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Alveolar macrophages are strategically located at the lung mucosal surface and are part of an intricate cellular network. Here, immune cells, epithelial cells and neurons functionally interact to maintain homeostasis despite a multitude of aggressions and ever-changing environmental conditions. Previous evidence suggest that neuron-derived cues may modulate alveolar macrophages, but also indicate that immune cells influence neuronal activity. Thus, we hypothesized that alveolar macrophages functionally interact with neurons in so-called neuro-immune cell units. Nevertheless, the identity of these units and the nature of this communication remains unknown. Therefore, using advanced imaging techniques, molecular analyses and novel tracing techniques, we set out to define the bi-directional communication between alveolar macrophages and neurons. We found that alveolar macrophages and neurons co-localize. Using a novel tracing technique, we demonstrate that these cells may engage in bi-directional communication. We also show that alveolar macrophages possess the machinery to engage in neuro-immune crosstalk. These results can be easily expanded to fully assess this new neuro-immune cell unit. Furthermore, this versatile new tracing strategy can easily be applied to other neuro-immune cell units, allowing us to unravel this new paradigm in mammalian physiology. Ultimately, this will pave the way for the development of new therapeutic targets.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária KIT is a type III receptor tyrosine kinase encoded by the KIT proto-oncogene. Mutations in KIT and dysregulation of KIT receptor have been implicated in the pathogenesis of several diseases, including human gastrointestinal stromal tumours and canine mast cell tumours, being this latter one of the most frequent cutaneous neoplasms in the dog. Despite the relatively successful use of tyrosine kinase inhibitors in the treatment of this disease, drug resistance frequently develops over time. G-quadruplexes are DNA secondary structures; potential G-quadruplex-forming sequences have been identified in the promoter region of several human oncogenes that are associated with cell growth and proliferation, including human KIT and, recently, its canine counterpart. Increasing evidence points to the potential role of G-quadruplexes in regulation of gene expression. Accordingly, the selective targeting and stabilization of G-quadruplexes by small molecule inhibitors has been studied as a novel anticancer approach. In the present dissertation, the time and dose-dependent effects of three candidate small molecule inhibitors on the expression of KIT, as well as of other proto-oncogenes comprising G-quadruplexes within their promoter regions were assessed. Two disubstituted amido-anthraquinones (compounds 1 and 2), and one bisantrene-analogue (compound 3) were studied, in two human cell lines (MCF7 and HGC27). The obtained results suggest that compound 1 was the most effective in stabilizing KIT G-quaduplex structures and inhibiting mRNA expression; furthermore, the transcriptional effect was confirmed at the protein level. The most pronounced modulation at the protein level was achieved by compound 3. Compound 2 did not cause significant changes in the expression of any of the investigated proto-oncogenes. All in all, the direct targeting of KIT proto-oncogene G-quadruplexes with compounds 1 and 3 might be a promising treatment alternative to the tyrosine kinase inhibitors, in both human and canine KIT-related tumours and, particularly, canine mast cell tumours. RESUMO - Estudos comparativos in vitro de novos alvos para terapia do cancro, e caracterização dos seus efeitos biomoleculares - O KIT é um recetor de tirosina quinase tipo III codificado pelo proto-oncogene KIT. A ocorrência de mutações no KIT e a desregulação do recetor KIT têm sido implicadas na patogénese de diversas doenças, incluindo os tumores do estroma gastrointestinal no homem e os mastocitomas caninos, sendo estes últimos uma das neoplasias cutâneas mais frequentes no cão. Os inibidores da tirosina quinase têm sido usados com relativo sucesso no tratamento desta doença, contudo com o tempo desenvolve-se, frequentemente, resistência a estes fármacos. Os G-quadruplexes são estruturas secundárias de ADN. Na região promotora de vários oncogenes humanos, que estão associados a crescimento e proliferação celular e que incluem o KIT humano e, recentemente, o seu congénere canino, têm sido identificadas potenciais sequências formadoras de G-quadruplex. Evidências crescentes apontam para o papel potencial dos G-quadruplexes na regulação da expressão génica. Nesse sentido, a atuação seletiva e estabilização de G-quadruplexes por meio de pequenas moléculas inibidoras tem sido estudada como uma nova abordagem anti tumoral. Na presente dissertação foram avaliados os efeitos, dependentes do tempo e da concentração, de três moléculas possivelmente inibidoras na expressão do KIT, bem como de outros proto-oncogenes que contêm G-quadruplexes nas suas regiões promotoras. Assim, foram estudadas duas amido-antraquinonas dissubstituídas (compostos 1 e 2), e um análogo do bisantreno (composto 3), em duas linhas celulares humanas (MCF7 e HGC27). Os resultados obtidos sugerem que o composto 1 foi o mais eficaz na estabilização de estruturas G-quadruplex do KIT e na inibição da expressão de ARNm, tendo o efeito transcricional sido confirmado a nível proteico. A modulação mais acentuada a nível proteico foi alcançada pelo composto 3. O composto 2 não causou alterações significativas na expressão de qualquer um dos proto-oncogenes avaliados. Em conclusão, a atuação direta dos compostos 1 e 3 sobre os G-quadruplexes no proto-oncogene KIT poderá ser uma promissora alternativa de tratamento aos inibidores da tirosina quinase em tumores humanos e caninos associados ao KIT, e em mastocitomas em particular.