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Fil: Minen, Romina Inés. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Este trabajo de Tesis se centra en el estudio de las enzimas que intervienen en el metabolismo del manitol en plantas de apio (Apium graveolens) y de la rafinosa en plantas de Brachypodium distachyon. Se caracterizaron cinética y estructuralmente la manosa-6-fosfato reductasa y la manitol deshidrogenasa, enzimas clave para la síntesis y degradación del manitol, respectivamente, y la UDP-azúcar pirofosforilasa, la galactinol sintasa y la rafinosa sintasa, enzimas involucradas en la síntesis de rafinosa. La combinación de información estructural con datos bioquímicos permitió establecer relaciones estructura-función, en el contexto de los escenarios evolutivos y metabólicos en los que participan las enzimas estudiadas. Además, se obtuvieron nuevas versiones de dichas enzimas con especificidad alterada por el sustrato o el cofactor, lo que permite ampliar el espectro de reacciones que catalizan y los productos finales que se obtienen de ellas. Por lo tanto, las enzimas mutantes así generadas podrían ser empleadas para el agregado de valor, recuperación y aprovechamiento de sub-productos industriales mediante procesos biotecnológicos. Además, se crecieron plantas de apio bajo diferentes fotoperiodos (largo, normal y corto) y a baja temperatura, para estudiar el efecto de las condiciones ambientales sobre la partición del carbono en plantas de apio. De esta forma, logramos obtener un panorama más completo sobre la regulación de las diferentes rutas metabólicas involucradas en la utilización del carbono en plantas de apio y B. distachyon. This Thesis work focuses on the study of enzymes involved in mannitol and raffinose metabolism in celery (Apium graveolens) and Brachypodium distachyon, respectively. Mannose-6-phosphate reductase and mannitol dehydrogenase, key enzymes for the synthesis and degradation of mannitol, respectively, and UDP-sugar pyrophosphorylase, galactinol synthase and raffinose synthase, enzymes involved in the synthesis of raffinose, were kinetically and structurally characterized. The combination of structural information with biochemical data led to the establishment of structure-function relationships, in the context of the evolutionary and metabolic scenarios in which the studied enzymes participate. In addition, new versions of these enzymes with altered specificity for the substrate or the cofactor were obtained, to broaden the spectrum of catalyzed reactions and their final products. The generated mutant enzymes could be used to increase the value and recovery of industrial by-products through biotechnological processes. Additionally, celery plants were grown under different photoperiods (long, normal, and short) and temperatures, to study the effect of environmental conditions on carbon partition in celery plants. These studies allowed us to obtain a better picture of the regulation of the different metabolic pathways involved in carbon utilization in celery and B. distachyon plants. Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas National Science Foundation Agencia Santafesina de Ciencia, Tecnología e Innovación

La adquisición de tolerancia a la desecación en semillas ortodoxas es una estrategia adaptativa que no presentan las semillas del tipo recalcitrantes y por consiguiente son sensibles a la desecación. El grado de tolerancia o sensibilidad a la desecación se ve afectada por varios aspectos de origen genético, fisiológico, bioquímico y anatómico; por consiguiente existen diferencias entre genotipos y entre individuos dentro del genotipo de la misma especie. En este estudio se documentaron características de anatomía de las semillas de cacao, se midió el grado de tolerancia a la desecación y la acumulación de azúcares en relación con tolerancia a la desecación en poblaciones de tres orígenes genéticos de cacao (Theobroma cacao L.). Se emplearon los genotipos UF667 y UF668 de origen Trinitario, EET 48 y Pound 7 de origen Forastero y Carmelo de origen Criollo. El trabajo consistió de tres fases: 1) Documentación de anatomía de desarrollo de la semilla. Se usaron flores y frutos en desarrollo del genotipo Carmelo obteniendo cortes seriados (10 a 15 µm) para ser teñidos con safranina y verde fijo. En semilla madura se realizaron tinciones para observar lípidos, proteínas, almidón y taninos. 2) Tolerancia a la desecación. Se cosecharon semillas a los 5, 6 y 7 meses después de floración (mdf) de los cinco genotipos, en las que se midió largo, ancho, espesor y contenido de humedad; parte de la muestra se sometió a secado bajo condiciones de laboratorio hasta 300, 200 y 150 g H2O·kg-1 pf, manteniendo como testigo semilla con contenido de agua al momento de cosecha (>500 g H2O·kg-1 pf); en estas se midió germinación y viabilidad celular por medio del conteos de núcleos visibles en cortes del eje embrionario. 3) Cuantificación de azúcares y su relación con la tolerancia a la desecación. Se utilizaron únicamente muestras de los genotipos UF668, Pound 7 y Carmelo, con contenidos de humedad al momento de cosecha y a 300 g H2O·kg-1 pf y como referencia se utilizó semillas de maíz (ortodoxa) a 300 g H2O·kg-1 pf, la cuantificación de carbohidratos fue por HPLC. Los resultados indican que la semilla de cacao proviene de un óvulo anátropo crasinucelar, el embrión presenta crecimiento lento inicial, el endospermo tiene un desarrollo nuclear hasta que la semilla alcanza el tamaño final, los cotiledones se encuentran fuertemente plegados sobre el eje embrionario y la cubierta seminal presenta células de lumen grande y paredes delgadas y células largas de paredes delgadas en la parte exterior de la testa, característica que se relaciona con hidrocoria y mixospermia. Los cinco genotipos difieren en tolerancia a la desecación a 300 g H2O·kg-1 pf, nivel en que UF668 y EET 48 mantienen germinación superior a 50 %, mientras que Carmelo presenta 0 %; sin embargo, ningún genotipo toleró secado a 200 y 150 g H2O·kg-1 pf; la máxima viabilidad celular se obtuvo en los genotipos más tolerantes al secado. Las concentraciones de oligosacáridos mostraron diferencias entre materiales, fechas de cosecha, secado y tejido; sin embargo, la mayor relación de rafinosaa:sucrose en todos los factores coincidió con los porcentajes de germinación más altos. Por lo anterior se concluye que las semillas de cacao presentan características anatómicas distintivas de especies recalcitrantes. Existen diferencias entre genotipos al grado de desecación a 300 g H2O·kg-1 pf pero a 200 g H2O·kg-1 la muerte es inminente. Las acumulaciones de oligosacáridos y las proporciones de estos no son suficientes para tolerar reducciones de humedad de 200 g H2O·kg-1._____Acquisition of desiccation tolerance in orthodox seed is an adaptive strategy that is absent in recalcitrant seeds and consequently they are desiccation sensitive. The degree of tolerance or sensitivity to desiccation depends upon genetic, physiological, biochemical and anatomical feature, leading to the differences in desiccation tolerance among genotypes and individuals within the genotype from the same species. In this study, some anatomical traits of cocoa seeds were documented and the degree of desiccation tolerance as well as its relationship with sugar accumulation was determined in populations of three genetic origins of cocoa seed (Theobroma cacao L). UF667 and UF668 genotypes from “Trinitario” origin, 48 EET and Pound 7 from “Forastero” origin and Carmelo from Landrace origin were used. The study had three phases: (1) Documentation of seed anatomy. Carmelo genotype was used, from which tissue samples from flowering to mature seed were obtained. Cuts of 10 to 15 µm were used to observe changes of seed anatomy during its development; in addition, in mature seed tissue-staining was made to observe lipids, proteins, starch and tannins. 2) Determination of desiccation tolerance. Seed samples from the five genotypes were harvested at 5, 6, and 7 months after flowering, in which seed length, width, thickness and moisture content were measured; a seed sample was subjected to drying under laboratory conditions until seed moisture reach 300, 200 and 150 g H2O·kg-1 fw, maintaining as a negative control seed with harvested moisture content (>500 g H2O·kg-1 fw); in these treatments germination and cellular viability (counting visible nuclei in embryonic axis cuts) were quantified. 3) Sugar accumulation and its relationship with desiccation tolerance. Seed samples of UF668, Pound 7 and Carmelo were used; all of them at harvested moisture content and at 300 g H2O·kg-1 fw; in addition, maize seed (ortodox) at 300 g H2O·kg-1 fw was used as a reference; carbohydrate quantification was measured with an HPLC analyzer. The results indicate that cacao seed comes from a crasinucellar anatropous ovule, that the development of the embryo is slow and resides submerged in a liquid gelatinous endosperm until the seed reaches the average size (2.5 cm); cotyledons are strongly folded on the embryonic axis and the seed coat is thin with the presence of cells containing a big lumen and thin walls, and elongated cells of thin walls can be observed in the outer layer of the seed coat which is related to hidrocoria and mixospermia. The five genotypes differed in desiccation tolerance at 300 g H2O·kg-1 fw, point at which UF668 and EET 48 retained their germination above 50 % whereas the germination of Carmelo reached 0%; however, none of the genotypes tolerate desiccation below 200 g H2O·kg-1 fw; the highest values of cellular viability were obtained in those genotypes less sensitive to desiccation. Oligosaccharide concentrations showed differences among genotypes, harvests, drying and tissue; nevertheless, the highest relation raffinose:sucrose for all these factors was related with the highest germination values. It is concluded that cocoa seed showed anatomical traits distinctive of recalcitrant species. There are differences among genotypes at 300 g H2O·kg-1 fw, but none of them survive at 200 g H2O·kg-1 fw. Oligosaccharide accumulation and their proportions are insufficient to tolerate dehydration at 200 g H2O·kg-1 fw.