to deep-sequencing Illumina platform and then analysed by a Bioinformatics pipeline. The pipeline was comprised in the preparation of the FASTQ Illumina sequences and in an afterwards analysis, which consisted in studies of library variability, sequence enrichment, Kullback-Leibler divergence, pattern comparison and CDR H3 composition. Analysis revealed that the patterns of the positive and negative selected groups are similar in VH10 and that this framework is more stringent than VH4 in demanding CDR H3 sequences that are more DNA-speci c. Therefore, it was concluded that the VH10 family presents an intrinsic tendency to form anti-DNA antibodies, which does not occur with the VH4 family.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde. As Hepatites virais são doenças causadas por diferentes agentes etiológicos, que possuem distribuição universal e têm em comum o hepatotropismo. Em todo mundo, as hepatites A e B continuam a ser um grande problema de saúde pública. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que 170 milhões de pessoas estejam infectadas com o vírus da hepatite C (HCV) e que 300 milhões vivam com o vírus da hepatite B (HBV). O vírus da hepatite B está classificado na família Hepadnavirus, contém características como o tropismo pelas células hepáticas e material genético constituído por uma molécula de DNA com fita parcialmente dupla. O diagnóstico de qualquer uma das formas clínicas da Hepatite B realiza-se através de técnicas sorológicas. Tais técnicas revelam-se fundamentais não apenas para o diagnóstico, mas também mostram-se muito úteis no acompanhamento da infecção viral, na avaliação do estado clínico do paciente e na utilização de terapêutica específica. As importantes descobertas realizadas nas áreas da virologia e da biologia molecular desses vírus, nos últimos anos, foram progressivamente sendo incorporados à rotina diária dos laboratórios de patologia clínica, permitindo aos profissionais da área de saúde acesso às modernas técnicas capazes de avaliar a carga viral presente no indivíduo, o índice de replicação do agente infeccioso e a eficácia de novas medicações utilizadas no tratamento dessa virose. O HBsAg é uma glicoproteína antigênica exposta na superfície do envelope do HBV cuja presença no soro do paciente indica uma infecção ativa . Capaz de ativar uma resposta imunológica, o HBsAg é utilizado na confecção de vacinas e Kits diagnósticos. Este trabalho descreve a construção de um baculovírus recombinante contendo o gene do antígeno HBsAg de HBV fusionado ao gene da poliedrina do Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). O vírus reecombinante foi usado para infectar células de insetos e insetos e sua expressão analisada por SDS-PAGE. A proteina recombinante foi expressa em grande quantidade, purificada por centrifugação em gradiente de sacarose e usada como antígeno em um teste de diagnóstico comumente utilizado em latoratórios clínicos. A proteina recombinante foi reconhecida pelo soro de pacientes infectados pelo HBV e desta forma, possui potencial para ser usada em testes de diagnóstico dessa importante doença viral humana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Viral hepatitis are diseases caused by different etiologic agents, that have worldwide distribution and have in common hepatotropism. Worldwide, hepatitis A and B remains a major public health problem . The World Health Organization (WHO) estimates that 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV) and 300 million are living with hepatitis B virus (HBV). Hepatitis B is classified in the Hepadnavirus family, contains commun features such as tropism for liver cells and its genetic material consists of a partial double stranded DNA molecule. The diagnosis of a clinical form of hepatitis B is carried out by serological techniques. These techniques are not only important for diagnosis but are also very useful in monitoring viral infection, in assessing the patient's clinical status and in the use of specific therapy. Important developments derived from research in virology and molecular biology of these viruses in recent years, have gradually been incorporated into the daily routine of clinical pathology laboratories, allowing healthcare professionals to access modern techniques to evaluate the viral load present the individual, the replication of the infectious agent and effectiveness of new medications used to treat this viral infection. HBsAg is a glycoprotein antigen exposed on the surface of the envelope of HBV, whose presence in the serum of the patient indicates an active infection. HBSAg is able to activate a human immune response and is used in the production of vaccines and diagnostic kits. This work shows the construction of a recombinant baculovirus containing the HBsAg gene (from HBV) fused to the polyhedrin gene of the Autographa californica multicapsid Nucleopolyhedrovirus virus (AcMNPV). The recombinant virus was used to infect insect cells and insects and the expression of the recombinant protein was analysed by SDS-PAGE. The recombinant protein was highly expressed, purified by sucrose gradient centrifugation, and used as antigen in a diagnostic test commonly used in clinical laboratories m(ELISA). The recombinant protein was shown to be recognized by serum of HBV-infected patients and therefore, have the potential to be used in diagnosis of this important human viral disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. Nos últimos 20 anos a utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) para fins terapêuticos vêm revolucionando o tratamento de diversas enfermidades. Desde a aprovação pelo FDA (Food and Drug Administration USA), em 1986, do anticorpo murino anti-CD3, Orthoclone OKT3 o mercado de anticorpos monoclonais vem crescendo a passos largos. Esse trabalho teve como objetivo o melhoramento do anticorpo OKT3 humanizado utilizando a técnica de domain shuffling. Para tanto scFvs contendo a região codante da cadeia variável pesada humanizada foram obtidos variando-se os genes de cadeias leves, clonadas a partir de uma biblioteca humana. Esses scFvs foram produzidos na forma de partículas virais de fusão para serem utilizados em procedimentos de seleção de acordo com a técnica de phage display. Para dar início a seleção de partículas virais ligantes, foi necessária a expressão e purificação do antígeno CD3 recombinante em E. coli. Esse antígeno foi expresso na fração citoplasmática solúvel de células da linhagem BL21. Foi realizada a purificação e constatou-se a manutenção das características antigênicas do CD3 por imunoensaio com anticorpos anti-CD3 comerciais ou recombinantes. Em seguida, averiguou-se se os fagos selecionados eram capazes de se ligar ao antígeno e a quais ciclos de seleção eles pertenciam. Concluiu-se com o presente trabalho que o procedimento de seleção de anticorpos na forma de scFv pela estratégia de shuffling de cadeia aliada à técnica de Phage Display foi eficaz em selecionar clones com capacidade de ligação ao antígeno recombinante. Esse trabalho aponta para a validação dos anticorpos obtidos em comparação com os anticorpos comerciais (OKT3 e UCHT). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT In the last 20 years the use of monoclonal antibodies (mAbs) for therapeutic purposes are revolutionizing the treatment of various diseases. Since the approval by the FDA (Food and Drug Administration - USA) in 1986, the murine anti-CD3 antibody, Orthoclone OKT3, monoclonal antibodies market is scaling up. This work aimed the improvement of a humanized OKT3 antibody using the technique of domain shuffling. The strategy chosen was keeping constant the anti-CD3 humanized heavy chain coding region combined with light chains genes, cloned from a human Fab library. These scFvs were fused to filamentous phage gene protein III. These fusion virions were used in selection procedures as stated by Phage Display technique. To proceed the selection we first expressed and purificated the CD3 recombinant antigen in E. coli. This antigen was recovered from the soluble cytoplasmatic fraction of E. coli strain BL21cells. Purification was carried out by metal affinity chromatography, and the recombinant protein antigenic features were assessed by immunoassay using comercial or recombinant anti-CD3 antibodies. The selection procedure was performed in four selection rounds, and the selected phages were screened by their ability of antigen recognition. The bound phages were found predominantly among those from round four (86 % of the assayed phage clones). In conclusion, this work was able to select new anti-CD3 antibodies and these new molecules must now be further charicterized to validate them in comparison with commercial antibodies (OKT3 and UCHT) and as a second generation of biopharmaceuticals.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. O desenvolvimento de novos anticorpos recombinantes teve impacto significativo no tratamento de diversas doenças. Contudo, devido a complexidade estrutural da molécula de imunoglobulina, a produção desta em células de mamífero ainda é um desafio. Uma das dificuldades é obter uma produção equimolar das cadeias pesada e leve para a prevenção do acúmulo de cadeias não-montadas, seguido de apoptose por estresse. Em nosso grupo, vimos trabalhando com um anticorpo com potencial imunoregulatório específico para o antígeno CD3 humano. Anticorpos anti-CD3 têm sido utilizados como imunoterápicos na prevenção da rejeição aguda de órgãos transplantados e é considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. A produção desse anticorpo em cultura de células animais tem se mostrado limitante devido ao baixo rendimento de anticorpo recombinante. Na tentativa de desenvolver estratégias alternativas para aprodução de anticorpo recombinante, foram construídos vetores de expressão, onde o anticorpo inteiro é produzido a partir de construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônica em células de mamíferos. As versões monocistrônicas possuem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina entre as duas cadeias do anticorpo. A versão bicistrônica possui um elemento IRES sintético entre as duas cadeias. Além disso, foi introduzida uma marca seletiva para o antibiótico Geneticina associada ao mesmo cassete de expressão como um cístron extra guiado por outro elemento IRES. Para produção do anticorpo anti-CD3 foram utilizadas as linhagens celulares HEK293 e BHK-21, de forma transiente e estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados para a produção de imunoglobulina intacta. Os resultados indicam que a construção bicistrônica pMACIA HIL e monocistrônica pMACIA HL são capazes de garantir a expressão de ambas as cadeias de anticorpo. Já as construções monocistrônica pMACIA LH e bicistrônica pMACIA HL IRES neo não foram capazes de produzir o anticorpo recombinante. A construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo foi a construção que se mostrou mais promissora, apresentando estabilidade de produção do anticorpo em transfectomas estáveis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT The development of new pharmaceuticals derived from recombinant antibodies had a significant impact in the treatment of various illnesses. However, due to the structural complexity of the immunoglobulin molecule, the production of these molecules in mammal cells is still challenging. One of the difficulties is the equimolar production of heavy and light chains and the prevention of the stress induced by the accumulation of unassembled protein. We are working with a potentially immunoregulatory recombinant humanized antibody specific for the human CD3 antigen. Anti-CD3 antibodioes have been used in the prevention of the acute graft rejection and are considered as a promising pharmaceutical for the treatment of autoimmune diseases. The production of this antibody in culture of animal cells has shown to be problematic due to the low yield of recombinant antibody recovery. In the attempt to create alternative strategies for recombinant production of antibody, monocistronic, bicistronic and tricistronic expression vectors were constructed to coordinate the expression of a complete antibody in mammal cells. The monocistronic versions possess a furin cleavage coding sequence between the both antibody chains. The bicistronic version possesses a synthetic IRES element between the two chains. A selective mark for the Geneticin antibiotic was introduced in the expression cassette as an extra cistron driven by another IRES element. The cell lines HEK293 and BHK-21 were used for transient or stable production of the anti- CD3 antibody. Recombinant antibodies were purified by affinity chromatography and analyzed for the production of intact immuglobulin. The results indicate that the bicistronic construction pMACIA HIL and the monocistronic construction pMACIA HL are capable to express both antibody chains. On the other hand, the monocistronic construction pMACIA LH or the bicistronic construction pMACIA HL IRES neo were not able to produce the recombinant antibody. The tricistronic vector pMACIA HIL IRES neo was shown to be the most promising construction to obtain the whole antibody production in stable transfectomes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. O anticorpo anti-CD3 tem sido utilizado como imunoterápico na prevenção da rejeição a órgãos transplantados e considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. Entretanto, o único anticorpo anti-CD3 utilizado para uso clínico aprovado pelo FDA, o OKT3, possui origem murina o que gera uma resposta imunogênica quando administrado, impossibilitando uma utilização prolongada e, assim, diminuindo sua eficácia. Uma técnica que vem ao encontro da solução desse problema é a humanização de anticorpos, que por meio de manipulações gênicas propicia um aspecto “mais humano” a essa molécula, atenuando a resposta imunogênica desencadeada. Nesse sentido, foi avaliada a atividade ligante e a função efetora de duas versões humanizadas do anticorpo anti-CD3 apresentando o resíduo murino treonina (T) ou o resíduo humano arginina (R) na posição 86 da cadeia variável pesada. Posição essa, considerada importante estruturalmente. Para expresão dos anticorpos humanizados foram construídos vetores de expressão dicistrônicos, os quais foram utilizados para produção das imunoglobulinas em células de mamíferos da linhagem CHO, de forma estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade para posterior análise da atividade ligante e da função efetora. Os resultados indicam que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos. Contudo, são incapazes de bloquear completamente a ligação do anticorpo murino OKT3 à superfície de linfócitos, em ensaios de competição. Em conjunto com análises estruturais, esses dados indicam uma perda de afinidade das versões humanizadas provavelmente devido à substituição de resíduos importantes estruturalmente na cadeia leve humanizada. As versões humanizadas também apresentam uma capacidade mitogênica menor que a apresentada pelo OKT3, corroborando a perda de afinidade desses anticorpos. Esses dados sugerem que os anticorpos humanizados são capazes de se ligar ao CD3 na superfície de linfócitos, mas o processo de humanização levou a uma diminuição da afinidade original desses anticorpos. Nesse sentido, para se restabelecer a atividade ligante dos anticorpos recombinantes sugerimos a realização de algumas mutações específicas para com isso avaliar o seu futuro uso clínico. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT Anti-CD3 antibodies have been used for the prevention of organ allograft rejection and are also considered a promising immunotherapic for autoimmune diseases treatment. Currently, there is only one anti-CD3 antibody approved by FDA for clinical use, the OKT3. Unfortunately, due to its murine origin, it promotes an immunogenic reaction when administrated, limiting its long-term use and reducing the treatment effectiveness. To solve this problem we have proposed humanized versions of this anti-CD3 to avoid its immunogenic properties. In this work was evaluated the binding activity and effector function of two humanized anti-CD3 antibodies. The first one has the murine residue threonine (T) 86 VH position while the second version shows the human residue arginine (R) at position 86 in VH. Modeling analysis indicated that this position is structurally important. To express the recombinant antibodies we constructed a dicistronic expression vector and produced the immunoglobulins in CHO cell lines. To analyze the binding activity and effector function, the recombinant proteins were previously purified by affinity chromatography. The results show that humanized antibodies were able to binding to the human CD3 on the T lymphocyte surface. However, they weren’t able to completely block OKT3 binding to T lymphocyte surface on competitive assays. Along with structural analysis, this data indicate an affinity loss of humanized versions probably due the substitution of important residues on humanized VL. The humanized versions also presented a less mitogenic activity than that observed by OKT3, corroborating the affinity loss of these antibodies. These data suggest that the humanized antibodies are able to bind to human CD3, but the humanization procedure caused a decrease on recombinant antibody affinity, compared with OKT3. To restore the binding activity of these antibodies specific mutations and back mutations must have to be taken in order to permit its future clinical use evaluation.

Orientador: Claudio Lucio Rossi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: O diagnóstico da toxoplasmose aguda adquirida é, freqüentemente, baseado na detecção de anticorpos específicos IgM anú-T.gondii e/ou elevação significativa dos títulos de anticorpos IgG. Entretanto, a elevada ocorrência de altos títulos de IgG anti-T. gondii em pessoas sadias e a persistência, em alguns casos, dos anticorpos IgM por muito tempo após infecção com o parasita pode dificultar a interpretação dos resultados dos testes sorológicos quando se suspeita de toxoplasmose aguda. Em nosso primeiro estudo, são apresentados os resultados da detecção de anticorpos específicos da classe IgA e da determinação da avidez dos anticorpos IgG em amostras seqüenciais de soros de um paciente apresentando níveis significativos de anticorpos IgM anú-T.gondii durante sete anos após o início dos sintomas clínicos da toxoplasmose. Os anticorpos IgA foram quantificados por uma técnica de ELISA de captura (ETI-TOXOK-A). O paciente ainda apresentou um resultado positivo (>10 UA/ml) em uma amostra de soro coletada dois anos após o inicio das manifestações clínicas. A avidez dos anticorpos IgG foi determinada com o sistema Falcon assay screening test (F.A.S.T.®) - ELISA, utilizando somente uma diluição da amostra de soro. índices de avidez compatíveis com uma infecção aguda foram encontrados nas amostras de soros obtidas durante os cinco primeiros meses após o início dos sintomas clínicos. O objetivo do segundo estudo foi avaliar vários marcadores sorológicos para o diagnóstico da toxoplasmose aguda adquirida, tais como a detecção de anticorpos IgA e IgE anti-T. gondii, o teste de aglutinação diferencial (AC/HS) e os testes baseados na determinação da avidez dos anticorpos IgG. Foram testadas, num total de 64 amostras de soros, 31 amostras de soros de pacientes com infecção adquirida recentemente e 33 amostras de soros de pacientes com infecção crônica. Os anticorpos IgA foram quantificados por meio de dois "kits" de ELISA de captura (Platelia® Toxo-IgA e ETI-TOXOK A) e um "kit" de ELISA automatizado (IMx Toxo-IgA). Níveis de anticorpos IgA compatíveis com infecção recente foram detectados em todas as amostras de soros dos pacientes com toxoplasmose aguda, com os três "kits". Por outro lado, a análise das amostras de soros dos 33 pacientes com toxoplasmose crônica mostrou que níveis significativos de anticorpos IgA podem ser detectados com alta freqüência durante a fase crônica da infecção, com os três "kits". Anticorpos IgE anti-T. gondii foram detectados, pela técnica de imunocaptura-aglutinação (ISAGA), em 26 (84%) dos 31 pacientes com toxoplasmose aguda e em duas amostras de soros de pacientes com toxoplasmose crônica coletadas mais de um ano após o início das manifestações clínicas. Vinte e nove (94%) dos 31 pacientes com infecção aguda e 15 (45%) dos 33 pacientes com infecção crônica apresentaram, no teste AC/HS, um padrão compatível com toxoplasmose aguda. A avidez dos anticorpos IgG anti-T. gondii foi determinada por dois métodos diferentes. Um dos métodos, utilizando o "kit" comercial Platelia Toxo-IgG, foi baseado na titulação de cada amostra de soro e cálculo dos títulos, com e sem o tratamento com uréia, em relação a um valor de "cut-off" definido. No outro método, utilizando o sistema F.A.S.T.- ELISA, foi feita apenas uma única diluição da amostra de soro, e foram comparadas as absorbâncias das reações na presença e ausência de uréia. Todas as 31 amostras de soros de pacientes com infecção aguda apresentaram índices compatíveis com toxoplasmose aguda pelo método de titulação, ao passo que, com o método de diluição única, 4 destas amostras apresentaram resultados duvidosos, mostrando que o método de titulação das amostras foi mais sensível para o diagnóstico de infecção recente. Resultados semelhantes foram obtidos no grupo de 33 pacientes com toxoplasmose crônica pelos dois métodos; apenas uma amostra de soro apresentou um índice de avidez não compatível com a fase crônica, pelo método de titulação. Os resultados obtidos no presente estudo mostraram que os marcadores sorológicos, atualmente utilizados para o diagnóstico da toxoplasmose aguda adquirida, possuem limitações significativas. Nossos dados sugerem que a determinação da avidez dos anticorpos IgG anti-Z gondii, principalmente pelo método de titulação das amostras de soros, pode ser bastante útil para um diagnóstico mais confiável do estágio em que se encontra a infecção, nos pacientes que apresentam níveis significativos de anticorpos IgM. Abstract: The diagnosis of acute acquired toxoplasmosis has been frequently based on the detection of specific IgM antibodies and on the demonstration of a significant increase in specific IgG antibodies titers. However, the prevalence of high Toxoplasma IgG antibody titers among normal subjects and the sustained persistence, in some persons, of specific IgM antibodies have complicated the interpretation of serological tests when acute toxoplasmosis is suspected. In our first study, we report the detection of specific IgA antibodies and the determination of the avidity of Toxoplasma-specific IgG in sequential serum samples from a patient exhibiting significant levels of specific IgM antibodies for seven years after the onset of the clinical symptoms of toxoplasmosis. Anti-T.gondii IgA was quantified by an antibody capture ELISA (ETI-TOXOK-A). The patient still had a positive IgA result (> 10 AU/ml) in a serum sample taken two years after the beginning of the clinical manifestations. The IgG avidity was determined by a single serum dilution method, using the Falcon assay screening test (F.A.S.T.®) - ELISA system. Avidity indices compatible with an acute infection were found only in serum samples taken during the first five months after the onset of the clinical symptoms. The purpose of the second study was to assess the usefulness of newer serological markers, such as the detection of specific IgA and IgE antibodies, the differential agglutination (AC/HS) test using formalin and acetone-fixed tachyzoites of T. gondii and the determination of the avidity of Toxoplasma-specific IgG, in the diagnosis of acute acquired toxoplasmosis. Sixty-four serum samples, 31 from patients with a recently acquired Toxoplasma infection and 33 from patients with chronic toxoplasmosis, were tested. Anti-Z gondii IgA was measured by two antibody capture ELISA tests (ETI-TOXOK-A and Platelia® Toxo IgA) and an automated direct ELISA (IMx® Toxo IgA). The three kits detected antibody levels compatible with a recent infection in serum samples of all patients with acute toxoplasmosis. On the other hand, the analysis of serum samples from 33 patients with chronic toxoplasmosis revealed that significant levels of IgA may be detected with a high frequency by the three kits during the chronic phase of infection. IgE antibodies detected by ISAGA were present in 26 (84%) of 31 patients with acute toxoplasmosis and in serum samples from two subjects with chronic infection taken more than one year after the beginning of the clinical symptoms of infection. Twenty-nine (94%) of 31 patients with a recent Toxoplasma infection and 15 (45%) of 33 subjects with chronic toxoplasmosis had an AC/HS pattern compatible with acute toxoplasmosis. The avidity of Toxoplasma IgG was evaluated by two methods. One method was based on titration of each serum sample and calculation of the titers, in the absence and presence of urea, in relation to a defined cut-off value. In the other method, a single serum dilution was used and the absorbances of the reactions in the presence and absence of urea were compared. The titration method was more sensitive for diagnosing a recent primary Toxoplasma infection: All 31 serum samples from patients with acute toxoplasmosis had avidity indices compatible with acute toxoplasmosis by the titration method whereas with the single dilution method serum samples from four patients had equivocal results. In the 33 patients with chronic toxoplasmosis, similar results were obtained with the two avidity methods; only one serum sample had a non compatible avidity value with the titration method. The results obtained in the present study show that the current serological markers used for diagnosing acute acquired toxoplasmosis have significant limitations. Our data suggest that the determination of the avidity of Toxoplasma-specific IgG, mainly by the titration method, in patients with detectable IgM antibodies could permit a more efficient diagnosis of the stage of infection by T gondii. Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Claudio Lucio Rossi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A cisticercose é considerada um importante problema de saúde pública em países da Ásia, África e América Latina. Na América Latina, freqüências elevadas desta doença têm sido registradas no México, Peru, Chile e Brasil. A doença é causada pela infecção com o estágio larval (Cysticercus cellulosae) do parasita Taenia solium. Isto ocorre através da ingestão de alimentos contaminados por fezes, contendo ovos de T. solium, de auto-infecção fecal-oral ou de auto-infecção por peristalse reversa. A forma embrionária do parasita penetra a mucosa intestinal, cai na corrente sangüínea, migrando, principalmente, para músculo esquelético, tecido subcutâneo, olhos e sistema nervoso central (SNC). Quando os cisticercos estão presentes no SNC (neurocisticercose), dependendo do número, localização e estágio de desenvolvimento, podem causar sintomatologia extremamente severa. As manifestações clínicas da neurocisticercose são variadas e inespecíficas. Assim, o diagnóstico definitivo deve ser sempre considerado em um contexto epidemiológico e confirmado por dados laboratoriais e de imagem. As técnicas de neuroimagem, tais como a tomografia computadorizada e a ressonância magnética nuclear, além de permitirem um diagnóstico mais preciso da neurocisticercose, têm contribuído para uma melhor compreensão dos processos patofisiológicos da infecção. Entretanto, devido ao seu alto custo, as técnicas de imagem são, praticamente, inacessíveis para países em desenvolvimento, onde a incidência da doença é bastante elevada. A pesquisa de anticorpos anti - C. cellulosae em amostras de líq~ido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com suspeita clínica de neurocisticercose tem sido muito utilizada para o diagnóstico da infecção. No presente estudo, é descrita uma técnica imunoenzimática (ELISA) quantitativa para o imunodiagnóstico da neurocisticercose. A técnica de ELISA foi padronizada usando uma fIação purificada (FPC I) de um extrato bruto de C. cellulosae, obtida por meio de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sephacel. Em um estudo comparativo, a técnica quantitativa de ELISA usando a fração FPC I (ELISA-FPC) e uma técnica de ELISA qualitativa padronizada com um extrato bruto de C. cellulosae (ELISA-EBCC) foram usadas para a pesquisa de anticorpos IgG anti - C. cellulosae em amostras de LCR de 57 pacientes com neurocisticercose e 50 pacientes com infecções heterólogas (neurosIfilis, neurotoxoplasmose, neurocriptococose, esc1erose múltipla e meningites bacteriana e viral). As duas técnicas de ELISA apresentaram sensibilidade de 95% , enquanto que as especificidades obtidas com as técnicas ELISA-FPC e ELISA-EBCC foram de 100% e 92%, respectivamente. O bom desempenho, em tennos de sensibilidade e especificidade, aliado ao baixo custo, indicam que a técnica ELISA-FPC pode ser de grande utilidade para o imunodiagnóstico da neurocisticercose Abstract: Cysticercosis is an important health problem in many Asia, Mrica and Latin America countries which have inadequate sanitary conditions, as well as in some industrialized nations with a high immigrant population from disease-endemic areas. In South America, high frequencies of this disease have been reported in Peru, Chile and Brazil. Cysticercosis is caused by infection with the larval form (cysticercus) of the tapeworm Taenia solium. The cysticerci may be located in areas where they produce no symptoms, such as musc1e or cutaneous tissues. On the other hand, the presence of cysticerci in the central nervous system (CNS), a condition known as neurocysticercosis, can cause seizures and other neurological problems. The clinical signs and symptoms of neurocysticercosis are variable and non-specific, leading to different neurological and psychiatric diagnoses. Thus, a definitive diagnosis of neurocysticercosis should always be considered in an epidemiological context and confirmed by laboratory and neuroimaging data. The methods used for diagnosing neurocysticercosis include neurOlmagmg techniques (computed tomography and nuclear magnetic resonance) and cerebrospinal fluid (CSF) ~alysis. Neuroimaging techniques have contributed to a more accurate diagnosis and a better understanding of the pathophysiology of neurocysticercosis. However, because of their high cost and restricted availability, these procedures may be of limited use in developing countries with high rates of infection. The detection of specific antibodies against Cysticercus cellulosae antigens in CSF samples from patients suspected of having neurocysticercosis is a useful tool for diagnosing the disease, especially when neuroimaging techniques are not available or inconclusive. In the present study, a quantitative '"oenzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the immunodiagnosis of neurocysticercosis is described. The ELISA was standardized using a purified C. cellulosae fraction (PCF I) obtained by ion exchange chromatography. The ELISA using PCF I (PCF-ELISA) and a a qualitative ELISA using a whole extract from C. cellulosae (WECC-ELISA) were used to screen for Cysticercusspecific IgG antibodies in cerebrospinal fluid (CSF) samples from 57 patients with neurocysticercosis and 50 patients with heterologous infections. The sensitivity of both assays was 95%, whereas the specificities of PCF-ELISA and WECC-ELISA were 100% and 92%, respectiveIy. The excellent sensitivity and specificity of the PCF-ELISA malce this assay a potentially useful tool in screening for antibodies against C. cellu/osae Mestrado Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Humberto de Araujo Rangel Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado

Orientador : Ivan Mota Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A imunização de camundongos usando-se a IgG de coelho como imunógeno e o hidróxido de alumínio como adjuvante não resultou em produção de anticorpos da classe IgE em nível detectável e a produção de anticorpos IgG IND.1' foi muito baixa. 2. A imunização, em idênticas condições, com os fragmentos Fab e Fc, induziu a produção de níveis detectáveis tanto de IgE quanto de 'IgG IND.1' capazes de reagirem não somente com o imunógeno original, Fab ou Fc, mas também com a molecula íntegra da IgG. 3. Embora a IgG, quando administrada em hidróxido de aluminio, nao se mostrasse um bom imunogeno, no tocante a produção de anticorpos homocitotrópicos, foi capaz, nas mesmas condições de imunização, de induzir a síntese de anticorpos aglútinantes da classe IgG.. 4. O uso de adjuvante completo de Freund potenciou a imunogenicidade da IgG, induzindo uma resposta anticorpos homocitotrópicos significantemente maior do de que aquela obtida com o hidróxido de alumínio, particularmente de anticorpos 'IgG IND.1'5. A não imunogenicidade da IgG, quando administrada em hidróxido de alumínio, em termos de anticorpos homocitotrópicos, não foi restrita a linhagem A/Sn, visto que as linhagens C57Bl/10J e Balb/c, nas mesmas condições de imunização, comportaram-se do mesmo modo. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Not informed. Mestrado Imunologia Mestre em Genética e Biologia Molecular