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Dissertação de mestrado em Ciências da Saúde, A hiperglicemia na gravidez é considerada um problema de saúde pública, estimando-se que aproximadamente uma em seis gravidezes são afetadas. No primeiro trimestre da gravidez, a hiperglicemia não controlada pode afetar a organogénese, resultando em malformações congénitas severas. Anomalias nos sistemas craniofacial, cardiovascular, gastrointestinal, urogenital, musculoesquelético e nervoso central têm sido associadas com a diabetes na gravidez. No entanto, o impacto da hiperglicemia no desenvolvimento do pulmão ainda não foi explorado. Assim, o principal objetivo deste projeto é estudar o impacto da hiperglicemia no processo de ramificação pulmonar, usando explantes de pulmão do embrião de galinha in vitro, expostos a diferentes concentrações de glucose. Após a cultura de explantes de pulmão, foi realizada uma análise morfométrica e de ramificação do pulmão, e os explantes foram também processados para estudos de expressão de genes. Desta forma, o padrão de expressão dos recetores de insulina e IGF (igr1r, igf2r, insr), das enzimas lactato desidrogenase (ldha, ldhb) e genes relacionados com a diferenciação do tecido pulmonar (sox2 e sox9), foram avaliados por hibridização in situ. Além disso, os níveis de expressão de transportadores de glucose (glut1, glut3), enzimas do catabolismo da glucose (hk1, pfk1) e genes relacionados com o processo de ramificação do pulmão (fgf10, shh e wnt7b), foram avaliados por qPCR. Os explantes de pulmão expostos a níveis elevados de glucose apresentaram uma diminuição da área total do pulmão, e da área e perímetro epitelial do pulmão, assim como uma diminuição no número de brônquios secundários formados após a cultura de explantes. Além do mais, os transportadores de glucose e as enzimas glicolíticas também estavam diminuídos, exceto a enzima ldhb, que aumentou a sua expressão nos pulmões expostos a níveis elevados de glucose. Os níveis de expressão de fgf10, shh e wnt7b, importantes para a ramificação do pulmão em desenvolvimento, também se mostraram alterados como consequência da exposição da hiperglicemia. Assim, estas alterações moleculares podem explicar o impacto morfológico observado no pulmão embrionário de galinha, como consequência de hiperglicemia. Em suma, estes resultados mostram que a hiperglicemia pode ter impacto na organogénese do pulmão de galinha ao nível morfológico, metabólico e molecular. Este trabalho contribui para averiguar os potenciais efeitos adversos da hiperglicemia na organogénese do pulmão, que podem contribuir para o desenvolvimento de malformações congénitas e outras complicações respiratórias., Hyperglycemia in pregnancy is considered a major public health concern, and it is estimated that it can affect approximately one in six pregnancies. Uncontrolled hyperglycemia in the first trimester of pregnancy can affect organogenesis, resulting in severe congenital malformations. Abnormalities in craniofacial, cardiovascular, gastrointestinal, urogenital, musculoskeletal, and central nervous systems have been associated with diabetes in pregnancy. However, the impact of hyperglycemia on early lung development has not been explored yet. In this sense, the main goal of this project is to study the impact of hyperglycemia in early lung branching morphogenesis using in vitro chick lung explants exposed to different glucose concentrations. After lung explant culture, branching and morphometric analysis were performed, and lung explants were also processed for gene expression studies. The expression pattern of insulin/IGF receptors (igr1r, igf2r, insr), lactate dehydrogenase enzymes (ldha, ldhb), and lung patterning-related genes (sox2 and sox9) were assessed by in situ hybridization. Furthermore, expression levels for glucose transporters (glut1, glut3), glucose catabolism enzymes (hk1, pfk1), and lung branching-related genes (fgf10, shh and wnt7b) were evaluated by qPCR. Lung explants treated with high glucose levels exhibited a decrease in the total area, the epithelial area and perimeter of the lung, and a reduced number of secondary buds formed after 48-hour culture. Moreover, glucose transporters and glycolytic enzymes expression levels were also decreased, except for ldhb, which showed increased expression in glucose-treated embryonic lungs. Regarding the expression levels of fgf10, shh and wnt7b, important players underlying lung branching morphogenesis, an impairment was also observed as a consequence of hyperglycemia exposure. Overall, these molecular alterations might explain the hyperglycemic-related morphological impact observed in the chick embryonic lung. Altogether, these results imply that hyperglycemia exposure can impair early chick lung organogenesis at the morphological, metabolic, and molecular levels. This work brings new insights into the potential adverse effects of hyperglycemia on early lung organogenesis that may ultimately contribute to developing congenital lung malformations and other abnormal respiratory outcomes., This work has been funded by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT) – project UIDB/50026/2020 and UIDP/50026/2020

Dissertação de mestrado em Bioquímica Aplicada (especialização em Biomedicina), The high prevalence of vitamin D deficiency is currently considered a public health concern, affecting people of all ages worldwide, particularly childbearing women and children. There is now a large body of evidence linking maternal vitamin D deficiency and several maternal and fetal adverse health outcomes. Regarding the developing lung, it has been demonstrated that Vitamin D is crucial for lung maturation processes, and it influences the respiratory health of the offspring. Most observations point to a critical role of vitamin D during the later stages of lung development; however, little is known about its role in early branching stages, and nothing is known about its role in avian lung development. In this sense, this project aims to unravel the role of Vitamin D during early lung development, using the chicken embryo as a model. The present work unveils, for the first time, the expression pattern of Vitamin D signaling members (rxr-α, rxr-y, vdr, cyp24a1, and pdia3) by in situ hybridization in embryonic chick lung. The similarity between the expression patterns and low expression levels of these genes with the mammalian lung point to a similar and, eventually, minor role during these early stages of development. Furthermore, in an attempt to unveil the role of Vitamin D in chick lung branching, in vitro lung explants were performed. Supplementation studies revealed that Vitamin D supplementation significantly reduced lung size and branching, independently of the dose. Additionally, cyp24a1 increased expression in Vitamin D-treated explants, the main regulatory component of the pathway, confirmed Vitamin D signaling activation. Moreover, given the well-documented antiproliferative effect of vitamin D, we hypothesized that the significant reduction in lung size and branching could be explained by this event. EdU proliferation assay confirmed the presence of high proliferation levels in sites of active branching, distal and proximal lung, but further analysis demonstrated a significant reduction in proliferation levels in all Vitamin D-treated explants. This study unveils, for the first time, the potential role of vitamin D signaling in the early stages of chick pulmonary branching and contributes to better understand the intricate molecular events that ultimately regulate this complex process. Our results highlight the importance of regulating vitamin D levels during normal lung development and reinforce the need to establish appropriate doses and intervention windows to ensure an appropriate physiological response during embryonic development., A elevada prevalência de deficiência de Vitamina D é considerada um problema de saúde pública, que afeta indivíduos de todas as idades em todo o mundo, principalmente mulheres grávidas e crianças. Existem evidências que apontam para uma associação entre a deficiência materna de Vitamina D e várias consequências adversas na saúde materno-fetal. No que diz respeito ao desenvolvimento pulmonar, sabe-se que a Vitamina D é crucial para os processos de maturação pulmonar, que ocorrem nos estadios finais do desenvolvimento, e que influencia a saúde respiratória da descendência. No entanto, pouco se sabe sobre seu papel nos estadios iniciais de ramificação, e nada se sabe sobre o seu papel no desenvolvimento pulmonar de galinha. Nesse sentido, este projeto tem como objetivo desvendar o papel da Vitamina D no desenvolvimento inicial do pulmão, utilizando o embrião de galinha como modelo. O presente trabalho caracteriza, pela primeira vez, o padrão de expressão de membros da via de sinalização da Vitamina D (rxr-α, rxr-y, vdr, cyp24a1 e pdia3) por hibridização in situ no pulmão embrionário de galinha. A semelhança entre os padrões e os níveis de expressão destes genes com o mamífero sugere um papel idêntico, e porventura menos relevante, nestes estadios. Além disso, com o objetivo de elucidar o papel da vitamina D na ramificação, utilizaram-se explantes pulmonares in vitro suplementados com Vitamina D. Os estudos revelaram que a Vitamina D induziu uma redução significativa no tamanho e ramificação pulmonar, independentemente da dose. O aumento da expressão de cyp24a1, o principal componente regulador da via, em explantes tratados com Vitamina D confirmou a ativação desta via. Por outro lado, avaliámos se a redução do tamanho e da ramificação do pulmão poderia ser explicada pelo efeito anti proliferativo, já conhecido, da vitamina D. O ensaio de proliferação confirmou a presença proliferação ativa em locais de ramificação, no pulmão distal e proximal; no entanto, a análise quantitativa demonstrou uma redução significativa dos níveis de proliferação nos explantes tratados com Vitamina D. Este estudo revela, pela primeira vez, o potencial papel da sinalização da Vitamina D nos estadios iniciais da ramificação pulmonar e contribui para a melhor compreensão dos eventos moleculares envolvidos na regulação desse processo. Os nossos resultados destacam a importância da regulação dos níveis de Vitamina D durante o desenvolvimento pulmonar normal e reforçam a necessidade de estabelecer doses e intervenções adequadas para garantir uma resposta fisiológica apropriada durante o desenvolvimento., The work presented in this thesis was performed in the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), University of Minho. Financial support was provided by ICVS Scientific Microscopy Platform, member of the national infrastructure PPBI - Portuguese Platform of Bioimaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER 022122); by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT) - project UIDB/50026/2020 and UIDP/50026/2020.