Search

Lymphatic vessels are an integral part of the immune system that defends us against bacteria and viruses. These vessels are a drainage system for returning interstitial tissue fluid and immune cells into the blood circulation. A dysfunctional lymphatic system causes swelling of tissues due to excess fluid, known as lymphedema. The primary factor that stimulates the growth of lymphatic vessels (lymphangiogenesis) is vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). Although this has been known since 1997, many mechanistic details of VEGF-C’s action have only been recently uncovered. VEGF-C needs to be activated by the removal of its C- and N-terminal propeptides before it can generate new vessels, and this activation requires the CCBE1 helper protein and one of several proteases. VEGF-C can be a drug target for diseases involving the lymphatics, such as lymphedema, cancer, and heart diseases. However, the main limitation is our incomplete understanding of the actual mechanisms of VEGF-C activation for developing a functional lymphatic vasculature. The primary aim of my studies has been to identify additional puzzle pieces in VEGF-C activation, which will prove instrumental in future attempts to therapeutically target VEGF-C. In study I, we have characterized the role of the individual domains of VEGF-C and CCBE1 in the activation of VEGF-C. Our study determined the crucial role of the C-terminal domain of VEGF-C for efficient VEGF-C activation. In addition, we established differential roles of C- and N-terminal domains of CCBE1 for VEGF-C activation. The N-terminal domain is essential for mobilizing VEGF-C to the endothelial cell surface to form the VEGF-C/ADAMTS3/CCBE1 cleavage complex, whereas the C-terminal domain aids ADAMTS3-mediated VEGF-C processing. We have also proposed a model of VEGF-C activation where VEGF-C can be activated when bound to VEGFR-3/HSPGs on the cell surface or to ECM as well as in the soluble phase. In study II, we discovered additional proteases activating VEGF-C. We identified both VEGF-C and VEGF-D as substrates for KLK3 and cathepsin D. The presence of KLK3, VEGF-C, and CCBE1 in sperm plasma suggested a role of KLK3-activated VEGF-C in reproduction. KLK3 and cathepsin D cleavage of VEGF-C and VEGF-D generated N-terminally different forms that varied in their affinities towards VEGFR-2 and VEGFR-3. Cathepsin D-cleaved VEGF-C was VEGFR-3 specific and lost its angiogenic properties, whereas cathepsin-D-activated VEGF-D was VEGFR-2 specific and lost its lymphangiogenic properties. Identification of novel VEGF-C activating proteases has opened ways to therapeutically target VEGF-C in reproduction and metastatic cancer besides lymphedema treatment. In study III, we described for the first time a method to produce biologically active VEGF-C from E. coli using a combination of redox-modified Origami strain and maltose binding protein (MBP) tag. There are no reports of successful attempts to produce active VEGF-C in E. coli without the need for refolding from inclusion bodies. Such bacterial VEGF-C could be a readily available cost- and time-effective source of VEGF-C for in vitro studies. In study IV, we analyzed the occurrence of PDGF/VEGF homologs in different animal clades. We identified Cnidaria as the simplest animals containing PDGF/VEGF-like proteins. Almost all cnidarian PDGF/VEGFs contain the BR3P repeat characteristic for the C-terminal domain of VEGF-C. This finding suggests a VEGF-C-like protein as the earliest PDGF/VEGF to emerge during evolution. Interestingly, we showed a complete absence of PlGF in Amphibia and VEGF-B in crocodiles and birds. In addition, the presence of VEGF-F was not limited to venomous reptiles but could also be found in non-venomous lizards and gekkos. Due to recent advancements in our understanding of the development of fish vasculature, we also analyzed the heterogeneity of PDGF/VEGF molecules in fishes, including verification of gene prediction with mRNA sequencing data. This study provides a basis for choosing appropriate animal models for vascular biology research. With these studies, we primarily advance the understanding of VEGF-C biology and thus lay the groundwork for developing VEGF-C into a therapeutic target for diseases involving the lymphatic system. Imusuonet ovat olennainen osa immuunijärjestelmää, joka suojaa meitä bakteereilta ja viruksilta. Nämä suonet keräävät interstitiaalisen kudosnesteen ja immuunisolut palauttaakseen ne takaisin verenkiertoon. Viallinen imusuonisto aiheuttaa kudosten turvotusta ylimääräisen nesteen vuoksi, mikä tunnetaan nimellä lymfedeema. Ensisijainen imusuonten kasvua (lymfangiogeneesiä) stimuloiva tekijä on verisuonten endoteelin kasvutekijä-C (VEGF-C). Ennen kuin VEGF-C voi luoda uusia suonia, se on aktivoitava poistamalla sen C- ja N-terminaaliset propeptidit, ja tämä aktivaatio vaatii CCBE1-auttajaproteiinin sekä yhden useista proteaaseista. VEGF-C voi olla lääkinnällinen kohde sairauksissa, jotka liittyvät imusuonistoon, kuten lymfedeema, syöpä ja sydänsairaudet. Suurin rajoitus liittyy kuitenkin epätäydelliseen ymmärrykseemme VEGF-C:n aktivaation todellisista mekanismeista toimivan imusuoniston kehittämiseksi. Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena oli tunnistaa lisää sellaisia palapelin palasia VEGF-C:n aktivaatiossa, jotka osoittautuisivat tärkeiksi tulevissa yrityksissä VEGF-C:n terapeuttisessa kohdistamisessa. Tutkimuksessa I on karakterisoitu VEGF-C:n ja CCBE1:n yksittäisten domeenien rooli VEGF-C:n aktivoinnissa. Tutkimus osoitti VEGF-C:n C-terminaalisen domeenin ratkaisevan roolin tehokkaassa VEGF-C-aktivaatiossa. Lisäksi selvitettiin CCBE1:n C- ja N-terminaalisten domeenien erilaiset roolit VEGF-C-aktivaatiossa. N-terminaalinen domeeni on välttämätön VEGF-C:n mobilisoimiseksi endoteelisolujen pintaan VEGF-C/ADAMTS3/CCBE1-kompleksin muodostamiseksi, kun taas C-terminaalinen domeeni auttaa ADAMTS3-välitteistä VEGF-C:n prosessointia. Tutkimuksessa on myös esitetty malli VEGF-C-aktivaatiosta, jossa VEGF-C voidaan aktivoida sekä solun pinnalla VEGFR-3/HSPG:eihin sitoutuneena, että liukoisena solunulkoisessa väliaineessa. Tutkimuksessa II havaittiin lisää proteaaseja, jotka aktivoivat VEGF-C:tä. Sekä VEGF-C että VEGF-D ovat substraatteja KLK3:lle ja katepsiini D:lle. KLK3:n, VEGF-C:n ja CCBE1:n läsnäolo siemenplasmassa viittasi KLK3-aktivoidun VEGF-C:n rooliin lisääntymisessä. KLK3 ja katepsiini D pilkkovat VEGF-C:n ja VEGF-D:n N-terminaaliset päät niin, että muodostuu N-terminaalisesti erilaisia muotoja, joiden affiniteetit vaihtelevat VEGFR-2:ta ja VEGFR-3:a kohtaan. Katepsiini D:llä pilkottu VEGF-C oli VEGFR-3-spesifinen ja menetti angiogeeniset ominaisuutensa, kun taas katepsiini-D-aktivoitu VEGF-D oli VEGFR-2-spesifinen ja menetti lymfangiogeeniset ominaisuutensa. Uusien VEGF-C:tä aktivoivien proteaasien tunnistaminen on avannut tapoja kohdistaa VEGF-C:tä terapeuttisesti hedelmöityshoidoissa ja metastaattisissa syövissä lymfedeemahoidon lisäksi. Tutkimuksessa III kuvattiin ensimmäistä kertaa menetelmä biologisesti aktiivisen VEGF-C:n tuottamiseksi E. colissa. Tässä hyödynnettiin redox-modifioidun Origami-kannan ja maltoosia sitovan proteiinin (MBP) yhdistelmää. Tämä menetelmä tuotti biologisesti aktiivista proteiinia, joka on aiemmissa raportoiduissa yrityksissä vaatinut uudelleenlaskostamisen inkluusiokappaleista. Tällainen bakteeriperäinen VEGF-C voisi olla helposti saatavilla oleva kustannus- ja aikatehokas VEGF-C:n lähde in vitro -tutkimuksiin. Tutkimuksessa IV analysoitiin PDGF/VEGF-homologien esiintymistä eri eläinkladeissa. Cnidaria-pääjaksoon kuuluvat lajit tunnistettiin yksinkertaisimmiksi PDGF/VEGF:n kaltaisia proteiineja sisältäviksi eläimiksi. Havaittiin, että VEGF-C:n kaltainen proteiini on varhaisin muoto PDGF/VEGF-tyyppisistä proteiineista, joka on ilmaantunut evoluution aikana. Mielenkiintoista on, että PlGF puuttui täysin sammakkoeläimistä ja VEGF-B puuttui krokotiileista ja linnuista. Lisäksi huomattiin, että VEGF-F:n esiintyminen ei rajoittunut vain myrkyllisiin matelijoihin, vaan sitä voitiin löytää myös ei-myrkyllisistä liskoista ja gekkoista. Tämä tutkimus tarjoaa pohjan sopivien eläinmallien valinnalle verisuonibiologian tutkimuksiin. Näillä tutkimuksilla edistetään ensisijaisesti VEGF-C:n biologian ymmärtämistä ja luodaan pohja imusuoniston sairauksien hoidolle.