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The genome of the olive tree pathogen Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) NCPPB 3335 encodes a region of about 15 kb named WHOP (from Woody Host and Pseudomonas) which is involved in the catabolism of aromatic compounds and is essential for the virulence of Psv in woody olive plants. This region is shared with other strains of Pseudomonas syringae pathovars infecting woody hosts, but it is absent in strains infecting herbaceous plants. The WHOP region is organized into four operons, antABC (metabolism of anthranilate), catBCA (catabolism of catechol) ipoBCA (oxigenase activity) and dhoAB (degradation of fenolic compounds) and three independently transcribed genes, antR (positive regulator of the antABC operon), PSA3335_3206 (aerotaxis receptor) and whpR (putative AraC family regulator). In this study we identified two domains in WhpR, a DBD (DNA bingding domain), characterised by a classical HTH (Helix-Turn-Helix) motif and an AraC-like bingding domain. BlastP searches showed that no homologs (≥ 60%) of this protein are found outside the P. syringae complex. We also addressed the role of WhpR in virulence by the construction of ΔwhpR mutants in several P. savastanoi strains isolated from olive and oleander (P. savastanoi pv. nerii). Moreover, quantitative real-time PCR (RT-qPCR) analysis of Psv NCPPB 3335 and its ΔwhpR mutant revealed that WhpR is a negative regulator of most of the operons encoded in the WHOP region. Our future aims are to elucidate the mechanism of WhpR-dependent regulation and to determine whether other genes codified outside the WHOP region are also regulated by WhpR. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech. Las bacterias fitopatógenas del complejo Pseudomonas syringae son agentes causales de enfermedades en multitud de huéspedes leñosos y herbáceos. El ácido indol-3-acético (IAA) es una fitohormona tipo auxina cuya producción es frecuente en bacterias asociadas a plantas. Algunas cepas de P. syringae conjugan el IAA con L-lisina (L-Lys), obteniéndose el conjugado indol-3-acetil-ε-L-lisina (IAA-Lys), mediante la enzima IAA-Lys sintasa, codificada por el gen iaaL. El conjugado IAA-Lys es biológicamente menos activo que el IAA, por lo que su producción podría controlar los niveles de IAA libre en el citoplasma bacteriano y/o la secreción al tejido vegetal. Se han descrito tres alelos del gen iaaL en el complejo P. syringae (iaaLPsv, iaaLPsn, iaaLPto). Recientemente, identificamos un cuarto alelo (iaaLPsf) en el genoma de cepas aisladas de fresno (Fraxinus excelsior). Sin embargo, no se habían realizado hasta ahora análisis comparativos de las actividades bioquímicas y biológicas de las diferentes isoenzimas IaaL. En este trabajo analizamos el contexto génico de los cuatro alelos del gen iaaL en una colección de cepas del complejo P. syringae. Construimos cepas que sobreexpresan cada uno de estos alelos y analizamos su actividad biológica utilizando un ensayo de elongación radicular en Arabidopsis thaliana. Finalmente, expresamos estos alelos en E. coli, lo que permitió purificar las isoenzimas IaaL y analizar sus actividades específicas mediante un ensayo in vitro de acoplamiento enzimático. Nuestros resultados sugieren que la variación alélica del gen iaaL podría relacionarse con la adaptación de la concentración de IAA sintetizada por el patógeno y al huésped infectado.

The two-component regulatory system GacS/GacA is one of the main mechanisms for global regulation in bacteria. GacS/GacA is a highly conserved system that has been studied in many pathogenic bacteria. However, its characterization has been mainly focused on pathogenic bacteria of herbaceous plants. Despite previous works have reported that GacS/GacA regulates the expression of virulence factors, its role in virulence varies among different species and strains. The aim of this work was the identification of virulence factors regulated by the GacS/GacA system in the model bacterium Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), causal agent of olive knot disease. To this end, we generated a gacA deletion mutant in the strain Psv NCPPB 3335, whose transcriptomic profile was further analyzed using a massive RNA sequencing (RNA-seq) strategy. The bioinformatic analysis of RNA-seq data showed that the Psv GacS/GacA system regulates a large number of genes, including some virulence factors already described, such as those related to the type III secretion system, the biosynthesis of phytohormones and the catabolism of aromatic compounds, among others. In addition, small Rsm-type RNAs and regulatory proteins (RsmA) were identified in the regulatory cascade of the GacS/GacA system. Finally, the involvement of some of the virulence factors of Psv NCPP 3335 were further studied through different phenotypic assays, such as plant virulence assays, induction of hypersensitive response, leaf adhesion tests and translocation of type III effectors. Results obtained in this work indicate that GacS/GacA system presents a role in regulation of virulence factors of Psv NCPPB 3335. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

El genoma del patógeno del olivo Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) NCPPB 3335 codifica una región de aproximadamente 15 kb denominada WHOP (del inglés, Woody Host and Pseudomonas), involucrada en el catabolismo de compuestos aromáticos y esencial para la virulencia de Psv en plantas de olivo. Esta región también se encuentra en otros patovares de P. savastanoi y Pseudomonas syringae que infectan huéspedes leñosos, pero está ausente en las cepas que infectan plantas herbáceas. La región WHOP está organizada en cuatro operones, antABC (catabolismo del antranilato), catBCA (catabolismo del catecol), ipoBCA (actividad oxigenasa) y dhoAB (actividad desconocida) y tres genes transcritos independientemente, antR (regulador positivo del operón antABC), PSA3335_3206 (anotado como un receptor de aerotaxis) y whpR (regulador transcripcional perteneciente a la familia AraC). En este estudio, hemos identificado dos dominios en WhpR, un dominio DBD (del inglés, DNA-Binding Domain), caracterizado por un motivo HTH (del inglés, Helix-Turn-Helix) y un dominio AraC de unión a ligando. Análisis BlastP no identificaron homólogos (≥ 60 %) de esta proteína fuera del complejo P. syringae. Para analizar el papel de WhpR en virulencia, hemos construido mutantes ΔwhpR en varias cepas de P. savastanoi aisladas de olivo y adelfa (P. savastanoi pv. nerii). Además, análisis de PCR cuantitativa a tiempo real (RT-qPCR) realizados en Psv NCPPB 3335 y su mutante ΔwhpR han revelado que WhpR es un regulador negativo de la mayoría de los operones codificados en la región WHOP. Nuestros objetivos futuros son dilucidar el mecanismo de regulación dependiente de WhpR y determinar si otros genes codificados fuera de la región WHOP también se regulan por esta proteína. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Phytopathogenic bacteria of the Pseudomonas syringae complex are causal agents of diseases in a wide variety of woody and herbaceous plants with agronomic and ornamental interest. Indole-3-acetic acid (IAA) is an auxin phytohormone whose production is widely distributed among plant-associated bacteria. Some P. syringae strains can further metabolize IAA to the amino acid conjugate 3-indole-acetyl-ε-L-lysine (IAA-Lys), a process involving the enzyme IAA-Lys synthase, encoded by the iaaL gene. IAA-Lys is less biologically active than IAA, so it has been speculated that the conjugation of IAA with L-Lysine could allow the bacteria to control the levels of free IAA accumulated in the bacterial cytoplasm and/or secreted to the plant tissues. The iaaL gene is widespread in the P. syringae complex, and three different alleles (iaaLPsv, iaaLPsn and iaaLPto) have been described. Recently, we have identified a fourth allele (iaaLPsf) specifically encoded in the genome of strains isolated from Fraxinus excelsior. However, comparative analyses of the biochemical and biological activities of the different iaaL alleles have not been performed. In this work, the genomic context of these four alleles in a collection of P. syringae complex strains has been analyzed. In addition, we have constructed strains overexpressing each of these iaaL alleles and analysed their biological activities using an elongation assay of Arabidopsis thaliana roots. Finally, expression of these alleles in E. coli allowed the purification of these four IaaL proteins and the analysis of their specific activities using an in vitro enzymatic coupling assay. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

GacS/GacA es uno de los principales sistemas de regulación global en bacterias gramnegativas. Trabajos previos realizados con bacterias patógenas de plantas herbáceas han descrito cómo el sistema GacS/GacA interviene en la regulación de diversos factores de virulencia. Sin embargo, la regulación de estos factores muestra variabilidad no solo entre especies, sino también entre cepas. En este trabajo, hemos estudiado el papel regulador del sistema GacS/GacA en la virulencia y patogenicidad de la cepa NCPPB 3335 de P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), agente causal de la enfermedad conocida como tuberculosis del olivo. Para ello, se construyó un mutante por deleción del gen gacA, en la cepa Psv NCPPB3335, cuyo perfil transcriptómico se analizó globalmente mediante una estrategia de secuenciación masiva de ARN (RNA-seq). El análisis bioinformático de los datos de RNA-seq mostró que el sistema GacS/GacA de Psv regula la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción tipo III (T3SS), la síntesis de auxinas, locomoción y quimiotaxis bacteriana, y la degradación de compuestos fenólicos asociada a la invasión de huéspedes leñosos. Además, se identificaron variaciones en los niveles de expresión de pequeños ARN de tipo Rsm y proteínas reguladoras (RsmA), elementos que intervienen en la cascada de regulación del sistema GacS/GacA. Con la intención de profundizar en la caracterización de este sistema, se han llevado a cabo ensayos fenotípicos complementantes, como ensayos de virulencia en plantas, inducción de respuesta hipersensible, sensibilidad a peróxido de hidrógeno y translocación de efectores tipo III. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

The species Pseudomonas savastanoi, a member of the Pseudomonas syringae complex, includes five pathovars causing knots or excrescences in woody hosts: P. savastanoi pv. savastanoi, pv. fraxini, pv. nerii, pv. retacarpa (Psr) and pv. mandevillae, comprising isolates from olive, ash, oleander, broom and dipladenia plants, respectively. Comparative genomic analysis of all available P. savastanoi genomes included in these five pathovars defined a total of 45 type III secretion system effector (T3E) genes, including 24 core genes, four genes exclusive of Psr and several genes encoding pathovar-specific truncations. Noticeably, hierarchical clustering based on the presence, absence and truncations of T3E genes, correlated with the core genome phylogeny of these strains, indicating that the five pathovars contain characteristic sets of T3Es, which are thus likely contributing to define their pathogenicity profile. To unravel de role of T3Es in the host specificity of P. savastanoi pathovars we followed two different approaches: i) construction of knock out mutants affected in T3E genes exclusively encoded by specific pathovars and, ii) heterologous expression of T3E genes in strains belonging to pathovars lacking these T3Es or encoding specific truncations. Virulence assays of these strains in their natural hosts and in hosts infected by other P. savastanoi pathovars, allowed us to identify several T3Es with a role in the host specificity of this bacterial pathogen of woody hosts. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La rizobacteria Pseudomonas alcaligenes AVO110 muestra antagonismo frente al hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix. Esta cepa coloniza eficazmente las hifas de R. necatrix y es capaz de alimentarse de sus exudados. Recientemente, hemos publicado la secuencia completa del genoma de P. alcaligenes AVO110. La filogenia de todos los genomas de P. alcaligenes disponibles separa los aislados ambientales, procedentes de agua, junto a la cepa AVO110, de los obtenidos de infecciones de sangre humana y de tejidos de ostras, que agrupan con Pseudomonas otitidis. Análisis del core y del pangenoma de P. alcaligenes han revelado que las cepas de esta especie codifican conjuntos de genes altamente heterogéneos, y que el genoma de AVO110 codifica la región variable más grande y exclusiva de todos ellos (aproximadamente 1,6 Mb y 1795 genes). Los genes exclusivos de AVO110 incluyen un amplio repertorio de genes relacionados con la formación de biopelículas (biofilms), de entre los cuales destacan aquellos modulados transcripcionalmente por exudados de R. necatrix. Uno de estos genes (cmpA) codifica una proteína con dominios GGDEF/EAL específica de cepas de Pseudomonas spp. aisladas de la rizosfera de diversas plantas, de suelo y de agua. También hemos demostrado que CmpA tiene un papel en la formación de biopelículas y que la integridad de su dominio EAL está involucrada en esta función. Este trabajo contribuye a una mejor comprensión del estilo de vida y de la adaptación a nichos específicos de P. alcaligenes, incluido el comportamiento micofágico de la cepa AVO110. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

La bacteria fitopatógena Pseudomonas savastanoi, perteneciente al complejo Pseudomonas syringae, incluye cuatro patovares aislados de diferentes plantas leñosas: pv. savastanoi (olivo), pv. nerii (adelfa), pv. fraxini (fresno) y pv. retacarpa (retama). Recientemente, se ha caracterizado en nuestro grupo un nuevo patovar (Psm) causante de necrosis bacteriana en la planta ornamental dipladenia (Mandevilla spp.) (Caballo-Ponce, E, 2017, Tesis Doctoral). Estudios filogenéticos han demostrado la estrecha relación existente entre cepas del patovar nerii (Psn) y las aisladas de Mandevilla spp., aun cuando éstas difieren en el rango de huésped. En este trabajo hemos llevado a cabo un análisis bioinformático comparativo del repertorio de posibles factores de transcripción (Fts) codificados en los genomas de la cepa Ph3 de Psm y de las cepas de Psn ICMP16943 y ESC23. La búsqueda se centró en aquellos Fts posiblemente implicados en la infección de dipladenia, seleccionando un total de nueve posibles Fts: tres factores exclusivos de Psm Ph3, dos factores truncados exclusivamente en Psm Ph3 y cuatro factores ausentes tanto en Psn ICMP16943 como Psm Ph3 (las dos cepas que infectan dipladenia). De entre los TFs identificados, hemos seleccionados tres que forman parte de un posible operón junto a otros genes implicados en quimiotaxis. Se han construido mutantes de este operón en cada uno de los tres genes codificadores de los Fts seleccionados y en dos genes codificadores de Methyl Chemotaxis proteins (MCP). Actualmente estamos analizando el papel de estos genes en la patogenicidad en plantas de dipladenia y su implicación en quimiotaxis. Este trabajo pretende contribuir en el conocimiento de los determinantes genéticos implicados en la especificidad de huésped de los diversos patovares de la especie P. savastanoi. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Presentación oral La especie Pseudomonas savastanoi pertenece al complejo Pseudomonas syringae, el cual está constituido por un conjunto de bacterias fitopatógenas Gram (-) de alto interés agrícola y económico. Dentro de esta especie se han descrito hasta la fecha cuatro patovares capaces de infectar huéspedes leñosos: pv. savastanoi (aislados de olivo), pv. nerii (aislados de adelfa), pv. fraxini (aislados de fresno) y pv. retacarpa (aislados de retama). La cepa NCPPB 3335 del patovar savastanoi (Psv), establecida como modelo para el estudio de la interacción de Pseudomonas patógenas con plantas leñosas, es el agente causal de la tuberculosis del olivo, enfermedad caracterizada por la aparición de tumores en las partes aéreas de la planta. Uno de los factores de patogenicidad de Psv más relevante es el sistema de secreción tipo III (T3SS) y su repertorio de efectores (T3E). La disponibilidad de la secuencia de Psv NCPPB 3335 nos ha permitido la predicción bioinformática de los genes que codifican su T3SS y su repertorio de T3E en base a la homología con otros efectores previamente descritos. Esta cepa presenta un repertorio de efectores constituido por 28 T3E. Con el objetivo de analizar la expresión del repertorio de T3E en Psv, se ha llevado a cabo un análisis RNAseq comparativo entre la cepa silvestre Psv NCPPB 3335 y un mutante de la misma del gen hrpL, el cual codifica un activador transcripcional de los genes del T3SS y de la mayoría de sus T3E. Las secuencias procedentes de este RNAseq se están analizando actualmente y los resultados que se obtengan del mismo nos permitirá no sólo analizar la expresión de los T3E que hemos identificado en esta cepa, sino también caracterizar el regulón HrpL completo en la misma y quizás identificar nuevos posibles T3E. Los resultados obtenidos, se compararán con una predicción de promotores regulados por HrpL (hrp-box), que se llevará a cabo utilizando una herramienta bioinformática generada por nuestro equipo. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Las cepas de Pseudomonas savastanoi productoras de tumores en las partes aéreas de plantas leñosas, pertenecen al complejo Pseudomonas syringae y se incluyen en los patovares savastanoi (Psv olivo), nerii (Psn adelfa), retacarpa (Psr retama) y fraxini (Psf fresno). La mayoría de estas cepas producen ácido indol-3-acético (IAA) desde el triptófano (Trp) a través de la ruta de la indol-3-acetamida (operón iaaMH). Aunque este operón no se codifica en Psf ni es frecuente en este complejo bacteriano, la mayoría contienen uno o varios alelos del gen iaaL, responsable en Psn de la síntesis de IAA-Lys, un derivado con menor actividad biológica que el IAA. Aunque las cepas de Psv codifican 2 alelos del gen iaaL, no se ha detectado IAA-Lys en cultivos de estas. Resultados previos de nuestro grupo de investigación demostraron que un mutante de Psv iaaMH reduce drásticamente los niveles de IAA y no induce tumores en olivo. No obstante, en el sobrenadante de cultivos de esta cepa se detecta una concentración de IAA similar a la producida por cepas de Psf y otras P. syringae carentes de estos genes. Esto sugieren la existencia de una ruta de biosíntesis de IAA alternativa. Con el fin de identificar dicha ruta y conocer el papel de los diversos alelos iaaL en estas cepas, hemos realizado un análisis genómico comparativo de 10 cepas de P. savastanoi, y se están construyendo mutantes de Psv en genes potencialmente implicados en la biosíntesis de IAA. De manera complementaria, estamos comparando los transcriptomas y metabolomas de una cepa silvestre de Psv y del mutante iaaMH, tanto en presencia como en ausencia de Trp. Hasta la fecha, hemos detectado varios intermediarios indólicos posiblemente implicados en la producción de IAA en estas cepas y en el patógeno de tomate P. syringae DC3000. Asimismo, estamos ensayando la funcionalidad de 4 alelos iaaL diferentes mediante expresión heteróloga en Psv y análisis del efecto de estas cepas sobre la elongación de raíces de Arabidopsis. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech

Las bacterias Gram negativas del complejo Pseudomonas syringae, entre las que se incluye Pseudomonas savastanoi, infectan gran variedad de plantas herbáceas y leñosas de relevancia agrícola y económica. Las cepas de P. savastanoi productoras de tumores o excrecencias en las partes aéreas de plantas leñosas se incluyen en los patovares savastanoi (Psv, aislados de olivo), nerii (Psn, aislados de adelfa), retacarpa (Psr, aislados de retama) y fraxini (Psf, aislados de fresno). La mayoría de las cepas de P. savastanoi producen ácido indol-3-acético (IAA) a través de la ruta de la indole-3-acetamida, en la cual intervienen los genes iaaM e iaaH. Esta ruta es la mejor caracterizada en bacterias fitopatógenas, sin embargo, estos genes no se codifican en cepas de Psf ni se encuentran ampliamente distribuidos en el complejo P. syringae. Aunque un mutante de Psv afectado en el operón iaaMH reduce drásticamente los niveles de IAA producidos, en el sobrenadante de cultivos de esta cepa se detecta una cantidad basal de IAA, similar a la presente en cultivos de cepas de Psf y de P. syringae carentes de estos genes. Esto sugiere la presencia de una ruta de biosíntesis de IAA alternativa en estas cepas. Con el fin de identificar dicha ruta hemos llevado a cabo un análisis metabolómico de los compuestos indólicos producidos por cepas pertenecientes a todos los patovares de P. savastanoi y por la cepa P. syringae DC3000 patógena de tomate (Pto). El agrupamiento de estas cepas según sus perfiles metabólicos es concordante con sus relaciones filogenéticas. Además, hemos observado una mayor similitud metabólica entre las cepas de Psf y Pto con un mutante de Psv carente del operón iaaMH. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv) is a tumour-inducing pathogen of woody hosts, causing olive (Olea europaea) knot disease. During epiphytic colonization, Psv can multiply on the surface of healthy olive leaves, and these large epiphytic populations can spread by rain, wind, insects and cultural practices, entering the plant through wounds. During the last few years, our work focused on the molecular mechanisms governing the transition from the epiphytic to the endopathogenic lifestyle in Psv. Besides confirmation of several virulence factors previously associated to P. savastanoi infections, such as the phytohormones indole-3-acetic acid and cytokinins and the type-III secretion system, we have identified several novel virulence genes and metabolic pathways required for full fitness of Psv in olive knots. Here, we will present our recent results concerning i) the characterization of a genomic region of the Psv chromosome that is absent in all sequenced P. syringae and P. savastanoi strains infecting herbaceous plants (non-lignified), but it is shared with other pathovars infecting woody hosts (lignified) and, ii) the role in virulence of two enzymes involved in the metabolism of cyclic diguanylate-GMP (c-di-GMP), which are also encoded by other Pseudomonas spp. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Se trata de una comunicación en panel presentada al XXIV Congreso de Microbiología SEM, celebrado en L'Hospitalet, Barcelona, en julio de 2013. Plan Nacional de I+D+I del Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL2010-21848-CO2-01), Incentivos a Proyectos de Excelencia de la Junta de Andalucía (P10-AGR-5797), ambos cofinanciados con fondos FEDER (UE)

La especie Pseudomonas savastanoi está constituida por cuatro patovares que causan tumores o excrecencias en huéspedes leñosos: pv. savastanoi (Psv), pv. nerii, pv. fraxini y pv. retacarpa, constituidos por cepas aisladas de olivo, adelfa, fresno y retama, respectivamente. Además, recientemente se ha identificado a P. savastanoi como el agente causal de la necrosis bacteriana de la dipladenia (Mandevilla spp.), el cual se ha propuesto como un nuevo patovar, pv. mandevillae. La patogenicidad de P. savastanoi depende, entre otros factores, del sistema de secreción tipo III (T3SS) y de su repertorio de efectores (T3E), los cuales se han identificado como uno de los factores principales en la especificidad de huésped. La reciente disponibilidad de nuevas secuencias genómicas nos ha permitido realizar un estudio genómico comparativo de los genes que codifican el T3SS y sus T3E en 21 cepas de P. savastanoi dirigido a la identificación de posibles genes implicados en el rango de huésped. Estos análisis se han acompañado con pruebas de patogenicidad cruzada que nos han permitido correlacionar los resultados de los análisis genómicos con la especificidad de huésped de algunas de estas cepas. De los T3E identificados en este análisis, se ha realizado un estudio en mayor profundidad del papel en el rango de huésped de HopBL1, HopBL2, AvrPto1, AvrRps4, HopF1 y HopZ5. Además, hemos realizado un análisis RNAseq y una predicción bioinformática dirigida a la caracterización del regulón HrpL de la cepa modelo Psv NCCPB 3335, principal regulador del T3SS y sus T3E. En resumen, en esta Tesis Doctoral se ha demostrado que el T3SS es esencial para la patogénesis de todos los patovares de P. savastanoi aislados de huéspedes leñosos y que su repertorio de T3E se ha diversificado en el proceso de adaptación al huésped, siendo elementos determinantes en la definición de su rango de huésped.

El complejo Pseudomonas syringae esta formado por un amplio número de bacterias fitopatógenas clasificadas en 65 patovares y 15 especies, entre las que se encuentra Pseudomonas savastanoi. Las cepas de P. savastanoi producen tumores o excrecencias en las partes aéreas de plantas leñosas y se incluyen en los patovares savastanoi (Psv), nerii, retacarpa, fraxini (Psf) y mandevillae, cuyas cepas se han aislado de olivo, adelfa, retama, fresno y dipladenia, respectivamente. En esta Tesis Doctoral, la disponibilidad de un elevado número de genomas de P. savastanoi ha permitido identificar un conjunto de genes exclusivos de patovar que podrían determinar la especificidad de huésped, como la producción de fitotoxinas, genes reguladores, proteínas transportadoras y genes del sistema de secreción tipo III. Además, empleando técnicas transcriptómicas y metabolómicas se han identificado rutas alternativas de producción de indol-3-acético (IAA) en Psv NCPPB 3335 utilizando una cepa mutada en sus operones iaaMH, responsables de producir más del 90% del IAA producido por la cepa silvestre. Los resultados sugieren que proteínas con dominios aldehído deshidrogenasa podrían estar implicadas en este proceso. Además, se han identificado compuestos intermediarios del metabolismo del IAA en Psv, aunque no se han definido genes relacionados con su síntesis. Por otro lado, mediante análisis transcriptómicos se ha determinado que el IAA endógeno y exógeno provoca cambios en el transcriptoma global de Psv NCPPB 3335 y se ha identificado la presencia de secuencias cortas en el promotor de estos genes desregulados que podrían participar en la regulación de éstos por IAA. Por último, se ha descrito en Psf un nuevo alelo del gen iaaL, encargado de producir IAA-Lys y se han identificado diferencias de actividad entre los diferentes alelos iaaL presentes en las cepas de P. savastanoi, por lo que este gen podría tener un papel clave regulando los niveles endógenos de IAA.

El complejo Pseudomonas syringae agrupa a un amplio número de cepas bacterianas patógenas de plantas clasificadas en más de 60 patovares y 10 especies, entre las que se encuentra Pseudomonas savastanoi. Esta bacteria induce la formación de tumores (crecimiento hiperplásico del tejido vegetal) o excrecencias en los tallos, ramas y, ocasionalmente, hojas y frutos de la planta. P. savastanoi se divide actualmente en cuatro patovares: pv. savastanoi (Psv), pv. nerii (Psn), pv. fraxini (Psf) y pv. retacarpa (Psr) corresponden con cepas aisladas de olivo, adelfa, fresno y retama, respectivamente. Además, se han aislado cepas de P. savastanoi patógenas en otros huéspedes como la dipladenia el mirto o el jazmín. La enfermedad causada por P. savastanoi en dipladenia se está expandiendo por el mundo y conlleva importantes pérdidas económicas en el mercado ornamental. Antes del comienzo de esta Tesis Doctoral se habían estudiado en detalle varios factores de virulencia de P. savastanoi. La producción de las fitohormonas ácido 3-indolacético y citoquininas, el sistema de secreción tipo III (T3SS) y su conjunto de efectores, el metabolismo del segundo mensajero di-GMPc, y el sistema de regulación por quorum sensing contribuyen a la virulencia de P. savastanoi. Además, otros factores como la degradación de compuestos aromáticos o la tolerancia a diversos estreses se identificaron siguiendo una estrategia genómica funcional. El análisis comparativo del genoma de Psv NCPPB 3335 con los genomas de otras cepas del complejo P. syringae aisladas de huéspedes herbáceos encontró varias regiones específicas del genoma de Psv NCPPB 3335. Una de ellas, denominada región WHOP (por las siglas en inglés de huéspedes leñosos y Pseudomonas), contiene genes probablemente relacionados con el metabolismo de compuestos aromáticos y, dentro del complejo P. syringae, sólo se ha encontrado en los genomas de cepas aisladas de huéspedes leñosos. Esta tesis doctoral se ha centrado en el análisis de factores que contribuyen a la virulencia y adaptación de P. savastanoi a sus huéspedes leñosos desde diversos puntos de vista. En primer lugar, se ha llevado a cabo un estudio en profundidad de la región WHOP a varios niveles: organización, distribución, función y del papel en la virulencia y la adaptación de Psv NCPPB 3335. En segundo lugar, se han identificado los genes regulados por quorum sensing en Psv NCPPB 3335, así como establecido diferencias en los sistemas de regulación por quorum sensing entre cepas del complejo P. syringae. Finalmente, se han aislado por primera vez en España cepas de P. savastanoi patógenas de dipladenia (Psd) y se ha caracterizado fenotípicamente un conjunto de Psd aisladas en todos los países donde se ha descrito la enfermedad. Los resultados más relevantes obtenidos durante la Tesis Doctoral del solicitante fueron los siguientes: i) la región WHOP está presente en bacterias del complejo P. syringae aisladas de órganos leñosos y ausente en cepas aisladas de órganos no leñosos, excepto P. syringae pv. actinidifoliorum y P. syringae pv. ciccaronei; ii) la región WHOP de Psv NCPPB 3335 se organiza en cuatro operones (catBCA, antABC, ipoABC y dhoAB) y tres genes transcritos individualmente (antR, PSA3335_3206 y benR), de los cuales los operones antABC y catBCA están implicados en el catabolismo de antranilato y catecol, respectivamente, y el operón ipoABC confiere actividad oxigenasa sobre compuestos aromáticos; iii) los operones antABC, catBCA e ipoABC contribuyen a la virulencia de Psv NCPPB 3335 en plantas de olivo leñosas, mientras que mutantes individuales en los operones catBCA y dhoAB y el gen PSA3335_3206 presentan una desventaja en crecimiento competitivo frente a Psv NCPPB 3335; iv) cepas del complejo P. syringae contienen un número variable de homólogos a los genes luxI y luxR; v) la transcripción de doce genes regulados por quorum sensing en P. syringae pv. tabaci es independiente de PssI (homólogo a LuxI) en Psv NCPPB 3335; vi) la producción de exopolisacáridos, la formación de biofilms, la movilidad y la virulencia no están alteradas en mutantes de quorum sensing de Psv NCPPB 3335; vii) P. savastanoi es el agente causal del moteado de hojas y tallos en dipladenia en España; viii) cepas de P. savastanoi aisladas de dipladenia están filogenéticamente relacionadas con cepas de P. savastanoi pv. nerii (aisladas de adelfa) y tienen un rango de huésped diferente al de los cuatro patovares establecidos de P. savastanoi; ix) P. savastanoi Ph3 (cepa aislada de dipladenia en Francia) puede migrar en plantas de dipladenia causando una infección sistémica y, ocasionalmente, la marchitez de la planta., 2019-07-25

Los efectores (T3E) del sistema de secreción tipo III (T3SS) son factores de virulencia esenciales en la interacción de bacterias fitopatógenas con sus hospedadores, debido a que: (i) promueven la penetración y permanencia del patógeno en el tejido del hospedador, (ii) interfieren con las respuestas de defensa de las plantas y (iii) facilitan el acceso a los nutrientes, promoviendo la proliferación y el crecimiento del patógeno (Gohre and Robatzek, 2008). La secuenciación y análisis de los genomas de diferentes cepas pertenecientes al complejo Pseudomonas syringae, ha permitido identificar el catálogo de T3E hipotéticos de cada una de ellas, así como clasificarlos en más de 60 familias génicas que constituyen el pangenoma de este relevante complejo de bacterias fitopatógenas (http://www.pseudomonassyringae.org/) (Baltrus et al., 2011; Lindeberg et al., 2012). Aunque la función concreta de la mayoría de los T3E identificados hasta la fecha en la interferencia con los mecanismos de defensa de la planta es aún desconocida, durante los últimos años se han producido grandes avances en el conocimiento del papel de los T3E del complejo P. syringae durante la interacción con plantas herbáceas. Estudios recientes, han establecido a Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 como una cepa modelo en el estudio de la interacción de este complejo bacteriano con plantas leñosas (Ramos et al., 2012). El análisis bioinformático del borrador del genoma de esta cepa identificó 33 posibles T3E (Rodriguez-Palenzuela et al., 2010; Ramos et al., 2012), cuya translocación a través del T3SS se demostró para 7 de ellos (AvrRpm2, HopA1, HopAA1, HopAZ1, HopBK1, HopBL1 y HopBL2) durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral (Matas et al., 2014). Además, la secuenciación de los tres plásmidos de esta cepa reveló que los genes codificantes de los T3E HopAF1 y HopAO1 se localizan en los plásmidos pPsv48A y pPsv48B, respectivamente, codificándose en el cromosoma un homólogo de HopAF1 (HopAF1-2). Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo principal que se planteó en esta Tesis Doctoral fue el análisis funcional de los T3E de NCPPB 3335, prestando mayor atención a las familias HopAF y HopAO. Para llevar a cabo este objetivo general, se plantearon los siguientes abordajes: 1) estudiar la distribución de los efectores de las familias HopAF y HopAO en los patovares de P. savastanoi y P. syringae, 2) analizar la translocación a través del T3SS de NCPPB 3335 y el papel en virulencia de los efectores de las familias HopAF y HopAO y, 3) analizar la interacción con los sistemas de defensa de la planta de los siete efectores de NCPPB 3335 cuya translocación a través del sistema de secreción tipo III ha sido demostrada, así como de los pertenecientes a las familias HopAF y HopAO. El análisis bioinformático y filogenético de las familias HopAF y HopAO permitió identificar que ambas se encuentran ampliamente distribuidas dentro del complejo P. syringae, si bien, P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 codifica dos genes de la familia hopAO (hopAO1 y hopAO2) y tres genes de la familia hopAF (dos copias del gen hopAF1 y una del gen hopAF1-2). La filogenia de esta última familia reveló que el alelo hopAF1 se codifica mayoritariamente en cepas patógenas de plantas leñosas. Análisis de translocación y transcripcionales validaron a los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 como nuevos T3E del secretoma del T3SS de NCPPB 3335. Por otra parte, en este trabajo hemos demostrado que tanto los T3E AvrRpm2, HopBK1, HopBL1, HopBL2, HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2, así como los efectores truncados HopAA1 y HopAZ1, interfieren con la respuesta de defensa primaria (PTI) de Nicotiana tabacum. Además, presentamos evidencias de que HopAZ1, HopBL1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 también inhiben la inmunidad mediada por efectores (ETI) en este mismo hospedador. Por otro lado, y utilizando fusiones traduccionales a la proteína verde fluorescente (GFP), hemos podido comprobar que los T3E HopAF1, HopAF1-2, HopAO1 y HopAO2 se localizan en la membrana plasmática de las células de Nicotiana benthamiana, así como que HopAO2 también se localiza en vesículas del aparato de Golgi. Con el fin de averiguar el papel de los T3E HopAF1 y HopAO1 en la virulencia de NCPPB 3335 se construyeron mutantes simples de los mismos. La deleción del gen hopAF1 del plásmido pPsv48A en NCPPB 3335 tuvo como consecuencia una ligera reducción en el tamaño de los tumores inducidos por este patógeno en plantas de olivo lignificadas, mientras que la deleción del gen hopAO1 conllevó una clara disminución de la virulencia del mismo. Los resultados incluidos en esta Tesis Doctoral, convierten a NCPPB 3335 en la cuarta cepa del complejo P. syringae cuyo secretoma del T3SS incluye un mayor número de T3E demostrados, y en la primera cepa aislada de un hospedador leñoso.

En la actualidad, el empleo de agentes de biocontrol con comportamientos micofágicos se presenta como un mecanismo de biocontrol alternativo, ya que estos agentes bacterianos pueden interferir con el crecimiento y desarrollo del hongo, mientras se alimentan de él (Pliego et al., 2011b). En este sentido, el principal objetivo que se ha perseguido en este trabajo de Tesis Doctoral consistió en determinar los genes del agente de biocontrol Pseudomonas pseudoalcaligenes AVO110 implicados en la micofagia del hongo fitopátogeno Rosellinia necatrix, con el propósito de profundizar en los mecanismos de biocontrol de esta cepa empleados en el control biológico de la podredumbre blanca radicular del aguacate. Para ello, se continuo el proceso de selección de mutantes GAM (Growth Attenuated Mutants) iniciado por Pliego (2008a), empleando la tecnología STM en el análisis de la capacidad de los mismos de multiplicarse y sobrevivir en medio BM suplementado con exudado de R. necatrix (Pliego et al., 2008b). El proceso finalizó con la selección de 19 mutantes GAM, que junto con los 7 mutantes seleccionados previamente por Pliego (2008a), suman un total de 26 mutantes. La mayor parte de las funciones identificadas utilizando un primer borrador del genoma de la cepa AVO110, estuvieron dirigidas a satisfacer una serie de requerimientos nutricionales y energéticos relacionadas con la biosíntesis de los aminoácidos glutamato (GAM-9: gltB; operón gltBD) y leucina (GAM-12/GAM-21: leuC; operón leuCD), la degradación de los aminoácidos fenilalanina y tirosina (GAM-5: hmgB), la degradación (GAM-17: fadD; GAM-11: fadE) y asimilación de ácidos grasos (GAM-10: aceA), la producción de sideróforos (GAM-19: micro-ARN), la biosíntesis de purinas (GAM-18: purB), la quimiotaxis hacia los componentes del exudado fúngico (GAM-3:PAS-GGDEF-EAL; posible operón con los genes che implicados en quimiotaxis), el funcionamiento de un sistema de transporte de nutrientes activo (GAM-6: dppA; operón dpp), así como la capacidad de regular las concentraciones celulares de nitrógeno (GAM-8: ntrB; operón ntrBC). En cambio, otras funciones estuvieron relacionadas con la resistencia a distintos tipos de estrés, tanto de tipo osmótico (GAM-14: kefA; operon kefA-cvrA), como aquellos provocados por ciertos compuestos tóxicos presentes en el exudado de R. necatrix, tales como compuestos aromáticos (GAM-25: pcaC ; GAM-15/GAM-24: colS; operón colRS), agentes antioxidantes (GAM-20: copR; operón copRS), así como agentes antimicrobianos (GAM-26: algQ; GAM-3: PAS-GGDEFF-EAL; GAM-4: peptidasa M23; GAM-2:enterotoxinas termolábil). Por último, el funcionamiento de sistemas de recombinación homóloga (GAM-16/GAM-22: recB; operón recBCD), así como un maquinaria activa en la producción de proteínas mediante ribosomas funcionales (GAM-23: dbpA) y proteínas asociadas a los mismos (rflA), resultaron de especial relevancia para la cepa AVO110 en la adaptación de esta bacteria en el exudado de R. necatrix. Por otra parte, el borrador de la cepa AVO110 permitió realizar un análisis filogenético de genes esenciales mostrando que, a diferencia de otros agentes de biocontrol, la cepa AVO110 mostró una mayor relación evolutiva con especies pertenecientes al grupo P. oleovorans. Finalmente, se analizó el papel de las funciones afectadas en los mutantes GAM-2, GAM-3, GAM-4, GAM-19, GAM-22, GAM-24 y GAM-26 en determinados rasgos relacionados con la competencia rizosférica y fúngica de este agente de biocontrol. En este sentido, el gen algQ (GAM-26) está implicado en la formación de biopelículas por esta bacteria, así como en la colonización de las hifas de R. necatrix y la raíz de plantas de aguacate. Por otro lado, los genes colS (GAM-24) y recB (GAM-22), así como las secuencias codificantes de un micro-ARN implicado en la regulación de la producción de sideróforos (GAM-19) y de una posible peptidasa M23 (GAM-24), están implicados en la colonización del micelio de R. necatrix y de la superficie de la raíz de plantas de aguacate. Por último, la posible proteína con dominios PAS-GGDEF-EAL afectada en el mutante GAM-3 está implicada en la formación de biopelículas, así como en la colonización de la raíz de plantas de aguacate. BIBLIOGRAFÍA Pliego, C. (2008a). Multitrophic interactions involved in biological control of avocado white root rot caused by Rosellinia necatrix. PhD Thesis. University of Málaga. Pliego, C., De Weert, S., Lamers, G., De Vicente, A., Bloemberg, G., Cazorla, F., Ramos, C. (2008b). Two similar enhanced root-colonizing Pseudomonas strains differ largely in their colonization strategies of avocado roots and Rosellinia necatrix hyphae. Environmental Microbiology, 10: 3295-3304. Pliego, C., Ramos, C., De Vicente, A., Cazorla, F. (2011b). Screening for candidate bacterial biocontrol agents against soilborne fungal plant pathogens. Plant and Soil, 340: 505-520. 2018-05-05

El desarrollo de las plataformas de secuenciación de alto rendimiento han supuesto una extraordinaria disminución en tiempo y costes, lo que ha permitido a los expertos disponer fácilmente de las secuencias genómicas de los organismos con que trabajan. El campo de la fitobacteriología no es una excepción, y en la actualidad existe una colección prominente de genomas de bacterias asociadas a plantas en repositorios públicos. En lo que respecta al complejo Pseudomonas syringae, se dispone de más de 50 genomas correspondientes a sendas cepas, aunque sólo de 3 de ellos se conoce la secuencia completa: P. syringae pv. tomato DC3000, patógena de tomate, P. syringae pv. syringae B728a y P. syringae pv. phaseolicola 1448A, patógenas de judía. Recientemente se ha determinado el genoma completo de la cepa P. syringae pv. syringae UMAF0158, agente causal de la necrosis apical del mango (Cazorla et al., 1998). Dado que distintas cepas de P. syringae provocan distintas enfermedades en un amplio rango de huéspedes, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el análisis bioinformático del genoma de UMAF0158, haciendo énfasis en factores bacterianos potencialmente implicados en su capacidad para infectar plantas de mango. El genoma consta de un cromosoma de 5.8 Mb y un plásmido de 63 Kb, y presenta una alta similitud (91% de las secuencias codificantes predichas) respecto al genoma de B728a. De entre los determinantes genéticos diferenciales que podrían explicar su interacción con mango, destacan el operon mbo de síntesis de mangotoxina (Carrión et al., 2012), un clúster potencialmente implicado en la producción de celulosa, dos sistemas de secreción diferentes de tipos III y VI (T3SS y T6SS, respectivamente) y un repertorio particular de efectores del T3SS. El genoma de UMAF0158 constituye el primero completo que se obtiene de una P. syringae que afecta a plantas leñosas, y este estudio sienta las bases para posteriores análisis experimentales, que permitirán esclarecer los mecanismos bacterianos que explican la capacidad de este patógeno para infectar mango. Por otro lado, recientemente se ha obtenido el genoma completo de la cepa endofita de olivo Pseudomonas fluorescens PICF7, probada como agente de biocontrol contra la verticilosis, una enfermedad vegetal provocada por el hongo Verticillium dahliae Kleb. (Mercado-Blanco et al., 2004; Prieto y Mercado-Blanco, 2008). El genoma de PICF7 está formado por un cromosoma circular de 6.1 Mb, cuyo análisis bioinformático reveló genes potencialmente implicados en la asociación de dicha cepa con plantas de olivo, como los codificantes de un T3SS y dos T6SS, sideróforos, enzimas detoxificadoras y compuestos volátiles. La identificación de estos factores ayudará a direccionar posteriores estudios funcionales que permitan describir los mecanismos moleculares implicados en el estilo de vida endofítico de PICF7, así como su capacidad de biocontrol. En paralelo, se han desarrollado dos herramientas bioinformáticas para el análisis de genomas bacterianos en el contexto de las interacciones planta-bacteria. La primera de ellas, llamada T346Hunter, es una aplicación web que permite, dado un genoma bacteriano, identificar genes implicados en la síntesis de los componentes estructurales de los sistemas de secreción T3SS, T4SS y T6SS. La herramienta presenta los resultados mediante un documento HTML intuitivo y fácilmente interpretable, mediante el que el usuario puede “navegar” por las diferentes regiones detectadas y visualizar la localización genómica de los distintos componentes que éstas contienen. Se implementó a su vez una segunda aplicación web, llamada PIFAR (Plant-bacteria Interaction FActors Resource), consistente en un repositorio público de determinantes genéticos bacterianos implicados en interacciones planta-bacteria. Para ello, se realizó una búsqueda pormenorizada en la bibliografía científica con objeto de identificar aquellos productos génicos descritos experimentalmente como implicados en asociaciones bacterianas con plantas huésped. A través de la interfaz de PIFAR, el usuario puede consultar la base de datos, así como descargarla en diferentes formatos. También se incluye un formulario que permite subir nuevos factores para su eventual inclusión en la base de datos, y dispone de una herramienta de anotación para genomas bacterianos de entrada. Dicha herremienta se ejecutó sobre el conjunto de genomas bacterianos completos disponible en el NCBI en Diciembre de 2014, correspondiente a 3.042 cromosomas y 2.200 plásmidos. Los resultados obtenidos son también accesibles desde la interfaz de PIFAR. Por último, se abarcó el problema de la clasificación de genoma bacterianos. Combinando T346Hunter y PIFAR con el método de aprendizaje automático Random forests (Breiman, 2001), se generó un modelo probabilístico basado en las anotaciones de ambas herramientas sobre una selección de 420 genomas bacterianos. Dicho modelo permite asignar probabilidades de asociación con planta a secuencias de entrada. Su aplicación sobre el conjunto de aproximadamente 9.500 genomas bacterianos almacenados en el NCBI en Diciembre de 2014 ha revelado potenciales asociaciones con plantas de una serie de patógenos bacterianos comúnmente asociados a mamíferos. De entre ellos destacan un conjunto amplio de enterobacterias cuya capacidad para inducir enfermedades en humanos ha sido probada en los últimos años.

El diguanilato ciclico (c-di-GMP) es un segundo mensajero que participa en el control de numerosas funciones celulares tales como la biosíntesis y secreción de adhesinas y exopolisacáridos, la motilidad bacteriana, y la virulencia de bacterias patógenas de animales y plantas (Jenal and Malone, 2006; Tamayo et al., 2007; Romling, 2012; Romling et al., 2013). El c-di-GMP se sintetiza a partir de dos nucleótidos de GTP gracias a la acción de diguanilato ciclasas (DGC) y se hidroliza por fosfodiesterasas específicas (PDE). La actividad DGC está asociada con el dominio GGDEF (Camilli y Bassler, 2006; Chang et al., 2001) mientras que la actividad PDE se encuentra asociada con dominios EAL o HD-GYP (Christen et al., 2005; Ryan et al., 2006). Un trabajo previo llevado a cabo por nuestro grupo de investigación para la identificación de nuevos factores de virulencia en Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335, agente causal de la tuberculosis del olivo, permitió la identificación de dos mutantes en genes relacionados con el metabolismo del c-di-GMP (Matas et al., 2012). La caracterización de los mismos (PSA3335_4049 y PSA3335_000620), fue el objetivo inicial de esta Tesis Doctoral. Posteriormente, este objetivo se expandió a otra cepa del complejo Pseudomonas syringae como es el patógeno de tomate y Arabidopsis, P. syringae pv. tomato DC3000, así como al patógeno oportunista de humanos Pseudomonas aeruginosa. Para llevar a cabo este objetivo general, se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1) Analizar la respuesta de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 a niveles elevados de c-di-GMP causados por la sobreexpresión de la DGC de Caulobacter crescentus PleD*; 2) analizar el papel del gen bifA en fenotipos relacionados con la virulencia de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 y P. syringae pv. tomato DC3000 y; 3) estudiar el papel de la hipotética DGC codificada por el gen PAS3335_0620 (dgcP) en fenotipos relacionados con la virulencia de P. savastanoi pv. savastanoi y P. aeruginosa. Las conclusiones más relevantes obtenidas en este trabajo son las que se presentan a continuación: i) el aumento de los niveles intracelulares de c-di-GMP en P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 debido a la sobreexpresión de la DGC PleD*, causa una reducción de la movilidad tipo swimming y un incremento en la producción de exopolisacáridos y en la formación de biofilms, así como induce el desarrollo de tumores de mayor tamaño en plantas de olivo, los cuales muestran una necrosis reducida; ii) la proteína BifA regula positivamente la movilidad en P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 y P. syringae pv. tomato DC3000, así como afecta negativamente a la producción de exopolisácaridos y la formación de biofilms en NCPPB 3335; iii) la deleción del gen bifA provoca una disminución de la virulencia de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 en olivo y de P. syringae pv. tomato DC3000 en tomate; iv) la proteína PDE BifA de Pseudomonas aeruginosa PAO1 complementa todos los fenotipos relacionados con la virulencia que se encuentran alterados en los mutantes bifA de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 y P. syringae pv. tomato DC3000; v) el gen dgcP de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 y P. aeruginosa PAK se co-transcribe en forma de operón junto con el gen dsbA y otro gen codificante de una endonucleasa/ exonucleasa/ fosfatasa (EEPP), este operón está conservado en el género Pseudomonas; vi) la proteína DgcP de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB335 es una DGC cuya actividad es dependiente del dominio GGDEF; vii) la proteína DgcP regula positivamente la movilidad y negativamente la formación de biofilms tanto en P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 como en P. aeruginosa PAK; viii) la sobreexpresión del gen dgcP en P. aeruginosa PAK inhibe el sistema de secreción tipo III e induce el sistema de secreción tipo IV; ix) el gen dgcP es esencial para la virulencia completa de P. savastanoi pv. savastanoi NCPPB 3335 en plantas de olivo y de P. aeruginosa PAK en ratones. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Christen, M., Christen, B., Folcher, M., Schauerte, A., and Jenal, U. 2005. Identification and characterization of a cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase and its allosteric control by GTP. J Biol Chem 280:30829-30837. Jenal, U., and Malone, J. 2006. Mechanisms of cyclic-di-GMP signaling in bacteria. Annu Rev Genet 40:385-407. Matas, I.M., Lambertsen, L., Rodriguez-Moreno, L., and Ramos, C. 2012. Identification of novel virulence genes and metabolic pathways required for full fitness of Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi in olive (Olea europaea) knots. New Phytol 196:1182-1196. Romling, U. 2012. Cyclic di-GMP, an established secondary messenger still speeding up. Environ Microbiol 14:1817-1829. Romling, U., Galperin, M.Y., and Gomelsky, M. 2013. Cyclic di-GMP: the first 25 years of a universal bacterial second messenger. Microbiol Mol Biol Rev 77:1-52. Ryan, R.P., Fouhy, Y., Lucey, J.F., Crossman, L.C., Spiro, S., He, Y.W., Zhang, L.H., Heeb, S., Camara, M., Williams, P., and Dow, J.M. 2006. Cell-cell signaling in Xanthomonas campestris involves an HD-GYP domain protein that functions in cyclic di-GMP turnover. Proc Natl Acad Sci U S A 103:6712-6717. Tamayo, R., Pratt, J.T., and Camilli, A. 2007. Roles of cyclic diguanylate in the regulation of bacterial pathogenesis. Annu Rev Microbiol 61:131-148.