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Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2022. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O carcinoma de células escamosas de cavidade oral é oriundo de desregulação celular causada por alterações genéticas e epigenéticas. Das diversas formas de alteração fenotípica sem mudanças na sequência de DNA, esta pesquisa se dedicou a verificar as modificações póstraducionais das histonas provocadas pelas enzimas metiltransferases Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 1 (EHMT1 - GLP) e Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 2 (EHMT2- G9a) em câncer oral. Em geral, as metiltransferases tem múltiplos papeis moleculares, dentre eles: metilar resíduos de lisina (K) das histonas, permitindo a transcrição gênica (H3K4me, H3K36me, H3K79me) ou levando ao silenciamento gênico, (H3K9me, H3K24me e H4K20me). Além disso, podem metilar proteínas não histonas como a p53, guardiã do genoma humano. Essas alterações proteicas afetam a organização da cromatina e consequentemente a regulação gênica, estando associadas a processos fisiológicos ou a processos patológicos. A superexpressão de EHMT1 e EHMT2 tem sido atribuída a eventos promotores de câncer como: desregulação transcricional, proliferação celular, adaptação metabólica do microambiente tumoral, transição de células epiteliais com aquisição de características mesenquimais. Esses processos são dinâmicos e permitem ganho de características como: motilidade, invasividade, resistência à apoptose e a fármacos. Esta pesquisa objetivou analisar o perfil de expressão gênica das metiltransferases EHMT1 e EHMT2 em carcinomas de células escamosas orais por PCR quantitativa. Obtido o perfil de expressão, foram feitas análises com as características clínicas dos pacientes, sendo elas: idade, gênero, estadiamento tumoral, metástases e recidiva. A fim de complementar os achados laboratoriais, foi realizada análise in silico para verificar o perfil de expressão gênica de EHMT1 e EHMT2 em câncer oral em dados disponíveis na plataforma online OncoMine. Os resultados da qPCR detectaram hipoexpressão de EHMT1 e EHMT2 nas amostras tumorais em relação ao grupo controle, com significância estatística para o primeiro gene. Avaliando a expressão gênica de EHMT1 e EHMT2 de acordo com as características clínicas e na análise de contingência, utilizando o teste de Fischer, não foi detectada significância estatística, embora na análise descritiva dos dados brutos, observou-se algumas associações esperadas, de acordo com a literatura, resultados estes que necessitam de confirmação. Na análise in silico com dados de estudos distintos, foi constatada hipoexpressão de EHMT2 nas amostras tumorais em relação às amostras normais, assim como também foi encontrada, em outro estudo, hiperexpressão nas amostras tumorais tanto de EHMT1 como de EHMT2. Desta forma, é possível inferir que a expressão de EHMT1 e EHMT2 parece variar e depender de contextos celulares, sítios anatômicos e populações estudadas, portanto o significado clínico-patológico dessas enzimas em carcinoma de células escamosas orais ainda não está totalmente esclarecido, sendo necessários estudos complementares. Oral cavity squamous cell carcinoma arises from cellular deregulation caused by genetic and epigenetic changes. Among the different forms of phenotypic alteration without changes in the DNA sequence, this research was dedicated to verifying the post-translational modifications of histones caused by the methyltransferase enzymes Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 1 (EHMT1 - GLP) and Euchromatic Histone Lysine Methyltransferase 2 (EHMT2- G9a) in oral cancer. In general, methyltransferases have multiple molecular roles, including methylating lysine (K) residues of histones, allowing gene transcription (H3K4me, H3K36me, H3K79me) or leading to gene silencing (H3K9me, H3K24me and H4K20me). In addition, they can methylate non-histone proteins such as p53, guardian of the human genome. These protein alterations affect chromatin organization and, consequently, gene regulation, being associated with physiological or pathological processes. The overexpression of EHMT1 and EHMT2 has been associated to cancer-promoting events such as: transcriptional dysregulation, cell proliferation, metabolic adaptation of the tumor microenvironment, transition of epithelial cells with acquisition of mesenchymal characteristics. These processes are dynamic, allowing the gain of characteristics such as: motility, invasiveness, apoptosis and drug resistance. This research aimed to analyze the gene expression profile of methyltransferases EHMT1 and EHMT2 in oral squamous cell carcinomas by quantitative PCR. Besides the expression profile, analyses with the clinical characteristics of patients, namely: age, gender, tumor staging, metastases and recurrence were performed. To complement the experimental findings, in silico analysis was performed to verify gene expression profile of EHMT1 and EHMT2 in oral cancer in data available at the OncoMine online platform. The qPCR results detected EHMT1 and EHMT2 down expression in tumor samples compared to the control group, with statistical significance for the firs t gene. Evaluating EHMT1 and EHMT2 gene expression according to clinical characteristics and with contingency analysis, using Fischer's test, no statistical significance was found, although the descriptive analysis of the data revealed some expected associations, according to the literature, which still need confirmation. In the in silico analysis with data from different studies, it was found down expression of EHMT2 in tumor samples compared to normal samples, as well as overexpression in tumor samples of both EHMT1 and EHMT2. Therefore, it is possible to infer that the expression of EHMT1 and EHMT2 seems to vary and depend on cellular contexts, anatomical sites and populations studied, so the clinicopathological significance of these enzymes in oral squamous cell carcinoma is still not fully understood and further studies are necessary.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2018. No início de 2016 houve um aumento no número de casos DENV quando comparado a anos anteriores no Distrito Federal. Geralmente essas infecções apresentam sintomas suaves e até mesmo assintomáticos, porém a transfusão de hemoderivados em pacientes em estado potencialmente crítico, e que muitas vezes estão imunocomprometidos, pode levar a sintomas mais graves. Como diversas evidências apontam para a transmissão de arbovírus por transfusão sanguínea, torna-se importante a avaliação dos doadores da Fundação Hemocentro de Brasília no intuito de se observar a prevalência do vírus da Zika (ZIKAV) e do vírus da Dengue (DENV), especialmente em um período de alto número de casos reportados na população geral. Para tal, 475 amostras de soro obtidas de doadores de sangue entre Dezembro de 2015 a Maio de 2016 foram testadas para NS1 de DENV e IgM anti-DENV por ELISA, e RT – qPCR para ZIKAV. Nas amostras IgM anti-DENV ou NS1 positivas ou inconclusivas foram realizados testes de Elisa para IgG anti-DENV, IgM anti-CHIKV, e Mac-ELISA para YFV. Quando reagente verificou-se a possibilidade de reações cruzadas, por MAC-ELISA para IgM de ZIKAV e DENV. Não foi observada positividade para o antígeno NS1 em nenhuma das amostras testadas. Aproximadamente 6,95% dos doadores apresentavam o anticorpo de fase aguda IgM para DENV. Parte das amostras que apresentaram resultado positivo para IgM de DENV também possuíam a presença do anticorpo IgG para DENV. Algumas amostras que apresentaram resultado reagente para IgM de DENV também apresentaram resultado reagente IgM de outros flavivírus testados (YFV e ZIKAV). Nenhuma amostra positiva para IgM de DENV apresentou resultado reagente para IgM de CHKV. Além disso, para fins de comprovação, aquelas amostras que apresentaram reação cruzada entre DENV e ZIKAV foram retestadas por RT-qPCR e mantiveram o resultado negativo para o ZIKAV. Em relação à DENV, de 29 amostras que foram reagentes para IgM, 19 também foram reagentes para IgG, o que pode indicar apresença do IgM na ausência do vírus. Além disso, não foi observada positividade para o antígeno NS1 no teste de DENV por ELISA. Porém, é necessário ressaltar a importância do RT-PCR para DENV para diagnóstico confiável. In early 2016 there was an increase in the number of DENV cases in Federal District, Brazil, compared to previous years. These infections usually present mild symptoms or even no symptoms, although the transfusion of blood products in potentially critical patients - commonly immunocompromised – can lead to more serious symptoms. As several evidences point to the transmission of arboviruses by blood transfusion, it’s important to evaluate the blood of donors from the Fundação Hemocentro de Brasília in order to observe the prevalence of Zika virus (ZIKAV) and Dengue virus (DENV), specialy in a period of high number of cases in general population. For this purpose, 475 serum samples obtained between December 2015 and may 2016 were tested for NS1 of DENV and anti-DENV IgM by ELISA and RT-qPCR for ZIKAV. In positive or inconclusive anti-DENV IgM NS1 samples, ELISA tests were performed for anti-DENV IgG, anti-CHIKV IgM and MAC-ELISA for YFV. When reagent, was found the possibility of cross-reactions by MAC-ELISA for ZIKAV and DENV IgM. Positive results for antigen NS1 was not observed. Approximately 6.95% of the donors presented the IgM acute phase antibody to DENV. Part of the samples that presented positive results for DENV IgM also presented IgG antibody to DENV. Some samples that showed positive results for IgM DENV also showed positiv results for other flaviviruses tested (YFV and ZIKAV). No positive sample for DENV IgM presented positive result for CHKV. In addition, for verification purposes, those samples that showed cross-reaction between DENV and ZIKAV were tested by RT-qPCR and maintained the negative result for ZIKAV. In relation to DENV, 19 samples IgM positive (from 29 tested) were also positive for IgG, which may indicate the presence of IgM in the virus absence. In addition, no positive samples were observed for the NS1 antigen in the DENV test by ELISA. However, it is necessary to emphasize the importane of RT-PCR for DENV for reliable diagnosis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. O câncer de mama ainda continua sendo uma epidemia mundial, com taxas importantes de incidência e prevalência no mundo todo. De forma geral, a taxa de mortalidade do câncer de mama gira em torno de 15% nos países desenvolvidos e em torno de 40% nos países em desenvolvimento em 05 anos. Vários fatores de risco tem sido identificados na gênese do câncer de mama. Nenhuma isolada, porém, explica de forma completa, a carcinogênese do câncer de mama. A classificação do câncer de mama em subtipos moleculares, baseada no perfil de expressão de receptores hormonais e no receptor do HER-2 trouxe uma base racional para o tratamento desta doença. Mutações em alguns genes supressores tumorais, como o BRCA-1 e BRCA-2, além do p53 e PTEN, tem papel relevante conhecido na transformação tumoral da célula mamária normal. Vários tumores, porém, não apresentam alterações nestes genes. Por outro lado, alterações epigenéticas têm se mostrado cada vez mais relevantes na gênese de vários tumores. Estas alterações têm como característica básica não causar modificações na sequência do DNA, mas promover expressão seletiva dos genes dependente do nível do empacotamento do DNA, com áreas de eucromatina frouxa, que permitem mais facilmente a transcrição gênica, e áreas de heterocromatima, que dificultam a transcrição. Dentre os efetores epigenéticos de maior relevância estão as enzimas metiltransferases, capazes de promover a metilação das histonas. Desregulação na expressão ou atividade destas enzimas estão entre as principais alterações epigenéticas envolvidas na carcinogênese. A família SETD é uma família de metiltransferases composta por 10 genes que codificam proteínas com domínio SET. Este domínio está envolvido na metilação de resíduos de lisina em histonas e proteínas não-histonas. Até o momento, pouco se sabe sobre a relação de genes da família SETD com a carcinogênese mamária. No presente estudo foi realizada a avaliação de expressão relativa de todos os genes da família SETD em amostras de tecidos tumorais e normais de pacientes portadoras de câncer de mama através de técnica de PCR em tempo real. O perfil de expressão comparativa desta família de genes foi correlacionado com as informações clínico-patológicas de maior relevância prognóstica, disponíveis das pacientes. Posteriormente realizamos avaliação imunohistoquímica em lâmina de microarranjo de tecidos. Notamos que o gene SETMAR encontra-se significativamente hiperexpresso nas amostras tumorais quando comparadas às amostras normais de pacientes com câncer de mama. Quando avaliamos apenas as pacientes com perfil imuno-histoquímico do tipo triplo negativo, comparadas com as amostras normais, há novamente uma hiperexpressão relativa do gene SETMAR. Os genes SETD5 e SETD8 encontram-se hiperexpressos em tumores com mais de 10 linfonodos positivos para metástase de câncer de mama, além de estarem também hiperexpressos nas pacientes com estadiamento acima do estádio IIB. Além disso, há uma significativa correlação na expressão de ambos os genes no pool de amostras tumorais. O gene SETD8 encontra-se ainda hiperexpresso em pacientes que apresentam invasão angiolinfática. Outro gene que se apresentou significativamente alterado é o SETD1B, cuja expressão está aumentada nos tecidos tumorais comparados aos tecidos normais em amostras pareadas. Entre as amostras tumorais pareadas também foi verificada uma estreita correlação de co-expressão dos genes SETD1B, SETD5, SETD8, SETMAR. Analisados em conjunto, estes dados apontam para o provável papel dos genes SETMAR e SETD1B na carcinogênese mamária, com implicações clínicas relevantes, além de um possível envolvimento dos genes SETD5 e SETD8 em estádios mais avançados da doença. A correlação da expressão gênica de alguns membros da família SETD com fatores clínicos prognósticos em câncer de mama abre o caminho para explorá-los não só como alvos terapêuticos, mas também como novos marcadores prognósticos. Breast cancer still remains a global epidemic, with significant rates of incidence and prevalence worldwide. Overall, their mortality rate is around 15 % in developed countries and around 40 % in developing countries in 05 years. Several risk factors have been identified in the genesis of breast cancer, but no one alone, explains the carcinogenesis of breast cancer. The classification of breast cancer in molecular subtypes based on the expression profile of hormone receptors and HER -2 receptor has brought a rational basis for treatment of this disease. Mutations in tumor suppressor genes, such as BRCA 1 and BRCA-2, p53 and PTEN, plays an important role in the tumor transformation of normal breast cells. However, not all breast tumors carry changes in these genes. Epigenetic alterations have recently been recognized to play an important role in the genesis of many tumor types. These changes are characterized by not causing any kind of mutations in the DNA sequence but by inducing selective expression of genes dependent on the the DNA packaging level, with areas of loose euchromatin, allowing more easily gene transcription, and areas of heterocromatin, that hamper transcription. Among the most relevant epigenetic effectors, the methyltransferases enzymes are capable of promoting histone methylation. Dysregulation in the expression or activity of these enzymes is among the major epigenetic alterations involved in carcinogenesis. The SETD family is a family of methyltransferases composed of 10 genes encoding proteins with SET domain. This domain is involved in the methylation of lysine residues on histones and non-histone proteins. So far, little is known about the relation of SETD family genes with mammary carcinogenesis. In the present study we evaluated the relative expression of all SETD family genes in breast tumor samples and non-tumor breast tissues of patients with breast cancer by real time q-PCR. The comparative expression profile of each gene of this family was correlated with the most relevant clinicopathologic prognostic information, available from patients. We note that there is a significant overexpression of the gene SETMAR in tumor samples compared to normal samples from patients with breast cancer. When we evaluated only patients with immunohistochemical profile of the triple negative type, compared with the normal samples, we observed again a significant overexpression of SETMAR. The SETD5 and SETD8 genes are overexpressed in tumors with more than 10 positive lymph nodes for breast cancer metastasis, and also are overexpressed in patients with advanced stage. Furthermore, there is a significant correlation in expression of both genes in pool of tumor samples. The SETD8 gene is still overexpressed in patients with angiolymphatic invasion. Another gene that is significantly changed is the SETD1B, whose expression is increased in tumor tissues compared to corresponding normal tissues samples. The paired tumor samples also showed a close correlation of co-expression of genes SETD1B, SETD5, SETD8, SETMAR. Taken together, these data point to the likely role of SETMAR and SETD1B genes in mammary carcinogenesis, with relevant clinical implications, and possible involvement of SETD5 and SETD8 genes in more advanced stages of the disease. The correlation of gene expression of some members of the SETD family with clinical prognostic factors in breast cancer opens the way to exploit them not only as therapeutic targets, but also as a new prognostic markers.